一、细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响（论文文献综述）
孔晨帆[1]（2021）在《ALD中HSC来源外泌体转运Let-7b-5p促肝细胞凋亡与调肝理脾方的保护作用研究》文中指出目的:酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是由于长期过量摄入酒精所导致的一种病程漫长、且发病机制复杂的肝病。在我国,ALD发病率与死亡率正以惊人的速度上升,已成为我国最主要的慢性肝病之一。ALD发病机制未被完全阐明,但肝细胞、肝星状细胞等多种细胞已被证实参与其中,肝细胞的凋亡坏死、肝星状细胞的激活转分化贯穿ALD全程。已有大量研究发现肝内的细胞通讯与多种肝病进展关系密切,其中外泌体通过miRNA传递信息在ADL、肝纤维化等疾病中扮演了重要角色。外泌体是一种直径为30-150nm的胞外囊泡,可搭载包括微小RNA（miRNA）在内的多种小分子物质,充当细胞间信息传递的媒介,发挥重要的生物学功能。已有研究证实,肝细胞、肝星状细胞外泌体可以转运至肝内临近细胞,加重肝损伤。前期研究中发现,ALD模型中活化的肝星状细胞来源外泌体可诱导肝细胞凋亡,中药调肝理脾方对ALD具有显着的保护作用,但肝星状细胞来源外泌体诱导肝细胞凋亡以及调肝理脾方保护ALD的具体机制尚不明确。本研究旨在探讨ALD中肝星状细胞外泌体转运的miRNA对肝细胞的作用机制,从肝内细胞通讯的角度探究ALD发生发展中与调肝理脾方治疗ALD的分子机制。方法:（1）ALD中肝星状细胞促进肝细胞凋亡。1)HSC的ALD模型构建。采用不同浓度的乙醛刺激HSC48h,利用细胞增殖试剂盒（CCK-8）测定细胞存活率,Western Blot（WB）测定HSC细胞平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）、胶原1（Col1）与纤连蛋白（FN）的表达水平,以评价模型。2)活化HSC与肝细胞的共培养实验。Transwell共培养（活化/静止）HSC与肝细胞,流式细胞术检测肝细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR（qPCR）与WB法检测肝细胞凋亡相关分子Caspase3、Bax与Bcl-2表达水平,验证活化HSC对肝细胞凋亡的作用。（2）活化HSC外泌体miRNA差异表达谱与下游靶基因的筛选。1)用无外泌体培养基/含乙醛的无外泌体培养基分别处理HSC,收集细胞上清液并用超速离心法收集上清液中外泌体。使用电镜、WB、粒径分析的方法对HSC外泌体（HSC-exo）进行鉴定。2)提取静止/活化HSC-exo,利用RNA-seq分析外泌体差异miRNA。|log2（FC）|>2为标准筛选HSC来源外泌体中的差异表达miRNA。TargetScan软件预测HSC来源外泌体差异表达Let-7b-5p的下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证Let-7b-5p与靶基因mRNA互补结合。（3）活化HSC外泌体运转Let-7b-5p促进肝细胞凋亡。1)HSC-exo用PKH26染色后,与肝细胞共同孵育4h,使用荧光显微镜观察拍摄肝细胞摄取HSC-exo。将肝细胞与活化/静止组HSC-exo共同孵育,采用流式细胞术检测肝细胞凋亡,实时定量PCR方法检测肝细胞内 Let-7b-5p,EZH2、Bax、Bcl-2 mRNA水平水平,WB的方法测定肝细胞EZH2、Bax、Bcl-2表达水平,验证活化组HSC-exo对肝细胞凋亡的作用。2)肝星状细胞内转染Let-7b-5p mimics、Let-7b-5p mimic-NC。qPCR方法检测肝星状细胞外泌体内Let-7b-5p;将Let-7b-5p mimic修饰的肝星状细胞外泌体与肝细胞共培养,采用流式细胞术检测肝细胞凋亡水平,qPCR方法检测肝细胞内Let-7b-5p,EZH2、Bax、Bcl-2 mRNA水平水平,WB方法检测EZH2、Bax、Bcl-2的表达水平。（4）调肝理脾颗粒对Let-7b-5p介导的肝细胞凋亡保护作用研究。1)采用不同浓度的调肝理脾方颗粒水溶液处理肝细胞48h小时,采用CCK-8法确定调肝理脾颗粒处理的最佳浓度。2)设立肝细胞NC组,Let-7b-5p过表达组组与中药保护组。中药保护组首先采用调肝理脾方水溶液预防性给药48h,48h后NC组转染Let-7b-5p mimic-NC,Let-7b-5p过表达组与中药保护组组转染Let-7b-5p mimic。使用流式细胞术检测NC组、Let-7b-5p过表达组与中药保护组的凋亡水平,qPCR检测Let-7b-5p,EZH2、Bax、Bcl-2 mRNA 水平,Western Blot 方法检测 EZH2、Bax、Bcl-2 的表达水平。结果:（1）用300μM乙醛刺激HSC 48小时后,HSC的存活率最高,为正常组的1.15倍。WB结果显示,α-SMA、Col1与FN表达水平较正常HSC显着上调,HSC造模成功。（2）流式结果显示:肝细胞与乙醛活化的HSCTranswell共培养后,肝细胞凋亡率显着提高;qPCR与WB结果显示肝细胞Caspase3、Bax mRNA与蛋白表达上调,Bcl-2 mRNA与蛋白表达量下调。（3）透射电镜、WB与粒径分析结果显示,细胞上清液超速离心提取物为外泌体。RNA-seq结果显示,与正常组相比,乙醛活化组HSC-exo中Let-7b-5p表达量上调。TargetSacn预测Let-7b-5p可与Zeste增强子同源物2（EZH2）基因的mRNA 3’非编码（UTR）区靶向结合,双荧光素酶报告基因实验结果Let-7b-5p可与EZH2基因的mRNA 3’UTR区靶向结合并抑制其表达。（4）荧光显微镜结果显示肝细胞可内吞以PKH26标记的HSC-exo,荧光标记定位位于肝细胞膜。qPCR与WB结果显示活化组HSC-exo与肝细胞共培养可显着下调肝细胞内靶基因EZH2表达量,并降低肝细胞存活率,使肝细胞凋亡率升高。转染Let-7b-5p mimics后,qPCR结果显示HSC及其外泌体中Let-7b-5p表达量上调,qPCR与WB结果显示与Let-7b-5p修饰的外泌体（mimic-exo,即过表达Let-7b-5p的HSC外泌体）共培养可使肝细胞内EZH2、Bcl-2表达量下调,Bax表达量上调,同时肝细胞凋亡率明显升高。（5）与NC组相比,Let-7b-5p过表达组Let-7b-5p、Bax表达量显着上调,EZH2、Bcl-2表达量显着下调,肝细胞凋亡率明显升高。而中药保护组相较于Let-7b-5p过表达组,肝细胞Let-7b-5p、Bax表达量显着下调,EZH2、Bcl-2表达量显着上调,肝细胞凋亡率明显下降。结论:ALD中活化的肝星状细胞外泌体与肝细胞凋亡有关,活化的肝星状细胞可以通过外泌体运转Let-7b-5p至肝细胞,调控肝细胞内靶基因EZH2表达,促进肝细胞凋亡。中药调肝理脾方可通过下调肝细胞Let-7b-5p从而减少肝细胞凋亡。
周怡驰[2]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中提出中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
宋健[3]（2021）在《基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究》文中提出目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝病的常见病理基础,并且是慢性肝病发展为肝硬化的必要阶段。肝纤维化的主要特征是激活肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）介导细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积。并且慢性肝脏炎症也会加速肝纤维化的进程。人参皂苷活性成分是人参中主要的活性物质,其药理作用与能量代谢和调控炎症反应有关。人参皂苷具有肝保护、抗氧化、抗炎等广谱的药理活性。核受体肝X受体（liver X receptor,LXRs）与法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）作为调节能量代谢的重要途径,在调控肝纤维化和炎症中发挥重要作用。本课题是基于核受体LXRs与FXR探讨人参皂苷25-OCH3-原人参二醇（25-OCH3-PPD）及20S-原人参三醇（M4）调控肝纤维化的作用与机制研究。方法:1.人参皂苷25-OCH3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠分为六组:正常组、TAA组、TAA+25-OCH3-PPD（5、10、20 mg/kg）给药组和TAA+Silymarin（100 mg/kg）组。25-OCH3-PPD与Silymarin组小鼠通过灌胃的方式给药。除正常组外,其他各组小鼠均通过腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200mg/kg,每周两次）。相关指标的测定:采用H&E染色、Sirius Red染色、Masson染色法检测组织病理学变化。检测血清中ALT、AST变化水平。TUNEL染色法检测25-OCH3-PPD对肝细胞凋亡的影响。在TAA诱导的肝纤维化中,通过蛋白印记、RT-PCR、免疫组织化学染色以及组织荧光染色实验检测细胞外基质、炎症因子、SIRT1、FXR、LXRα、LXRβ、P2X7r和NLRP3等蛋白或m RNA的表达情况。分析了与TAA诱导的凋亡途径相关的几个分子蛋白的表达,包括caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、c FILP。（2）体外实验:选用HSC-T6细胞,TGF-β刺激2 h,然后用25-OCH3-PPD（1、5或10μM）或caspase-1抑制剂I培养6 h。这些细胞被收集,分别做Western blotting以及免疫荧光实验,检测HSC-T6细胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3、LXRβ、LXRα、caspase-1、IL-1β等蛋白的表达水平;并通过免疫荧光染色做进一步验证。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究中:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠随机分成4组:正常组、TAA组、TAA+M4-10组、TAA+M4-20组。小鼠每天采用M4（10和20 mg/kg）或等量生理盐水灌胃处理。除正常组小鼠外,小鼠腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200 mg/kg,每周两次）,以建立小鼠肝纤维化模型。相关指标的测定:采用H&E染色法检测组织病理学变化。提取总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测α-SMA、Collagen I、TIMP-1、MMP-13、FXR、P2X7r、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及免疫荧光染色做进一步验证。（2）HSC-T6细胞体外实验:HSC-T6细胞被TGF-β刺激2 h后,再用浓度为10、20μM的M4或guggulsterone（50μM）或GW4064（2μM）处理4 h。提取细胞总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测HSCs细胞中α-SMA、FXR、P2X7r、caspase-1等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及FXR与P2X7r免疫荧光染色做进一步验证。（3）Hep G2细胞质粒转染（sh RNA-FXR）:对Hep G2细胞给予FXR特异性si RNA转染48 h,然后给予TGF-β培养2 h,再用M4孵育细胞4 h。