一、新疆出血热的病理学观察及与临床联系的探讨（论文文献综述）
戴诗雨[1]（2020）在《病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究》文中进行了进一步梳理病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）是由一个或多个病毒结构蛋白组装形成的颗粒状结构,与天然病毒粒子形态、抗原性相似。VLP缺失病毒的遗传物质,没有复制和感染能力。VLP的免疫原性良好,研制快速,制备成本较低并且安全,在应对新发、突发病毒疾病的疫苗研制中具有独特优势。杆状病毒表达系统是常用的真核表达系统之一,广泛应用于蛋白功能研究,抗原及疫苗制备。我们利用杆状病毒表达系统构建了几种危害人类健康的病毒VLPs,并初步探究了其作为候选疫苗的免疫原性。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是蚊传黄病毒,近年发现其感染与新生儿小头畸形有关,且能引起格林-巴利综合征等神经系统疾病。目前,对于ZIKV引起的疾病,尚无有效的疫苗和特异性治疗药物,ZIKV严重危害人类健康。我们利用杆状病毒表达系统,构建了表达ZIKV pr ME蛋白的重组病毒。经蔗糖密度梯度离心,从感染的昆虫细胞中纯化得到由ZIKV pr M蛋白和E蛋白自组装形成的ZIKV VLPs。以ZIKV pr ME VLPs免疫小鼠能够诱导小鼠产生中和抗体,及ZIKV特异的体液和细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为以VLP为基础的ZIKV疫苗研发奠定了基础。我们也构建了表达ZIKV囊膜蛋白E的重组病毒,结果显示在昆虫细胞中囊膜蛋白E可以不依赖于pr M蛋白共表达组装成与ZIKV病毒粒子形态类似的VLP,并且释放到胞外。E蛋白保留膜融合活性,可以诱导合胞体形成,这一现象同样适用于包括日本脑炎病毒、登革热病毒和蜱传脑炎病毒在内的黄病毒。基于杆状病毒表达黄病毒囊膜蛋白E诱导合胞体形成的现象,我们还建立了靶向黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）是脊髓灰质炎（简称脊灰）的病原体。目前脊灰没有特异治疗方法,只能通过接种疫苗来预防。目前世界上普遍使用的脊灰疫苗有两种,即口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。自从1988年世界卫生组织（WHO）发起全球消灭脊灰行动以来,世界各国大力推广OPV的使用,2015年和2019年,WHO先后宣布Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒的消灭。在根除脊灰的最后阶段,OPV和IPV都不可避免存在安全性问题,面临着免疫策略调整的挑战,在无PV的环境下生产疫苗更安全可靠。我们利用杆状病毒表达系统共表达PV的P1和3CD蛋白,P1前体可以被3CD蛋白酶成功剪切成衣壳蛋白VP0、VP1和VP3,经过蔗糖密度梯度离心结合氯化铯密度梯度离心可以纯化出PV VLPs,与天然PV病毒颗粒的形态、大小相似。克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,CCHFV）是一种高致病性病毒,可以导致克里米亚刚果出血热,一种以出血为典型特征的蜱媒自然疫源性疾病。CCHFV感染能引起人发热、出血以及多器官的功能衰竭,进而导致死亡,致死率高达30%-50%,没有有效的抗CCHFV的药物和疫苗,CCHFV是人类健康的潜在威胁。在我国病毒分类目录中,CCHFV属于第一类危害程度的病毒;在国外,CCHFV是生物安全4级的病毒。CCHFV在体外通过细胞培养进行病毒的分离和扩增较困难,极大限制了CCHFV的研究进展。我们构建重组病毒在昆虫细胞中共表达CCHFV的膜蛋白和核衣壳蛋白,或者单独表达膜蛋白。通过蔗糖密度梯度离心,成功从感染的细胞中制备出CCHFV VLPs。CCHFV病毒粒子表面是膜蛋白Gn和Gc,为了形成感染性病毒粒子,膜蛋白前体在细胞内经过复杂的剪切、加工和定位从而形成结构蛋白Gn和Gc,非结构蛋白GP160,GP85,GP38和NSm。在整个生命周期中CCHFV膜蛋白Gn和Gc在病毒入侵、膜融合、致病性、宿主选择和免疫逃逸等方面有重要作用。对CCHFV膜蛋白Gn和Gc宿主互作蛋白的研究,探索CCHFV与宿主的相互作用有利于了解CCHFV的分子生物学,找到病毒感染的关键宿主因子。为了研究CCHFV膜蛋白Gn/Gc与宿主的相互作用,我们首先制备了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的单克隆抗体。以原核表达的Gn/Gc胞外区作为免疫原免疫小鼠,通过有限稀释法,以真核表达的Gn/Gc蛋白作为检测抗原,经ELISA方法初筛融合上清,结合蛋白免疫印迹分析和细胞免疫荧光检测。经过综合评定和比较,筛选出8株Gn单克隆化的杂交瘤细胞和10株Gc单克隆化的杂交瘤细胞。分别以不同截短形式的Gn/Gc原核表达蛋白为抗原,对融合上清的识别区段进行鉴定,最终鉴定出2株Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体及其识别的抗原表位。为了探索膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,我们以带有Twin-strep标签的Gn或Gc作为诱饵蛋白,对样品进行细胞亲和纯化-质谱（AP-MS）鉴定。共鉴定出45个Gn或Gc相关宿主蛋白,结合生物信息学深入挖掘和分析,并通过免疫荧光等方法对质谱结果有效性进行验证。综上所述,我们利用杆状病毒表达系统成功构建了ZIKV VLPs,PV VLPs和CCHFV VLPs。对ZIKV VLPs免疫原性的初步探索表明其有良好的免疫原性,有希望成为ZIKV候选疫苗。基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体的现象,建立了针对黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。筛选出2株CCHFV Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体。并通过蛋白质组学和生物信息学鉴定分析了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,可以促进全面地了解膜蛋白Gn/Gc与宿主的关系,对认识CCHFV感染相关过程,后续功能分析及药物靶点设计具有重要指导意义。
余竹梅[2]（2020）在《中国新疆啮齿类动物和北方地区蜱携带荆门病毒的分子特征研究》文中研究表明研究背景和目的:荆门病毒是一类单股正链的分节段RNA病毒,由于其在进化上与黄病毒科的NS3和NS5有同源性,故暂时归类为黄病毒科的荆门病毒组,它也是世界上首次将分节段与不分节段黄病毒之间建立起关联的正链RNA病毒。荆门病毒是一组以节肢动物为传播媒介的虫媒病毒,它的代表病毒荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）是2010年首次在湖北省荆门市的微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）中发现,随后JMTV在亚洲其它国家、南美洲、非洲、加勒比海地区和欧洲等世界范围内多个国家相继报道,病毒呈现出明显的遗传多样性和洲际间地理聚集性。蜱作为JMTV的传播媒介具有多样性。蜱在JMTV从节肢动物到哺乳动物的传播中扮演着重要的角色。近年来相关报道表明,JMTV能感染牛和猴等多种哺乳动物,更为重要的是,德国和科索沃的科学家在感染克里米亚刚果出血热病毒（CCHFV）的病人血清中检测到JMTV。随后,来自中国的两个研究团队先后报道了 JMTV和类JMTV（阿龙山病毒,ALSV）能感染人。啮齿类动物作为最大类的哺乳动物,携带多种病原体,与人类的关系密切,同时它也是蜱的寄生宿主,因此开展啮齿类动物JMTV的携带情况调查和监测不同地区中不同蜱种JMTV流行情况,将有助于加深对这个新病原的发生、发展及进化的了解,对该疾病的预防控制有着重要的公共卫生学意义。研究方法:1)2011-2012年在新疆博乐市、辽宁省沈阳市和北京市昌平区3地共采集蜱标本277只,包括博乐市残缘璃眼蜱（Hyalomma detritum,Hd）83只,沈阳市长角血蜱（Haemaphysalis Iongicornis,H1）98 只,昌平区中华革蜱（Dermacentor sinicus,Ds）96 只;2)2016 年采用食物诱饵笼子捕获在中国新疆维吾尔自治区察布查尔锡伯自治县采集164只啮齿类动物。