利用RT-PCR、Westeron blot,以及免疫荧光法检测FXR、α-SMA和P2X7r的表达变化以及IL-1β蛋白表达情况。结果:1.人参皂苷25-OCH3-PPD通过促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的研究:（1）TAA诱导肝纤维化小鼠模型:TAA组小鼠血清ALT、AST水平升高,肝组织发生损伤并有大量胶原沉积;而25-OCH3-PPD可以降低血清中ALT、AST水平;改善TAA诱导小鼠肝脏组织的病理变化以及肝组织中胶原沉积情况;25-OCH3-PPD可以改善肝组织中纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13;降低促炎细胞因子表达水平,包括降低caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;改善肝组织中肝细胞凋亡情况,调控了caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、FILP凋亡途径相关分子蛋白的表达;并抑制P2X7r-NLRP3炎症小体的活化进;抑制PI3K/Akt磷酸化,活化LKB1/AMPK-SIRT1信号通路;25-OCH3-PPD还能改善由TAA诱导的LXRs和FXR的活性降低。（2）体外实验中,25-OCH3-PPD减弱HSC-T6细胞中促纤维化标志物α-SMA的转录活性;25-OCH3-PPD可以通过调控LXRs和P2X7r-NLRP3、P-PI3K/P-Akt的表达降低,抑制肝星状细胞的活化;并且在肝星状细胞中抑制了caspase-1、IL-1β、IL-18的表达,与caspase-1抑制剂I效果一致。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究:（1）在TAA诱导的小鼠肝纤维化中,M4可减轻组织病理学改变,改善肝损伤;M4可以调节肝组织中肝纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13的表达;并降低肝组织中促炎细胞因子表达水平,包括降低F4/80、caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;蛋白印记、RT-PCR、组织免疫荧光实验表明,M4显着增加FXR的蛋白和m RNA的表达;M4也抑制了和P2X7r、NLRP3的表达,对P2X7r-NLRP3信号通路具有调控作用。（2）HSC-T6细胞体外实验中,TGF-β刺激后肝星状细胞被活化;给予M4可抑制HSC-T6中细胞外基质（ECM）的沉积包括α-SMA、Collagen-I、TIMP-1的表达,升高MMP-13的表达;以及降低caspase-1、IL-1β、IL-1R1和IL-6等炎症因子的表达水平;M4显着增加了FXR的表达,抑制了P2X7r-NLRP3信号通路,并作为FXR激动剂GW4064发挥作用;M4与GW4064激活FXR,抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1、IL-1β、IL-1R1的表达;（3）并且对Hep G2细胞转染FXR,建立sh RNA-FXR,实现了Hep G2细胞低表达FXR;但给予M4后FXR被激活,活化FXR后进而抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1的表达。结论:人参皂苷25-OCH3-PPD与M4可改善TAA诱导小鼠和活化HSCs中纤维化形成及炎症。25-OCH3-PPD可能激活LXRs,以改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体。并且25-OCH3-PPD可以通过调控LKB1-AMPK信号通路以及激活SIRT1调节TAA诱导的肝纤维化和肝脏炎症。M4改善了TAA诱导的肝纤维化,其调控肝纤维化机制可能通过激活FXR介导P2X7r-NLRP3炎症信号通路。因此,25-OCH3-PPD和M4可能是一种有效的抗肝纤维化和抗肝脏炎症活性物质。
蒋云霞[4]（2021）在《荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究》文中进行了进一步梳理目的:以大鼠肝星状细胞T6细胞株（HSC-T6）为受试对象,探讨并完善荔枝核总黄酮（total flavonoids from Litchi Seed,TFL）拮抗肝纤维化的作用靶点与作用机制。方法:常规培养HSC-T6,分别观察TFL在不同时间和不同浓度对HSC生长增殖率的影响,从中选择最佳的TFL药物浓度进行后续实验;将HSC-T6分为细胞对照组和TFL实验组,细胞对照组的HSC-T6常规培养,TFL实验组采用上述最佳的TFL药物浓度干预HSC-T6,分别使用透射电子显微镜和ELISA方法检测各组HSC-T6的超微结构和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）含量的变化。制备肝纤维化模型大鼠,在大鼠腹部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混悬液0.3 ml/100 g,2次/周,共8周。造模完成后,行肝组织病理染色检测,证实造模成功。将肝纤维化造模完成的大鼠分为模型对照组和TFL实验组,模型对照组大鼠在肝纤维化造模完成后常规饲养,TFL实验组大鼠予灌胃TFL 100 mg/（kg·d）,4周后收集模型对照组和TFL实验组的大鼠血清。检测各组血清对HSC-T6的最大无毒浓度,以最大无毒浓度为最佳诱导剂量孵育HSC-T6,诱导分化14天后提取全蛋白,通过DDA/DIA技术筛选出模型对照组和TFL实验组血清干预后的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO、KOG、PPI、PATHWAY和亚细胞定位等生物信息学分析。结果:1.透射电镜结果显示TFL干预后HSC-T6的超微结构发生变化,细胞间隙变大,胞膜四周纤毛脱落,多角伪足减少,膜表面不平整,细胞浆内线粒体明显变形,线粒体嵴断裂或消失,粗面内质网扁池扩张,核糖体脱落,核内染色质浓缩或边聚,核膜皱缩,可见凋亡小体形成。2.ELISA 结果显示,TFL 干预后 HSC-T6 的 MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量下降。3.生物信息学分析结果显示,模型对照组和TFL实验组的差异蛋白共177个,其中上调蛋白84个,下调蛋白93个。GO分析显示,差异蛋白参与分子功能共10个条目,主要为分子结合和催化活性;细胞组分共18个条目,主要为细胞质和细胞器;生物过程共24个条目,主要为细胞过程、代谢过程、生物调节等。4.KOG注释分析显示,差异蛋白比对到KOG数据库共有23个子类和192条蛋白注释信息,其中细胞过程和信号传递是获得注释信息最多的分类,其次为信息存储与处理、新陈代谢作用和缺乏注释的蛋白等。5.PPI分析结果显示,存在互作关系的上调蛋白28个:SELENOH、C1QC、C1QB、APOE、ANGPTL4、NF1、GPX3、CLU、DMAP1、VTN、MYH14、SELENOM、HRG、PF4、HMOX1、IGH1A、IGG2A、IGHG、PGK2、PLIN2、KDM4C、ITIH4、BAZ2A、C9、ADH7、MGST1、GSTA1、ATP9B等。存在互作关系的下调蛋白42个:RAD51、HELZ2、PBK/TOPK、HMGCS1、UBE2T、UBE2C、DLGAP5、LOC100911660、PTEN、BLM、CYP51A1、MDC1、LRRK1、MVD、NSDHL、IDI1、SPC24、CDCA8、KNSTRN、CCNB2、FAM83D、HMGXB4、STARD4、HLTF、LIPG、UHRF1、KAT8、PCSK9、UBE2S、AMMECR1L、WDR76、ZNRD2、DDX10、MAP3K3、PIMREG、SMAD1、MCL1、MPRIP、FIGNL1、RPAP1、STMN1、SPP1 等。6.PATHWAY富集分析结果显示,KEGG代谢通路分为6个分支,共注释38项条目,分支包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统等,其中差异蛋白占比前三的分支为人类疾病、新陈代谢和有机系统。代谢通路主要包括原发性免疫缺陷、金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、系统性红斑狼疮、哮喘产生IgA的肠道免疫网络、免疫系统、萜类骨架的生物合成、自身免疫性甲状腺疾病、同种异体移植排斥、范可尼贫血途径、造血细胞谱系、非洲锥虫病、胆固醇代谢、类风湿关节炎、矿物质吸收、细胞色素P450对异生物的代谢、病毒性心肌炎、利什曼病、阿米巴病、癌症中的转录失调、扩张型心肌病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、FcεRI信号通路、B细胞受体信号通路、磷脂酶D信号通路、NF-κB信号通路、酮体的合成与降解、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌、药物代谢-细胞色素P450等。7.亚细胞定位结果发现这些差异蛋白主要位于细胞核、细胞质或细胞外,其余则较平均散布于胞质内膜、线粒体、过氧化物酶体、内质网、胞质网丝以及细胞骨架上。结论:1.荔枝核总黄酮（TFL）可下调HSC-T6的MMP-2、ColⅠ和ColⅢ的表达水平,对HSC-T6的生长增殖具有抑制作用。2.本实验基于DDA/DIA模式并通过GO、KOG、PPI、PATHWAY以及亚细胞定位等生物信息学技术分析后发现C1QC、C1QB、C9、SELENOH、SELENOM、GPX3、APOE、CLU、ANGPTL4、NF1、HRG、PF4、ITIH4、ADH7、RAD51、BLM、FIGNL1、MDC1、SPC24、KNSTRN、CDCA8、HELZ2、HMGCS1、MVD、IDI1、CYP51A1、NSDHL、LIPG、PBK/TOPK、FAM83D、DLGAP5、UBE2T、UBE2C、UBE2S、UHRF1、MAP3K3、LRRK1、SMAD、、MCL、等差异蛋白与肝纤维化疾病具有密切相关性;PI3K/Akt通路、NF-κB信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、细胞色素P450可能是TFL抑制HSC-T6生长增殖并诱导HSC-T6死亡的主要信号转导途径。3.TFL可能通过调控多个蛋白和参与多种信号传导通路抑制ECM的形成和诱导HSC-T6死亡,发挥拮抗肝纤维化的生物学效应。