解剖分离啮齿类动物心、肝、脾、肺和肾五个脏器和单只蜱分别制备组织悬液提取总RNA,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）进行JMTV检测和基因组扩增,与已知的荆门蜱病毒进行序列比对,选择最大似然法,用PhyML version 3.0构建系统发生树。计算重复1000次,Bootstrap值>70%认为具有显着意义。研究结果:1)164只啮齿动物肝脏中筛查出JMTV阳性42只,阳性率为25.6%,包括普通田鼠（Microtus arvalis）23 只（24.5%）,乌拉尔姬鼠（Apodemus uralensis）9只（29.0%）,大沙鼠（Rhombomys opimus）l 只,小家鼠（Mus musculus）5只,柽柳沙鼠（Meriones tamariscinus）1只,红尾沙鼠（Meriones libycus）1只,灰仓鼠（Cricetulus migratorius）1只,狭颅田鼠（Mfcrotus gregalis）1只。进一步对42份JMTV阳性RNA样本进行全基因组扩增,获得7株接近全长的JMTV基因组序列,同时也得到5株较短序列的JMTV基因序列。同源性分析显示,所有新发现的啮齿类JMTV与已知的中国地区的JMTV同源性最高,其中7株田鼠JMTV四个节段之间核苷酸差异性为0.1%～1.5%,田鼠JMTV与已知的中国地区的JMTV四个节段的核苷酸差异性为8.9%,与来自非洲、南美洲和欧洲的JMTV核苷酸同源性为77.8%～92.1%,而与阿龙山病毒（JMTV-like病毒）同源性相对较低（57.5%～72%）。系统进化分析显示:在节段1、节段2和节段3中,新发现的12株病毒与已知的中国蜱JMTV聚集在一起,形成了两个独立的进化支,一支由普通田鼠携带的JMTV组成,另一支由乌拉尔姬鼠、灰仓鼠和狭颅田鼠携带的JMTV组成。然而在S4节段,所有的啮齿类JMTV聚集到了一个进化支上,提示JMTV具有遗传多样性。2)JMTV在啮齿类动物心、肝、脾、肺和肾5个脏器的检测结果显示,JMTV在啮齿类动物各组织脏器呈现普遍分布,但是在各组织器官的阳性率不一致,其中肝脏检测出的阳性率为25.6%,肺脏和脾脏分别为10.8%和2.6%,而肾脏和心脏由于样本的缺失问题,没有进行阳性率的分析。检测的8个啮齿类动物物种中,普通田鼠检测的样本量最大,JMTV在普通田鼠肝、肺和脾三个脏器中,阳性率从高到低依次为24.5%、19.1%和15.7%。进一步分析JMTV在同一啮齿类动物5个脏器的系统感染情况,我们发现:8个啮齿类动物物种中仅出现肝脏感染的29只;包括肝脏感染在内出现两个及两个以上脏器感染的13只;不包括肝脏感染在内出现两个及两个以上脏器感染的2只。3)通过对采集于北方地区3个省级行政区[中国西北地区的新疆维吾尔自治区（新疆）博乐市、东北的辽宁省沈阳市和北京市昌平区]的277只蜱样本进行荆门病毒筛查,获得阳性样本67只,阳性率为24.2%,其中中华革蜱检测阳性41只,阳性率高达42.7%;残缘璃眼蜱检出阳性12只,阳性率为14.5%;长角血蜱检出阳性14只,阳性率为14.3%。全基因组扩增获得4株接近全长的JMTV基因组序列,同源性分析显示新发现的JMTV之间核苷酸同源性为91.4%～99.8%,与已知的中国地区JMTV同源性最高（90.1%～99.8%）。系统进化分析表明:这4株病毒在节段1、节段2和节段4与已知的新疆啮齿类动物中发现的JMTV聚集在一个进化支上,但在节段3构建的系统发生树中,2株病毒与新疆啮齿类JMTV聚集在一起,而另2株与中国其他地区的蜱源性JMTV聚集在一起,提示该节段可能存在基因重排。结论:1)首次在新疆地区啮齿类物种发现JMTV,同源性分析显示,新发现的啮齿类JMTV具有遗传多样性,特别是在S2和S4节段,12株病毒核苷酸差异性达到接近10%。系统发生分析表明:所有的啮齿类JMTV与已知的中国地区蜱源JMTV聚集在一起,在节段1、节段2和节段3中,12株病毒形成了两个独立的进化支,然而在S4节段,所有的啮齿类JMTV聚集到了 一个进化支上,提示JMTV具有遗传多样性。2)JMTV在啮齿类动物不同脏器的检测阳性率不一致提示:在自然界中,JMTV感染啮齿类动物可能存在一定的组织嗜性,这将有待进一步的研究。JMTV在同一啮齿类动物多个脏器检测到阳性结果提示JMTV感染啮齿类动物呈现多个脏器系统感染。3)同源性分析显示,新发现的4株蜱JMTV具有遗传多样性（90.1%～99.8%）。系统发生分析表明,新发现的蜱JMTV与中国地区JMTV聚集在一起,其中2株JMTV在S3节段可能存在基因重排现象。蜱作为JMTV的传播媒介,在JMTV从节肢动物到哺乳动物的传播中扮演了重要角色。