谢海深[5]（2021）在《七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化》文中研究表明目的 肝炎-肝硬化-肝癌的连续发展过程为肝癌发展的一般规律,被称为肝癌发展的三部曲。我国作为最大的发展中国家是肝炎感染大国,也是肝癌患者高发国家,当前全世界对于肝癌的治疗方法包括手术切除肿瘤病灶、经B超引导的射频或微波消融术、放射治疗、化学药物治疗和肝脏活体器官移植等,但是治疗效果有限。肝硬化为肝癌发展的重要中间过程,早期干预阻断此过程可大大降低患者发展为肝癌的可能性。肝硬化的发展是一个漫长的连续过程,肝纤维化是肝硬化发展的早期可逆阶段。肝纤维化的主要特征为肝星状细胞激活转分化为肌成纤维细胞,分泌大量的包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA和纤维连接蛋白等在内的细胞外基质组分,不断沉积在肝小叶间的汇管区。七叶皂苷钠是从传统中药娑罗子中提取的主要成分,已知的功效包括抗炎、消肿、扩张血管和改善微循环等,前期实验证明七叶皂苷钠对原发性肝癌具有明显抑制作用,本研究主要探究七叶皂苷钠对肝纤维化发展的影响作用及机制。方法 本研究主要通过体外和体内实验验证七叶皂苷钠对于肝纤维化发展的影响作用。体内实验将雄性大鼠分为空白对照组、CCl4诱导的模型组和在CCl4诱导的基础上给予七叶皂苷钠处理的治疗组三组。对照组大鼠予以橄榄油腹腔注射处理,模型组和治疗组均通过腹腔注射四氯化碳液诱导实验大鼠肝脏进展为肝纤维化,此处理贯穿于整个8周实验过程。从实验的第3周开始,对治疗组给予适量七叶皂苷钠进行腹腔注射,对照组以及模型组给予腹腔注射等量的医用生理盐水。第8周末时开腹取大鼠肝脏组织,通过免疫组化、HE以及Masson染色检测对照组、模型组和治疗组三组大鼠肝脏纤维化发展程度以及组织中胶原蛋白的表达情况。在体外细胞试验中,通过MTT、克隆形成实验检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞的生长增殖活性,通过流式细胞学检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞凋亡程度,通过免疫蛋白印迹检测七叶皂苷钠对HSC-T6细胞内eIF4F复合物以及PI3K/AKT/mTOR通路中各蛋白表达影响情况。结果 CCl4诱导大鼠肝纤维化形成明显,HE、Masson及免疫组化染色结果显示,七叶皂苷钠处理使大鼠肝脏细胞外基质中的α-SMA,COL-I和COL-III含量较四氯化碳诱导肝纤维化的模型组明显下降。MTT检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞增殖活性显着降低;克隆形成实验显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞的细胞集落形成数明显减少;流式细胞学检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞凋亡数量增加,以早期凋亡数量增加最为明显;免疫蛋白印迹表明,七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ等胶原蛋白的表达。七叶皂苷钠处理的大鼠肝组织免疫组化染色和HSC-T6细胞免疫蛋白印迹结果均显示e IF4G,e IF4E蛋白的表达量降低。七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信号通路中各蛋白质的表达水平,降低4EBP1磷酸化水平。结论 七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物的合成进而缓解大鼠肝纤维化的进展。
帅陈[6]（2021）在《CD39介导的ATP-腺苷信号通路在酒精性肝病中的作用研究》文中提出背景:长期过量饮酒情况下,可使肝脏出现一系列损伤,从简单的轻微脂肪变性、酒精性肝炎到酒精性肝纤维化,最后到严重急性肝硬化或肝衰竭,统称为酒精性肝病（ALD）。其中,肝纤维化已被证明在酒精性肝病的过程中发挥关键作用。ATP在ALD的发生发展过程中会大量的释放。ATP经CD39、CD73等水解酶的双重水解作用下生成腺苷,在多种疾病的生理和病理过程中起到调控作用。CD39与多种生理和病理过程如细胞增殖和分化过程有关,但这种功能在酒精性肝病中大多未得到证实。因此,我们研究CD39是否可作为酒精性肝纤维化的治疗靶点以及CD39介导的ATP腺苷信号通路是否可调控HSCs的活化。方法:本研究在C57BL/6小鼠体内建立酒精饲料喂养加腹腔注射四氯化碳（CCl4）诱导酒精性肝纤维化模型,于第5周至第8周腹腔注射CD39抑制剂聚氧钨酸钠（POM1）和秋水仙碱;肝脏原位灌流提取小鼠原代肝星状细胞。酶标仪比色法检测血清学指标ALT、AST、LN和HA;HE染色法观察肝脏损伤情况;Masson染色法观察组织胶原的沉积;免疫组化染色法和免疫荧光染色法检测肝脏组织中α-SMA的表达;Western blot和RT-q PCR检测CD39、α-SMA、TGF-β,Collagen I和Collagen III的表达。采用200μM乙醛刺激大鼠肝星状细胞、人肝星状细胞和原代小鼠肝星状细胞48h在体外建立酒精性肝纤维化模型;在200μM乙醛刺激大鼠肝星状细胞中依次加入POM1（48h）和外源性ATP（24h）。转染组HSC-T6细胞用Lipofiter 3.0TM转染Si-RNA 6h后,将Opti-MEM改为新鲜的DMEM（含5%胎牛血清）,加入200μM乙醛刺激大鼠肝星状细胞48h。ATP检测试剂盒检测上清液中ATP含量。Western blot和RT-q PCR检测CD39、CD73、α-SMA、TGF-β、Collagen I、Collagen III、腺苷A2A受体、腺苷A2B受体和Smad3的表达。细胞周期试剂盒检测HSC-T6细胞周期变化;免疫荧光染色检测CD39和α-SMA的表达。结果:体内试验中,模型组的血清学指标ALT、AST、LN和HA要比对照组显着增高,肝细胞索紊乱,汇管区与血管区炎细胞浸润,数量增多并且伴有大量的脂肪空泡出现,胶原沉积;CD39、CD73和促纤维化因子（α-SMA、TGF-β、Collagen I、Collagen III）的表达均上调。与模型组相比,CD39的抑制剂能以剂量依赖性的方式明显改善上述的肝脏损伤以及相关蛋白的表达,其中高剂量的效果最为明显。通过Western blot和RT-q PCR分析,结果发现CD39和CD73在活化的大鼠肝星状细胞（HSC-T6）中表达上升;小鼠原代肝星状细胞和人肝星状细胞中的结果与HSC-T6结果一致。在200μM乙醛刺激大鼠肝星状细胞中依次加入外源性ATP和POM1。结果发现外源性ATP能够增加CD39和CD73的表达,促进细胞的活化,而阻断或沉默CD39可以阻止乙醛诱导的HSC-T6细胞活化以及α-SMA、TGF-β、Collagen I和Collagen III等促纤维因子的表达。此外,阻断或沉默CD39可抑制腺苷A2A受体、腺苷A2B受体和TGF-β/Smad3通路的激活。结论:（1）在小鼠和HSCs酒精性肝纤维化模型中,CD39和CD73的表达水平均较正常组明显增强;（2）在HSC-T6细胞的酒精性肝纤维化模型中,ATP可以通过激活CD39促进肝纤维化的发生;使用POM1药理性阻断CD39可以减轻HSC-T6的活化;（3）POM1药理性阻断CD39可以减轻体内酒精性肝纤维化;（4）沉默CD39可以通过减弱HSC-T6经乙醛诱导的细胞活化。（5）抑制/沉默CD39可以减弱腺苷受体A2A、A2B以及TGF-β/Smad3信号通路。
支朦朦[7]（2020）在《BET蛋白抑制剂对人和小鼠胰腺星状细胞功能的影响及机制研究》文中研究表明研究背景胰腺星状细胞（Pancreatic stellate cell,PaSC）是胰腺区域中发现的具有外分泌功能的多样细胞,PaSC激活后可转化为肌成纤维样细胞,多项研究提示活化的PaSC是病理条件下细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）蛋白的主要来源,促进胰腺纤维化。作为慢性胰腺炎重要的组织病理学特征,胰腺纤维化也是引起胰腺功能障碍的重要原因,并且和胰腺癌的发生和进展密切相关。现有研究表明胰腺纤维化的中心环节即为PaSC的激活,参与PaSC活化的因素很多,在胰腺损伤、炎症或毒性物质刺激下,腺泡细胞、巨噬细胞及血小板被激活,分泌TGF-β、TNF-α、IL-6、PDGF等因子,同时活化的PaSC以自分泌的方式释放上述因子,进一步促进PaSC活化,形成恶性循环,进一步加快纤维化的进程。大量研究探寻纤维化相关的通路和信号因子,通过这些分子和通路试图对PaSC的活化进行抑制或者逆转,以达到对纤维化进程的延缓。溴结构域超末端（Bromodomain extral terminus,BET）蛋白属于溴结构域（Bromodomain,BRD）蛋白家族,BRD2,BRD3,BRD4和 BRDT 都属于 BET 蛋白家族,其参与识别组蛋白赖氨酸乙酰化,在表观遗传调控中起到关键作用。研究表明通过下调基因c-Myc,BRD4能可以抑制肿瘤的发生和发展。Kumar等研究发现BET蛋白抑制剂JQ1可通过抑制胰腺星状细胞内BRD4,减少I型胶原的产生,同时减少胰腺癌小鼠胰腺纤维化程度及胶原的沉积,但其具体作用机制尚不明确。因此,本课题将深入探讨BET蛋白抑制剂对PaSC的影响及作用机制,为逆转胰腺纤维化寻找新方向。研究表明,在哺乳动物中,Hippo通路能够对细胞生长,细胞分化和细胞凋亡信号进行整合,并以此调控器官的发育。转录调控因子Yes相关蛋白1（Yes-associatedprotein 1,YAP）是该通路的核心。一系列激酶的激活过程都有Hippo通路的参与,而且其会在胞浆中磷酸化降解YAP,非磷酸化的YAP通过进入细胞核可激活一系列的转录因子,如TEADs、SMAD、RUNX和CTGF。近期研究显示来自于胰腺癌的胰腺组织中存在明显的YAP上调,并且参与胰腺癌的发生、发展及复发过程,在其中发挥了重要作用,同时YAP基因沉默可抑制胰腺癌细胞增殖,进而抑制旁分泌介导的PaSC的激活,减少癌旁ECM生成。此外,研究表明YAP参与调节肝星状细胞的活化,但其对PaSC的直接作用尚无人报道。因此,本课题将深入探讨YAP对PaSC的影响及作用机制,为减少胰腺癌癌旁ECM形成及逆转胰腺纤维化寻找新靶点。第一部分 BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质的影响目的:观察BET蛋白抑制剂对PaSC活化、增殖及合成细胞外基质（extracellular matrix,ECM）等生物学特性的影响,同时检测其对慢性胰腺炎小鼠胰腺纤维化的作用。方法:（1）Western blot法检测不同浓度BET蛋白抑制剂iBET151对鼠源性永生系PaSC（Immortalized pancreatic stellate cells,imPaSC）及人 PaSC（Human pancreatic stellate cells）的星状细胞标记物α-SMA、细胞外基质collagenI,fibronectin（FN）、钙黏附蛋白11（Cadherin-11,CDH11）及 MAPK/ERK 信号通路的影响。（2）MTT 法检测 iBET151 对活化imPaSC的增殖影响。（3）qPCR法检测iBET151对imPaSC活化及ECM合成相关RNA 水平的影响。（4）Western blot 检测iBET151 对转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）刺激后星状细胞标记物α-SMA、细胞外基质collagenI,fibronectin、钙黏附蛋白11（Cadherin-11,CDH11）、血小板衍生生长因子受体β（Platelet-derivedgrowth factorreceptor-β,PDGFR-β）及MAPK/ERK信号通路的影响。（5）实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,qPCR）检测 iBET151 对 TGF-β 干预后 PaSC 活化及ECM合成的作用。（6）采用24只8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象,对照组（n=6）注射等量 DMSO/（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin,JQ1 组（n=6）腹腔注射 JQ1（1inj/天,5天/周,50mg/kg）,雨蛙素组（n=6）采用反复腹腔注射雨蛙素（7inj/天,2天/周,4 周,50μg/kg）+DMSO/（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin,雨蛙素+JQ1（50mg/kg）造模组（n=6）,造模期间每周测小鼠体重。均采用HE染色及Trichrome染色评估造模是否成功;采用免疫荧光法检测CP小鼠胰腺外分泌部胰腺星状细胞PaSC的增殖（Ki67）及活化（α-SMA）情况,Trichrome染色评估胶原沉积范围;采用Western blot检测胰腺纤维化相关蛋白表达情况。结果:（1）Westernblot结果显示,不同浓度iBET151（0-2μM）及不同时间点（6h,24h,48h）刺激PaSC,iBET151可呈浓度依赖性地抑制imPaSC及hPaSC的α-SMA、collagen Ia1,FN、CDH11、p-ERK及PDGFR-β的表达。（2）MTT结果显示,与对照组相比,iBET151组的PaSC增殖能力明显降低（p<0.05）。（3）qPCR结果显示,iBET151组α-SMA及collagen Ia1基因表达明显降低,增加PaSC静止状态标志物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）的基因表达（p<0.05）,同时可明显减少白介素-6（Interleukin 6,IL-6）、人单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1）、成纤维激活蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）、肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）炎症因子及细胞因子的基因表达（p<0.05）。（4）Westerm blot结果显示5ng/ml TGF-β 可明显增加 PaSC 的 α-SMA、fibronectin、CDHl1 蛋白表达（p<0.05）,1μMiBET151可显着抑制TGF-β对PaSC的作用。（5）q-PCR结果显示,5ng/ml TGF-β可明显升高PaSC 的 α-SMA、FN、CDH11、IL-6 及 MCP-1 基因表达,1μM iBET151 可显着抑制 α-SMA、FN、CDH11、IL-6及MCP-1基因的升高。（6）小鼠体重增加由高到低依次为空白对照组,JQ1组,CP组,JQ1+CP组,JQ1腹腔注射明显抑制了小鼠体重的增加,空白对照组及JQ1组胰腺组织未见异常,CP组及JQ1+CP组胰腺组织切片H&E染色结果显示模型组存在腺泡萎缩,导管周围及腺泡间出现不同程度的纤维化,部分腺泡被导管样结构所代替,大量的炎症细胞浸润。Trichrome染色可见CP组及JQ1+CP组存在大量胶原沉积,定量结果显示两组间未见明显差异（p>0.05）。免疫荧光染色结果显示,CP组及JQ1+CP组小鼠胰腺内均存在较多α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的PaSC细胞,JQ1+CP未见明显减少。Western blot结果显示CP组及JQ1+CP组小鼠胰腺α-SMA、FN、Colla1、CDH11、PDGFR-β蛋白水平明显升高,CP组与JQ1+CP组未见明显差异。结论:BET蛋白抑制剂可抑制PaSC的增殖和合成ECM蛋白的能力,且减少PaSC分泌促炎因子、炎症因子及促细胞生长因子。同时,BET蛋白抑制剂可抑制TGF-β对PaSC活化的促进作用。第二部分 BRD2及BRD4蛋白在胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质的作用目的:在第一部分中,我们已观察到BET蛋白抑制剂能够抑制PaSC活化、增殖及ECM的合成,为了进一步阐明BRD蛋白家族在PaSC增殖和促纤维化反应中的作用,我们利用RNA干扰技术,分别干扰BRD2及BRD4后,观察其对PaSC增殖及合成ECM相关蛋白的影响。方法:（1）利用Dharmacon公司合成的siRNABRD2及siRNABRD4进行BRD2和BRD4的干扰实验,具体步骤根据RNAi产品手册进行操作。利用qPCR、Western blot检测RNAi效果。（2）分别转染BRD2及BRD4后,Westernblot法检测活化的PaSC表达 α-SMA、collagen Ia1,FN、CDH11、p-ERK、PDGFR-β 蛋白水平的变化。（3）分别转染BRD2及BRD4后,MTT法检测PaSC的增殖情况。（4）分别转染BRD2及BRD4后,qPCR检测活化的 PaSC 表达 α-SMA、collagen Ia1,FN、CDH11、MCP-1、IL-6、HGF基因水平。（5）分别转染BRD2及BRD4后,免疫荧光法检测活化的PaSC中SMA及FN的表达。（6）转染BRD2及BRD4后,Western blot检测TGF-β刺激后星状细胞标记物α-SMA、collagenI,FN、CDH11及MAPK/ERK信号通路的影响,同时q-PCR检测TGF-β干预后PaSC活化及ECM合成的作用。结果:（1）利用qPCR检测RNAi效果,结果表明,与mock组相比,干扰BRD448小时后,基因沉默效果最高,达85%,干扰BRD2 32小时后,基因沉默效果最高,达60%。同时蛋白质水平检测BRD2基因沉默效果,干扰24h后,BRD2的表达水平降低70%,可持续至48h。（2）Western blot结果显示,转染BRD2 48h后,与对照组相比,α-SMA,CDH11及PDGFR-β蛋白表达减少,FN,collagen Ia1及p-ERK未见降低;转染BRD4 48h后,与对照组相比,FN、collagen Ia1、CDH11及PDGFR-β蛋白水平降低,α-SMA及p-ERK蛋白表达未见减少。（3）MTT检测结果显示,转染BRD2 48h后,与对照组相比,PaSC增殖未见明显变化;转染BRD4 48h后,与对照组相比,PaSC增殖明显减少。（4）mRNA水平显示,转染BRD2 32h后,与对照组相比,α-SMA,CDH11及 IL-6 基因表达减少,FN,collagen Ia1、MCP-1、HGF、FAP 未见降低;转染 BRD448h后,与对照组相比,FN、collagenIa1、CDH11、HGF基因水平显着降低,α-SMA、FAP、MCP-1、IL-6基因表达未见减少。（5）IF结果显示,转染BRD2 48h后,α-SMA表达减少,FN未见减少;转染BRD4 48h后,FN表达降低,α-SMA表达未减少。结论:BRD2参与调节胰腺星状细胞标志物α-SMA的表达,BRD4蛋白参与胰腺星状细胞的增殖及细胞外基质的产生,与胰腺纤维化密切相关。第三部分 BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞YAP表达的调节作用及机制目的:观察BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞YAP表达的调节作用,同时我们利用RNA干扰技术,分别干扰BRD2及BRD4后,观察其对YAP的影响。方法:（1）Western blot法检测不同浓度BET蛋白抑制剂iBET151对鼠源性永生系PaSC及人PaSC的YAP蛋白表达的作用。（2）qPCR检测iBET151对活化imPaSC中YAP基因表达的影响。（3）分别转染BRD2及BRD4后,Western blot法检测活化的PaSC表达YAP蛋白水平的变化。（4）分别转染BRD2及BRD4后,qPCR检测活化的PaSC表达YAP基因水平。结果:（1）Western blot结果显示,不同浓度iBET151（0-2μM）及不同时间点（6h,24h,48h）刺激PaSC,iBET151可呈浓度依赖性地抑制imPaSC及hPaSC的YAP蛋白的表达。（2）qPCR结果显示,iBET151组YAP基因表达明显降低（p<0.05）。（3）Western blot结果显示,转染BRD4 48h后,与对照组相比,YAP及p-YAP蛋白表达减少;转染BRD2 48h后,YAP及p-YAP蛋白表达未见显着变化。（3）mRNA水平显示,转染BRD432h后,与对照组相比,YAP基因表达减少;转染BRD2 48h后,与对照组相比,YAP基因水平无显着变化。结论:BET蛋白抑制剂可抑制PaSC中YAP蛋白及基因表达,且BRD蛋白家族中BRD4参与调控YAP的表达。第四部分YAP在胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质中的作用目的:观察YAP在慢性胰腺炎及胰腺癌组织中的表达,检测不同活化程度PaSC中YAP表达水平,同时为了进一步阐明YAP在PaSC增殖和促纤维化反应中的作用,我们利用RNA干扰技术,干扰YAP后,观察其对PaSC活化程度、增殖及合成ECM相关蛋白的影响。方法:（1）采用8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象,分为对照组,复发性急性胰腺炎（Recurrent acute pancreatitis,RAP）组:常规雨蛙素剂量（50ug/kg）刺激7inj*2天（间隔1天）,CP组:反复雨蛙素（50ug/kg）刺激7inj*2天/周,共四周,其中RAP组分为d1（RAP第一天,1次AP）,d3（RAP第三天,2次AP）,d5（RAP第五天,2次AP）三组。取各组小鼠的胰腺组织制成4μm的石蜡切片,行免疫荧光双标染色（α-SMA/YAP）,同时Western blot 比较各组胰腺表达YAP、CDH11、ERK及PDGFR-β的蛋白水平。（2）采用Ptfl-Cre;LSL-KrasG12D/+（KC）基因突变小鼠及野生型小鼠作为实验对象,正常饲养三月后取小鼠胰腺组织,采用Western blot检测YAP、CDH11、CK19及PDGFR-β的蛋白水平。（3）新鲜分离人及小鼠的胰腺组织用于原代PaSC细胞的分离,对传代培养的PaSC行q-PCR,检测不同活化程度PaSC中YAP基因表达水平,同时行免疫荧光双标染色（α-SMA/YAP）。（4）利用ThermoFisher Scientific公司合成的siRNA YAP进行YAP的干扰实验,具体步骤根据RNAi产品手册进行操作,利用qPCR检测RNAi效果。转染YAP后,MTT法检测PaSC的增殖情况,同时qPCR检测与PaSC活化及ECM合成相关的基因水平变化。结果:（1）Western blot结果显示,与正常组比较,RAP d3,RAP d5及CP组小鼠YAP、CDH11、ERK及PDGFR-β蛋白表达明显升高。同时免疫荧光结果显示RAP d5组小鼠PaSC活化指标α-SMA及YAP表达明显强于正常小鼠。（2）与野生型小鼠相比,KC基因突变型胰腺癌小鼠的胰腺表达YAP、CDH11、CK19及PDGFR-β蛋白明显升高。（3）q-PCR结果显示,imPaSC及hPaSC由静止转化为活化状态后,YAP基因表达与α-SMA基因表达同步升高。IF结果显示来源于正常人的hPaSC、胰腺癌患者的hPaSC及KC胰腺癌小鼠的mPaSC均表达YAP,且大量位于细胞核中。（4）利用qPCR检测RNAi效果,结果表明,与mock组相比,干扰YAP24h后,基因沉默效果最高,达80%以上,48h沉默效果约60%。MTT检测结果显示,转染YAP 24h后,与对照组相比,PaSC增殖明显减少（P<0.05）。q-PCR结果显示,PaSC转染YAP48h后,参与胶原蛋白和其他ECM蛋白降解的金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3,MMP3）水平显着增加,PaSC活化指标α-SMA,细胞外基质合成相关的COL1A1、FN,刺激PaSC炎症纤维化反应TGF-β基因水平降低,同时参与细胞黏附及ECM重构的结缔组织生长因子（Connectivetissuegrowthfactor,CTGF）、富含半胱氨酸的血管生成诱导剂 61（Cysteine rich angiogenic inducer 61,Cyr61）RNA 水平被显着抑制。结论:YAP表达高低与PaSC活化、增殖相关,PaSC活化及胰腺纤维化程度越高,YAP表达越多,敲除YAP基因可抑制PaSC活化、增殖及细胞外基质的合成。