胡锦阳[3]（2018）在《粪类圆线虫感染沙鼠模型的建立及CRISPR/Cas9基因敲除方法的初步尝试》文中认为粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）是一种常见且分布广泛,危害严重的肠道寄生线虫,主要感染犬、人和其它灵长类动物。由于粪类圆线虫独特的生活史,它可以在宿主体内和体外进行交替繁殖。同时粪类圆线虫自由生活雌虫具有性腺合胞体结构,与雌雄同体的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）结构非常相似,因此可以将转基因质粒显微注射至其性腺,达到研究其基因的目的。针对寄生线虫,目前没有有效的疫苗,只能依靠化学药物进行杀灭和控制。但是由于几十年来重复使用几种常用杀虫药物,使得虫体对其产生了耐药性,因此开发抗寄生线虫疫苗和寻找新的潜在的药物作用靶点迫在眉睫,而转基因技术则是应用于研究寄生线虫基因功能所必须的一种重要工具。起源于细菌和古细菌经过长期适应性免疫逐步形成的Ⅱ型成簇的有规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated nuclease 9（Cas9）,CRISPR/Cas9],配合向导RNA（g RNA）成为CRISPR/Cas9系统,近年来被改造成为基因组高效定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、修饰效率高、成本低廉和适用于多种真核、原核生物等多种优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。目前CRISPR/Cas9遗传修饰技术在非寄生性的秀丽隐杆线虫中有很多应用,近几年来,该系统也已应用于在几种寄生原虫中。但是,CRISPR/Cas9是否能在寄生线虫中运用,并研究打靶基因的功能仍然是未知数。为此本课题主要进行了以下几个方面的研究:（1）改进和优化长爪沙鼠、建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型本实验对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,包括感染所使用的i L3数量（从1000条降至170条）,缩短粪便的排虫时间（从35天缩短至11天）,提高了感染率（从6.5%提高至77.8%）,使粪类圆线虫感染长爪沙鼠实验动物模型更加适应我们的研究目的。同时首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型,DAPI染色寄生雌虫并观察细胞状态,测定宿主感染前后血液生理,血清生化等多个指标,发现阳性相比阴性嗜酸性细胞百分比增加,血红蛋白和红细胞计数都出现下降,说明虫体成功感染宿主并引起了宿主出血。对感染的比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠的十二指肠进行组织病理检查,可以观察到虫体。对沙鼠体内的寄生雌虫（PF）,自感染三期（L3a）,后寄生四期（PL4）进行形态学描述。（2）粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究以Ss-rps-21为启动子,构建表达GFP的转基因质粒p AJ20,用来分别注射自由生活的雌性成虫和雄性成虫。首先尝试将转基因质粒p AJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺,观察到P0代的性腺和子宫内的卵表达了GFP蛋白,其F1代L1全身广泛表达GFP蛋白,并且在其生殖原基（GP）处表达量最高。接着尝试将转基因质粒p AJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活雄虫的睾丸,然后挑野生型雌虫与其交配,观察其后代表型。