宋晓改[8]（2020）在《ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究》文中研究指明目的本研究利用CRISPR/Cas9技术,进行基因编辑ADAM9序列,抑制其基因表达,旨在研究ADAM9在小鼠酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究。方法（一）ADAM9-sg RNA3转染大鼠肝星状细胞HSC-T6:将本实验室前期筛选的有活性的ADAM9-sg RNA3质粒转染大鼠肝星状细胞HSC-T6,经过嘌呤酶素筛选,提取转染成功的细胞DNA进行PCR扩增、电泳、胶回收,然后进行测序,以此来验证有效sg RNA3蛋白。（二）体外实验:培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,分为四组,正常HSC-T6对照组:不做任何处理;正常HSC-T6+酒精组:直接用酒精诱导培养;ADAM9-sg RNA3+酒精组:将有效sg RNA3进行稳定转染后给予酒精诱导培养;JNK抑制剂+酒精组:将JNK抑制剂SP600125和培养液混匀加入细胞温育24小时,再和酒精一起诱导细胞培养。免疫印迹检测相关因子表达:解整合素-金属蛋白酶ADAM9,c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路磷酸化蛋白p-c-Jun,平滑肌肌动蛋白α-SMA,增殖细胞核抗原PCNA,细胞凋亡相关蛋白Caspase-3。（三）体内实验:健康清洁的C57BL/6J雄性小鼠220只,随机分为4组:A组:正常对照组（10只）:采用对照Lieber-De Carli饲料TP4030C喂养;B组:生理盐水+酒精组（70只）:尾静脉注射生理盐水;C组:ADAM9-sg RNA3+酒精组（70只）:尾静脉注射有效ADAM9-sg RNA3质粒;D组:JNK抑制剂+alcohol组（70只）:尾静脉注射JNK抑制剂SP600125;B、C、D组分别采用Lieber-De Carli酒精饲料TP4030A喂养4周,之后联合腹腔注射5%CCl4橄榄油溶液2ml/kg,2次/周,直到第8周,建立小鼠酒精性肝纤维化动物模型,第8周集中处死,摘除眼球取血,分离小鼠血清检测AST、ALT这两个酶的数值;肝脏处理后,进行石蜡切片苏木精-伊红染色（HE染色）检测小鼠肝脏损伤情况;天狼星红染色检测小鼠肝脏纤维化程度;Hoechst33258细胞凋亡染色检测肝细胞的凋亡情况;免疫印迹检测相关因子表达:ADAM9,PCNA,血管内皮生长因子VEGF,细胞凋亡相关蛋白Bax,应激蛋白HSP70,代谢关键酶细胞色素P4502E1（CYP2E1）,肿瘤坏死因子TNF-α,α-SMA,p-c-Jun。结果DNA测序结果显示sg RNA3组基因序列与正常基因序列相比,差异大,蛋白免疫印迹结果显示:转染ADAM9-sg RNA3质粒的HSC-T6细胞ADAM9蛋白表达量较正常HSC-T6+酒精组细胞的表达量明显降低（P<0.01）,差异具有显着统计学意义,因此确定sg RNA3为有效向导RNA。体外实验:1.蛋白免疫印迹实验结果:与正常HSC-T6+酒精组相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组细胞ADAM9,p-c-Jun,α-SMA,PCNA的蛋白表达量显着降低（P<0.01）,而Caspase-3的蛋白表达量显着上升（P<0.05或P<0.01）。体内实验:1.血清转氨酶变化情况:生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组、JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平较正常组明显升高（P<0.01或P<0.05）,其中ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平显着低于生理盐水+酒精组（P<0.01或P<0.05）,JNK抑制剂+酒精组小鼠血清中AST、ALT水平与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比降低更加明显（P<0.05）。2.苏木精-伊红染色情况:与正常组相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组以及JNK抑制剂+酒精组小鼠均出现显着肝损伤（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死显着降低（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞坏死降低更明显（P<0.05）。3.苦味酸-天狼星红染色结果:与正常组小鼠相比,其余三组小鼠都发生了显着的肝纤维化（P<0.01或P<0.05）,与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加显着（P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝纤维化减轻更加明显（P<0.05）。4.Hoechst33528染色结果:与正常组小鼠相比,生理盐水+酒精组和ADAM9-sg RNA3+酒精组及JNK抑制剂+酒精组小鼠都发生了显着的肝细胞凋亡（P<0.01）;与生理盐水+酒精组小鼠相比,ADAM9-sg RNA3+酒精组和JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目有所减少（P<0.05或P<0.01）;与ADAM9-sg RNA3+酒精组小鼠相比,JNK抑制剂+酒精组小鼠肝细胞凋亡的数目更显着（P<0.05）。5.蛋白免疫印迹实验结果:与生理盐水+酒精组相比较,尾静脉注射ADAM9-sg RNA3+酒精组和尾静脉注射JNK抑制剂+酒精组肝内CYP2E1,Bax,TNF-α,ADAM9,α-SMA,p-c-Jun的蛋白表达量显着降低（P<0.05或P<0.01）;而VEGF,PCNA,HSP70的蛋白表达量显着升高（P<0.05或P<0.01）。结论在小鼠酒精性肝纤维化中,ADAM9起到促进肝纤维化的作用,ADAM9通过激活JNK信号通路促进小鼠酒精性肝纤维化。
周吉超[9]（2020）在《靶向TRIB3-SQSTM1相互作用恢复自噬治疗肝纤维化》文中提出肝纤维化（Hepatic fibrosis）是病毒性肝炎、胆道梗阻和酒精肝等多种急慢性肝病发生发展的核心病理改变,其特点是肝细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过度沉积并破坏肝组织的正常结构,进而影响肝脏功能。在各种内、外致病原引起的持续肝损伤下,肝纤维化会进一步发展成肝硬化,肝硬化是肝功能衰竭和原发性肝癌的重要诱发因素,也是引起肝病患者死亡的主要原因。流行病学调查显示肝硬化患者的五年生存率不足40%,生活和生存质量较差,临床对于防止肝纤维化发生发展甚至逆转肝纤维化的治疗需求非常迫切。尽管近年来在肝纤维化发病机制方面的研究工作已经取得了一些进展,但是依然没有彻底根治肝纤维化的药物和方法。因此,深入研究肝纤维化的发生机制,并在此基础上发现新药靶、开发防治肝纤维化药物的研究工作迫在眉睫,具有重要的经济和社会意义。自噬是经典的细胞内能量代谢和自我更新机制,是机体抵御病原体入侵,抵抗应激反应,保护细胞免受细胞器碎片和错误折叠蛋白引起的内质网应激损伤的重要效应机制,在生物发育和维持机体稳态过程中发挥重要作用。细胞自噬功能异常往往会参与包括神经退行性疾病、癌症及肝脏疾病等多种疾病的病理过程。在正常肝脏中存在着低水平的自噬活动,当机体处于摄食限制和饥饿状态时,肝细胞自噬被激活,通过降解细胞内错误折叠蛋白和受损细胞器为其提供必要的能量和营养物质并维持正常的细胞稳态。自噬功能异常与肝纤维化的发病密切相关,适度活化的自噬在肝纤维化的发病过程中起到保护作用。TRIB3是Tribbs同源蛋白家族成员之一,能与多种蛋白相互作用,调节细胞功能,有研究发现,TRIB3能够在肿瘤细胞中抑制自噬,妨碍促肿瘤相关蛋白的降解,促进肿瘤的发生。然而,TRIB3在肝纤维化中的作用却并不清楚。我们研究发现:在人的肝纤维化组织中存在着明显的自噬信号的异常现象,且TRIB3和自噬底物受体SQSTM1（sequestosome1/p62）在人肝纤维化组织中均高表达并呈现明显的正相关性。我们在胆管结扎（BDL）以及硫代乙酰胺（TAA）注射诱导的肝纤维化小鼠模型中发现,沉默TRIB3可显着抑制模型动物肝纤维化的产生,并在纤维化肝组织中恢复自噬活性。此外,在原代肝实质细胞中过表达TRIB3后发现,TRIB3与SQSTM1存在相互作用并阻碍SQSTM1与LC3的结合,这导致SQSTM1聚集体的积累并造成自噬下游抑制,从而使得肝细胞内出现大量待降解的自噬小体以及晚期内体。TRIB3在引起晚期内体降解阻碍的同时还使得内体组装与转运复合物核心蛋白TSG101无法正常降解,肝实质细胞中高水平的TSG101促进了富含INHBA/Activin A的外泌体分泌,进而引起肝星状细胞（HSCs）的迁移、增殖和活化。另一方面,HSCs在应激条件下也会高表达TRIB3,抑制SLUG等核转录因子的降解并直接促进HSCs的活化。α螺旋肽A2是从SQSTM1的UBA结构域上截取的一段多肽,我们将其与穿膜肽Pep2连接起来形成融合肽Pep2-A2,实验室的前期研究数据表明Pep2-A2与TRIB3之间具有较高的亲和力。在此基础上,我们进一步发现利用α螺旋肽Pep2-A2打断TRIB3/SQSTM1相互作用可以恢复肝实质细胞自噬,促进晚期内体的自噬性降解,减少富含促纤维化因子的外泌体分泌,抑制HSCs活化,并在BDL和TAA诱导的动物模型中显着逆转肝纤维化发生。提示,针对这种相互作用的多肽药物具有良好的药物开发前景。
杜佳佳[10]（2020）在《Epac1在肝星状细胞表型转化中的作用及CP-25对其的影响》文中研究说明肝纤维化是由于长期受到损伤因子刺激后,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积,导致结缔组织异常增生的过程。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是ECM的主要来源。正常情况下,HSC作为储存维生素A的细胞在窦周间隙保持静止,但在损伤情况下,HSC转化为肌成纤维细胞,释放细胞因子,促进ECM的生成,这一过程称之为表型转化。c AMP直接激活的交换蛋白分子（exchange protein activated by c AMP,Epac）参与体内许多重要的信号通路,从而介导生物学效应。Epac1被激活时,Rap1（Ras-related protein-1）从无活性的Rap1-GDP置换为有活性的Rap1-GTP,进而激发下游信号通路发挥作用。然而,Epac1在HSC表型转化中的作用尚不清楚。白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP）是从芍药干燥根中提取的有效部位,其主要活性成分为芍药苷（paeoniflorin,Pae）。芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25）是对Pae进行酯化修饰合成的新的单体衍生物,能有效提高Pae的生物利用度。课题组前期研究表明,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中,CP-25具有良好的抗纤维化作用,100 mg/kg的CP-25与同剂量的TGP相比,抗纤维化能力更强。CP-25的抗纤维化作用是否与影响Epac1活性有关?为此,本课题收集肝纤维化患者肝组织标本,观察Epac1表达变化;使用CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,观察不同病程整体水平Epac1表达变化;同时,对CCl4诱导的肝纤维化小鼠灌胃给予CP-25,观察CP-25对Epac1的表达及纤维化的调节作用。体外实验选用人肝星状细胞株LX-2,选择性激动或抑制Epac1,观察其对LX-2细胞活化和下游相关通路的影响;以转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）刺激,建立体外纤维化模型,转染针对Epac1的小干扰RNA,检测细胞活化及下游相关信号通路的变化;另给予不同浓度的CP-25,探讨其可能的作用机制。目的:收集肝纤维化患者肝脏样本,检测α-SMA和Epac1表达变化。CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,同时灌胃CP-25,观察Epac1表达变化。体外采用刺激剂和小干扰RNA选择性激动或抑制Epac1,并给予CP-25,观察对LX-2细胞活化及下游相关信号通路的影响。明确Epac1在HSC表型转化中的可能作用,部分阐明CP-25抗肝纤维化的作用机制。方法:选取肝纤维化患者肝组织石蜡切片,免疫荧光法检测α-SMA和Epac1表达变化。采用CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,Western blot法检测肝脏胞质、胞膜中Epac1蛋白表达变化,同时免疫荧光双染法检测小鼠肝脏中α-SMA和Epac1的共定位。另外将小鼠分为正常组、模型组、CP-25组（25、50、100 mg/kg）、TGP组（100 mg/kg）,Western blot及免疫组化检测肝组织中α-SMA、III型胶原、Epac1、p-AKT、p-ERK表达变化体外实验中,选择性激动或抑制Epac1后,采用CCK-8法、细胞划痕法观察对LX-2细胞增殖、迁移的影响;Western blot检测α-SMA、III型胶原、I型胶原表达及AKT、ERK通路激活情况,Pull-down检测Rap1-GTP水平。进一步检测转染Epac1 si RNA,对LX-2细胞中α-SMA、III型胶原蛋白、下游信号通路及Rap1-GTP水平的影响。体外给予CP-25,Western blot观察LX-2细胞中α-SMA、III型胶原及AKT、ERK通路激活情况,Pull-down检测Rap1-GTP水平变化。结果:1. 肝纤维化患者HSC中Epac1的表达情况免疫荧光双染实验结果表明,在肝纤维化患者肝脏中活化的HSC标志物α-SMA的表达明显多于肝内胆管结石患者,同时,在肝纤维化患者肝脏中Epac1的表达也明显高于肝内胆管结石患者。2. 肝纤维化小鼠肝脏中Epac1和?-SMA表达变化免疫荧光双染实验结果表明,CCl4造模8周后,小鼠肝脏α-SMA表达多于正常组小鼠,且肝脏中Epac1表达也增多。3. 不同病程肝纤维化小鼠肝脏中Epac1表达变化Western blot结果显示,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏组织中,从造模4周开始,胞质中Epac1蛋白的表达明显降低,而胞膜中Epac1的表达明显升高。4. 选择性激动或抑制Epac1对细胞活化及下游信号通路的影响CCK-8、划痕实验结果显示,与对照组相比,非选择性激动Epac（8-p CPT）或选择性抑制Epac2（ESI-05）均可明显促进LX-2细胞的增殖和迁移;与8-p CPT组比较,选择性抑制Epac1（CE3F4）可以明显抑制LX-2细胞的增殖和迁移。Western blot实验结果表明,与对照组相比,8-p CPT或ESI-05增加LX-2细胞中?-SMA、I、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达;与8-p CPT组比较,CE3F4可降低LX-2细胞中?-SMA、I、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达。Pull-down实验结果显示,8-p CPT或ESI-05增加LX-2细胞中Rap1-GTP的表达;与8-p CPT组比较,CE3F4可降低Rap1-GTP的表达。5. 转染Epac1 si RNA对LX-2细胞中纤维化指标及下游通路相关蛋白表达的影响Western blot实验结果提示,与对照组比较,TGF-?1刺激后LX-2中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达明显升高;与TGF-?1刺激组相比,干扰Epac1的表达可明显降低细胞中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达。Pull down实验结果显示,与对照组比较,TGF-?1明显增加LX-2细胞中Rap1-GTP的水平;与TGF-?1刺激组相比,干扰Epac1明显抑制细胞中Rap1-GTP水平。6. CP-25对诱导的肝纤维化小鼠的影响HE、Masson染色结果显示,与肝纤维化模型组相比,CP-25可以降低胶原沉积,减轻肝纤维化程度。Western blot结果表明,与肝纤维化模型组相比,CP-25可以降低?-SMA、III型胶原的表达。免疫组化和Western blot结果表明,CP-25可以降低Epac1的表达。7. CP-25对LX-2细胞纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响Western blot结果表明,与TGF-?1刺激组相比,CP-25 10-7～10-5 mol/L可以抑制LX-2细胞中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的产生。Pull down结果显示,与TGF-?1刺激组比较,CP-25 10-5 mol/L明显抑制LX-2细胞中Rap1-GTP的水平。结论:1.肝纤维化患者及肝纤维化小鼠肝组织中HSC激活增多发生表型转化,且HSC中Epac1的表达增加。肝纤维化过程中,Epac1的细胞分布发生变化,提示Epac1可能与肝纤维化发生发展有关。2.选择性激动Epac1可以促进LX-2细胞的增殖和迁移,增加?-SMA、III型胶原、I型胶原的表达,升高Rap1-GTP的水平,增加p-ERK、p-AKT的表达。提示选择性激动Epac1可能通过促进Rap1的活化,进而激活ERK、AKT通路参与HSC表型转化。3.体外向LX-2细胞转染Epac1 si RNA可以降低?-SMA、III型胶原的表达,降低Rap1-GTP的水平,降低p-ERK、p-AKT的表达。提示低表达Epac1可能通过抑制HSC下游Rap1的活化,随后抑制ERK、AKT信号的激活,发挥抑制HSC活化和胶原合成的作用。4.CP-25灌胃给药可减轻肝纤维化程度,降低Epac1的表达。体外给予CP-25,可抑制LX-2细胞中?-SMA、III型胶原的生成、降低Rap1-GTP的水平及p-AKT、p-ERK的表达。提示CP-25可能通过降低Epac1及下游Rap1的活化,进而抑制AKT、ERK信号的激活来发挥抗肝纤维化作用。
二、细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响（论文提纲范文）
（1）ALD中HSC来源外泌体转运Let-7b-5p促肝细胞凋亡与调肝理脾方的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一: 酒精性肝病、外泌体与miNA |
| 1. 酒精代谢与酒精性肝病分子机制 |
| 2. 外泌体与酒精性肝病 |
| 3. miRNA与酒精性肝病 |
| 参考文献 |
| 综述二: 中医学对酒精性肝病的认识 |
| 参考文败 |
| 前言 |
| 第一章 ALD活化的肝星状细胞对肝细胞的促凋亡作用 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 第二章 活化HSC外泌体miRNA差异表达谱与下游靶基因的筛选 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 第三章 ALD中HSC外泌体转移Let-7b-5p促进肝细胞凋亡 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 第四章 调肝理脾颗粒对Let-7b-5p介导的肝细胞凋亡保护作用研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词语注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肝纤维化的形成 |
| 1.2 肝纤维化的诱因 |
| 1.2.1 酒精性肝损伤 |
| 1.2.2 非酒精性脂肪性肝损伤 |
| 1.2.3 病毒性肝炎 |
| 1.3 多种病理机制参与肝纤维化进程 |
| 1.3.1 肝内巨噬细胞活化影响肝纤维化进程 |
| 1.3.2 氧化应激加速肝纤维化进程 |
| 1.3.3 肝脏炎症加速肝纤维化进程 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号转导途径 |
| 1.4.1 FXR在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.2 LXRs在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.3 TGF-β信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.4 P2X7r-NLRP3信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.5 PI3K-Akt信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.5 .肝纤维化治疗药物研究 |
| 1.5.1 中药治疗肝纤维化 |
| 1.5.2 西药治疗肝纤维化 |
| 1.6 人参的肝保护作用 |
| 1.7 本课题研究思路 |
| 第二章 人参皂苷25-OCH_3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 动物给药方案 |
| 2.2.4 细胞培养与药物处理 |
| 2.2.5 血清生化分析 |
| 2.2.6 组织石蜡包埋 |
| 2.2.7 H&E染色 |
| 2.2.8 Masson三色胶原染色 |
| 2.2.9 Sirius Red染色 |
| 2.2.10 免疫荧光染色 |
| 2.2.11 免疫组织化学染色 |
| 2.2.12 TUNEL检测 |
| 2.2.13 蛋白印迹实验 |
| 2.2.14 RT-PCR实验分析 |
| 2.2.15 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 25-OCH_3-PPD改善TAA诱导的肝损伤 |
| 2.3.2 25-OCH_3-PPD减弱与肝星状细胞激活相关的促纤维化细胞因子的转录 |
| 2.3.3 25-OCH_3-PPD可降低肝组织中炎症因子水平 |
| 2.3.4 25-OCH_3-PPD抑制P2X7r调节NLRP3炎症小体 |
| 2.3.5 25-OCH_3-PPD调节PI3K/Akt磷酸化改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.6 25-OCH_3-PPD调节LKB1/AMPK-SIRT1信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.7 25-OCH_3-PPD促进LXRs和FXR活性改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.8 25-OCH_3-PPD阻断TAA诱导的小鼠肝细胞凋亡 |
| 2.3.9 25-OCH_3-PPD通过调节P2X7r-NLRP3抑制肝星状细胞的活化 |
| 2.3.10 25-OCH_3-PPD调节活化的肝星状细胞中LXRs与磷酸化PI3K/Akt的表达 |
| 2.3.11 抑制活化的HSCs中炎症因子表达是25-OCH_3-PPD改善肝纤维的关键 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 20S-原人参三醇通过调FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 动物给药方案 |
| 3.2.4 细胞存活率 |
| 3.2.5 细胞培养与药物处理 |
| 3.2.6 血清生化分析 |
| 3.2.7 组织石蜡包埋 |
| 3.2.8 H&E染色 |
| 3.2.9 免疫荧光染色 |
| 3.2.10 蛋白印迹实验 |
| 3.2.11 RT-PCR实验分析 |
| 3.2.12 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 M4能够抑制肝星状细胞的活性与增殖 |
| 3.3.2 M4调节活化HSC中ECM的平衡 |
| 3.3.3 M4增加活化的HSC中FXR的表达并与P2X7r抑制有关 |
| 3.3.4 M4抑制活化的HSC中促炎细胞因子的表达 |
| 3.3.5 FXR是M4阻断P2X7r进一步改善肝纤维化和炎症的重要靶点 |
| 3.3.6 M4改善TAA诱导小鼠肝损伤 |
| 3.3.7 M4对TAA诱导小鼠肝纤维化的改善作用 |
| 3.3.8 M4通过FXR/P2X7r信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 3.3.9 M4降低TAA诱导的小鼠肝纤维化肝脏中促炎细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 发表论文目录 |
| 致谢 |
（4）荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及传代 |
| 2.2 检测TFL药物对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.3 透射电子显微镜观察HSC-T6的超微结构 |
| 2.4 ELISA检测MMP-2、ColⅠ、ColⅢ的含量变化 |
| 2.5 肝纤维化动物造模分组及含药血清的制备 |
| 2.6 检测含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.7 含药血清干预后蛋白质的收集与提取 |
| 2.8 DDA检测 |
| 2.9 DIA检测 |
| 2.10 主要数据库和数据指标 |
| 2.10.1 NR数据库和UniProt蛋白数据库 |
| 2.10.2 STRING蛋白互作数据库 |
| 2.10.3 GO数据库 |
| 2.10.4 KOG数据库 |
| 2.10.5 KEGG数据库 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TFL药物对HSC-T6生长抑制率的影响 |
| 3.2 TFL药物对HSC-T6超微结构的影响 |
| 3.3 TFL药物对HSC-T6的MMP-2、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 |
| 3.4 肝纤维化动物造模结果 |
| 3.5 不同浓度的含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 3.6 肽段与蛋白的定量质控分析 |
| 3.7 DDA/DIA检测结果 |
| 3.8 GO富集分析 |
| 3.9 KOG注释分析 |
| 3.10 PPI分析 |
| 3.11 PATHWAY富集分析 |
| 3.12 亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 理论基础 |
| 4.1.1 肝纤维化与肝星状细胞的理论基础 |
| 4.1.2 差异蛋白质组学的理论基础 |
| 4.1.3 中医药对肝纤维化认识的理论基础 |
| 4.1.4 荔枝核总黄酮(TFL)治疗肝纤维化的理论基础 |
| 4.2 TFL对HSC-T6生长增殖的影响 |
| 4.3 TFL对HSC-T6的ECM形成相关因子的影响 |
| 4.3.1 基质金属蛋白酶2(MMP-2) |
| 4.3.2 Ⅰ型胶原(ColⅠ) |
| 4.3.3 Ⅲ型胶原(ColⅢ) |
| 4.4 TFL对HSC-T6部分差异蛋白功能的讨论 |
| 4.4.1 上调蛋白 |
| 4.4.2 下调蛋白 |
| 4.5 TFL对HSC-T6差异蛋白部分信号通路的分析 |
| 4.5.1 PI3K/Akt通路 |
| 4.5.2 NF-κB信号通路 |
| 4.5.3 胆固醇代谢与合成 |
| 4.5.4 补体和凝血级联 |
| 4.5.5 细胞色素P450 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 荔枝核总黄酮防治肝纤维化相关细胞因子及信号通路的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
（5）七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化（论文提纲范文）
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 肝纤维化的影响因素及肝星状细胞的激活 |
| 参考文献 |
（6）CD39介导的ATP-腺苷信号通路在酒精性肝病中的作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 主要药品与试剂 |
| 2.4 仪器及设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 动物实验 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 HSC-T6 计数 |
| 3.4 蛋白提取与含量测定 |
| 3.5 Western Blot法测量蛋白的表达 |
| 3.6 RT-q PCR法测量m RNA的表达 |
| 3.7 ATP试剂盒检测HSC-T6 细胞培养上清液中ATP含量 |
| 3.8 免疫荧光染色 |
| 3.9 细胞周期检测 |
| 3.10 数据统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 CD39 和CD73 在小鼠酒精性肝纤维化中的表达变化 |
| 4.2 CD39 和CD73 在体外酒精性肝纤维化中的表达 |
| 4.3 抑制CD39 减轻酒精性肝纤维化 |
| 4.4 胞外ATP通过激活CD39 的表达从而促进体外酒精性肝纤维化 |
| 4.5 CD39 在乙醛诱导的HSC-T6 细胞活化的影响 |
| 4.6 抑制/沉默CD39 在乙醛诱导的HSC-T6 细胞活化中A2AR,A2BR和 TGF-β/Smad3 信号通路的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 CD39-腺苷能轴在纤维化疾病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）BET蛋白抑制剂对人和小鼠胰腺星状细胞功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 文献综述 胰腺星状细胞的调控及其在族腺纤维化中的作用 |
| 参考文献 |
| 第一部分 BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 BRD2及BRD4蛋白在胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质的作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 BET蛋白抑制剂对胰腺星状细胞YAP表达的调节作用及机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 YAP在胰腺星状细胞活化、增殖及合成细胞外基质中的作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 博士阶段发表论文 |
| 作者简介 |
（8）ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 酒精性肝纤维化概述 |
| 1.1.1 酒精性肝纤维化病因及发病机制 |
| 1.1.2 酒精性肝纤维化病理特点 |
| 1.1.3 酒精性肝纤维化动物模型 |
| 1.2 酒精性肝纤维化过程中分子调控机制研究 |
| 1.2.1 酒精及其代谢产物对肝脏的影响 |
| 1.2.2 CYP2E1与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.3 热休克蛋白与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.4 细胞凋亡与酒精性肝纤维化 |
| 1.2.5 c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径与酒精性肝纤维化 |
| 1.3 解整合素-金属蛋白酶ADAM9 |
| 1.3.1 ADAM9概述 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 技术概述 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9 系统的发展历程及分类 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 系统的结构 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统的实验原理 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas9 系统在各个方面的应用 |
| 第2章 前言 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞和质粒 |
| 3.1.2 实验动物准备 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要实验试剂 |
| 3.1.5 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 利用CRISPR/Cas9 技术构建ADAM9 三合一质粒 |
| 3.2.3 细菌培养 |
| 3.2.4 提取质粒 |
| 3.2.5 细胞培养 |
| 3.2.6 筛选HSC-T6细胞最佳嘌呤酶素浓度 |
| 3.2.7 嘌呤酶素筛选和细胞转染 |
| 3.2.8 PCR技术检测 |
| 3.2.9 胶回收DNA |
| 3.3 体外实验 |
| 3.3.1 免疫印迹蛋白检测 |
| 3.4 体内实验 |
| 3.4.1 血清AST、ALT酶活性的检测 |
| 3.4.2 组织包埋及切片 |
| 3.4.3 HE染色检测各组小鼠的肝脏坏死情况 |
| 3.4.4 苦味酸-天狼星红染色法检测各组小鼠肝脏纤维化的情况 |
| 3.4.5 Hoechst33258 染色法检测小鼠的肝细胞凋亡状况 |
| 3.4.6 免疫印迹蛋白检测 |
| 3.5 实验数据的统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 CRISPR/Cas9 技术靶向突变小鼠ADAM9 基因三合一质粒 |
| 4.2 免疫印迹法检测细胞蛋白表达结果 |
| 4.3 小鼠血清ALT、AST酶活性的检测结果 |
| 4.4 肝脏组织HE染色结果 |
| 4.5 肝脏组织苦味酸-天狼星红染色结果 |
| 4.6 肝脏组织Hoechst33258 染色结果 |
| 4.7 免疫印迹法检测组织蛋白的表达结果 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9与转氨酶和组织损伤的关系 |
| 5.2 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和胶原纤维的关系 |
| 5.3 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9 和α-SMA的关系 |
| 5.4 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和细胞凋亡的关系 |
| 5.5 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9 对肝细胞应激分子HSP70 的影响 |
| 5.6 小鼠酒精性肝损伤中ADAM9对肝细胞增殖的作用 |
| 5.7 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和VEGF的关系 |
| 5.8 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和JNK信号途径的关系 |
| 5.9 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和CYP2E1 的关系 |
| 5.10 小鼠酒精性肝纤维化中ADAM9和TNF-α的关系 |
| 5.11 问题与展望 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 附录 Ⅰ 图及说明 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（9）靶向TRIB3-SQSTM1相互作用恢复自噬治疗肝纤维化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述 肝纤维化发病的细胞生物学与病理学研究进展 |
| 一、肝实质细胞参与肝纤维化的发生与发展 |
| 二、肝脏星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs)是肝纤维化的主要效应器细胞 |
| 三、肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cell,LSECs）毛细血管化促进肝纤维化的发生 |
| 四、巨噬细胞（Macrophage)通过调节肝脏免疫微环境影响肝纤维化进程 |
| 五、间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs)补充疗法在抗肝纤维化中的应用及潜力 |
| 六、内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）能够促进肝脏损伤修复,改善肝纤维化 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、人肝纤维化组织中存在着明显的自噬信号异常以及TRIB3的高表达 |
| 二、TRIB3通过抑制自噬参与肝纤维化过程 |
| 三、TRIB3通过与SQSTM1相互作用抑制肝细胞自噬并影响MVB降解 |
| 四、TRIB3促进肝实质细胞分泌外泌体 |
| 五、过表达TRIB3的肝实质细胞能够促进与其共培养的HSCs活化 |
| 六、TRIB3通过促进肝实质细胞分泌外泌体激活HSCs |
| 七、外泌体中包含的INHBA/ActivinA是引起HSCs活化的关键活性分子 |
| 八、TRIB3能够引起HSCs自噬抑制并促进HSCs的活化 |
| 九、打断TRIB3与SQSTM1相互作用能恢复肝细胞自噬,减少外泌体分泌 |
| 十、打断TRIB3与SQSTM1之间的相互作用能够抑制HSCs的活化 |
| 十一、α螺旋肽Pep2-A2能够治疗多种因素诱发的肝纤维化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）Epac1在肝星状细胞表型转化中的作用及CP-25对其的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 肝纤维化患者组织样本 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 细胞株 |
| 2.4 药物与试剂 |
| 2.5 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 免疫荧光双染法检测α-SMA、Epac1在肝纤维化患者组织标本中的表达 |
| 3.2 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型的建立与分组 |
| 3.2.1 肝脏组织病理学检查 |
| 3.2.1.1 HE染色 |
| 3.2.1.2 Masson染色 |
| 3.2.2 Western blot法检测Epac1、a-SMA、Ⅲ型胶原、p-AKT、p-ERK表达变化 |
| 3.2.2.1 肝组织总蛋白及胞质胞膜蛋白的提取 |
| 3.2.2.2 蛋白定量 |
| 3.2.2.3 Western blot操作步骤 |
| 3.3 选择性激动或抑制Epac1对细胞增殖和迁移的影响 |
| 3.3.1 LX-2细胞的培养 |
| 3.3.2 CCK-8法检测选择性激动或抑制Epac1对细胞增殖的影响 |
| 3.3.3 划痕法检测选择性激动或抑制Epac1对细胞迁移的影响 |
| 3.4 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞纤维化指标及下游通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.1 LX-2总蛋白的提取和定量 |
| 3.4.2 Western blot法检测选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞α-SMA、Ⅲ型胶原、I型胶原、p-AKT、p-ERK蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 Pull-down法检测选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞Rap1-GTP水平的影响 |
| 3.5 转染Epac1siRNA对 LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.5.1 Epac1 siRNA的筛选和转染效率验证 |
| 3.5.2 实验分组 |
| 3.5.3 Western blot法检测转染Epac1 siRNA对 LX-2 细胞中α-SMA、Ⅲ型胶原、p-AKT、p-ERK蛋白表达的影响 |
| 3.5.4 Pull-down法检测转染Epac1siRNA对 LX-2 细胞中Rap1-GTP水平的影响 |
| 3.6 CP-25对肝纤维化小鼠纤维化指标、Epac1及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.1 HE及 Masson染色检测CP-25对肝纤维化小鼠肝脏病理的影响 |
| 3.6.2 Western blot法检测CP-25对肝纤维化小鼠纤维化指标、Epac1及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.3 免疫组化法检测CP-25对肝纤维化小鼠肝脏中Epac1蛋白表达的影响 |
| 3.7 CP-25对LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.7.1 CP-25对LX-2细胞中α-SMA、Ⅲ型胶原、p-AKT、p-ERK蛋白表达的影响 |
| 3.7.2 CP-25对LX-2细胞中Rap1-GTP水平的影响 |
| 3.8 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 α-SMA、Epac1在肝纤维化患者组织标本中的表达情况 |
| 4.2 造模不同病程肝纤维化小鼠肝脏Epac1表达情况 |
| 4.2.1 造模不同病程肝纤维化小鼠肝脏的病理学变化 |
| 4.2.2 α-SMA、Epac1在肝纤维化小鼠肝脏中的共表达情况 |
| 4.2.3 Epac1在不同病程肝纤维化小鼠肝脏中的表达情况 |
| 4.3 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞增殖和迁移的影响 |
| 4.4 选择性激动或抑制Epac1对纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.4.1 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞活化、胶原合成能力的影响 |
| 4.4.2 选择性激动或抑制Epac1对LX-2细胞Rap1-GTP水平及ERK、AKT信号激活的影响 |
| 4.5 转染Epac1 siRNA对LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.5.1 Epac1 siRNA筛选与转染效率验证 |
| 4.5.2 转染Epac1 siRNA对LX-2细胞活化、胶原合成能力的影响 |
| 4.5.3 转染Epac1 siRNA对LX-2细胞Rap1-GTP水平及ERK、AKT信号激活的影响 |
| 4.6 CP-25对CCl_4诱导的肝纤维化小鼠的影响 |
| 4.6.1 CP-25对肝纤维化小鼠肝脏病理学的影响 |
| 4.6.2 CP-25对肝纤维化小鼠肝组织a-SMA 和Ⅲ型胶原表达的影响 |
| 4.6.3 CP-25 对肝纤维化小鼠Epac1 蛋白表达的影响 |
| 4.6.4 CP-25对肝纤维化小鼠肝脏 ERK、AKT 通路的影响 |
| 4.7 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞中纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.7.1 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞活化、胶原合成能力的影响 |
| 4.7.2 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞Rap1-GTP水平的影响 |
| 4.7.3 CP-25对TGF-β1刺激的LX-2细胞ERK、AKT信号激活的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 Epac1及其调控的信号在肝星状细胞表型转化过程中发挥重要作用 |
| 5.2 CP-25可能通过降低Epac1活性及其信号发挥抗肝纤维化作用 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述:Epac信号分子在纤维化疾病中作用研究进展 |
| 参考文献 |
四、细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响（论文参考文献）
- [1]ALD中HSC来源外泌体转运Let-7b-5p促肝细胞凋亡与调肝理脾方的保护作用研究[D]. 孔晨帆. 北京中医药大学, 2021(08)
- [2]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究[D]. 宋健. 延边大学, 2021(02)
- [4]荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究[D]. 蒋云霞. 广西中医药大学, 2021(01)
- [5]七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化[D]. 谢海深. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]CD39介导的ATP-腺苷信号通路在酒精性肝病中的作用研究[D]. 帅陈. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]BET蛋白抑制剂对人和小鼠胰腺星状细胞功能的影响及机制研究[D]. 支朦朦. 东南大学, 2020(02)
- [8]ADAM9在酒精性肝纤维化中的作用及调控的分子机制研究[D]. 宋晓改. 河南科技大学, 2020(06)
- [9]靶向TRIB3-SQSTM1相互作用恢复自噬治疗肝纤维化[D]. 周吉超. 北京协和医学院, 2020(05)
- [10]Epac1在肝星状细胞表型转化中的作用及CP-25对其的影响[D]. 杜佳佳. 安徽医科大学, 2020