经过不断尝试虫体发育时期、注射部位和质粒浓度,发现虫体在体外23.5℃温箱发育40 h,注射部位在雄虫咽部下方,质粒浓度为900-1000 ng/ml时,可以观察到F1代L1表达GFP蛋白,虽然也是全身广泛表达以及在生殖原基处表达量较高,但是在虫体的头部和咽部表达量也较高。（3）CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用本实验统计粪类圆线虫密码子使用情况,并分析了其使用密码子的偏好性,对Ce Cas9蛋白进行了优化,使其更好的在粪类圆线虫体内表达。在Wormbase上找到15个鼠类圆线虫（Strongyloides ratti）U6基因,多序列比对它们的蛋白序列,找到相对保守的位点,然后再往其上下游延伸,得到512 bp大小的序列作为g RNA的启动子。同时利用软件和文献报道的规律设计8条g RNA打靶于Ss-dpy-2第一个外显子。为了验证软件设计的8条g RNA是否具有良好的打靶效率,做了sp Cas9/g RNA体外酶切效率检测实验,发现gRNA4、7和8切割效率较高。为了验证经优化的Ss Cas9和g RNA是否都在粪类圆线虫发生转录,我们将p AJ50-Cas9质粒和p XL-BACII-gRNA4显微共注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺中。提取后代虫体的RNA进行反转录PCR扩增。发现扩增得到Ss Cas9和g RNA片段,说明Ss Cas9和g RNA完成了转录,也表明构建的质粒的启动子Ss-rps-21和Sr-U6具有催化转录活性。我们针对gRNA4、7和8这3个打靶位点,构建相应的同源修复模板。将p AJ50-Cas9分别与p XL-BACII-gRNA4、p XL-BACII-g RNA7和p XL-BACII-g RNA8及其相应的同源修复模板进行显微共注射,提取后代的基因组,进行巢式PCR扩增鉴定,凝胶电泳没有发现扩增条带。扩增Ss-dpy-2第一个外显子测序,没有杂峰现象,说明Ss-dpy-2没有发生突变,CRISPR/Cas9系统仍然需要进一步探究。本研究对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型。通过粪类圆线虫雄虫的生殖细胞实现转基因,并解析Ss-rps-21启动子通过雄虫生殖细胞进行转基因F1代的表达谱。初步尝试构建适用于粪类圆线虫的CRISPR/Cas9系统,验证了Ss-rps-21和Sr-U6启动子活性,为后续的粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立奠定了坚实的基础。
马宏宇[4]（2017）在《东北地区蜱携带新型病毒的发现及鉴定》文中认为蜱是一类专性吸血性节肢动物,全世界已经发现800多种蜱,能传播200多种病原体,例如病毒、细菌和原虫等,其中病毒就有126种。我国蜱传病毒主要有TBEV、CCHFV、SFTSV等,且吉林、黑龙江省部分地区为自然疫源地。但是对其他蜱传病毒的报道相对较少,其在东北三省的流行本底尚未明确,因此对于蜱及蜱传病毒的研究就具有重要意义。本研究对2016年3-6月从吉林、黑龙江省8个市区林场采集的4318只蜱进行形态学和分子生物学鉴定,统计结果后挑选样品进行病毒宏基因组学研究,然后根据研究结果挑选3种注释量高的病毒,对采集的蜱进行PCR扩增、克隆、测序、同源性及进化树分析并对其进行细胞分离。为掌握吉林省、黑龙江省部分地区蜱种类及其携带病毒的情况,防止疾病跨种跨境传播进行预防性研究。蜱采集统计结果发现,在吉林省和黑龙江省8个市林场采集4318只蜱,共3属5种,全沟硬蜱数量最多,森林革蜱最少。病毒宏基因组研究结果发现南湾病毒、内罗毕病毒新种和森林脑炎病毒注释量高。然后对这三种病毒进行分子生物学检测,其中南湾病毒阳性率最高为0.65%,其次是内罗毕病毒新种和森林脑炎病毒,分别为0.55%和0.16%,为国际上首次在蜱中对南湾病毒和内罗毕病毒新种进行阳性率调查。发现三种病毒均流行于全沟硬蜱,南湾病毒和内罗毕病毒新种在嗜群血蜱中发现少量阳性,内罗毕病毒新种还流行于长角血蜱。本研究还成功分离并得到这三种病毒的电镜照片,为国际上首次从蜱内分离南湾病毒和内罗毕病毒新种并且得到电镜照片。
吴亚玲[5]（2016）在《上海地区规模化猪场蚊媒及其携带病毒的调查》文中指出蚊媒属于节肢动物门、昆虫纲、双翅目、长角亚目。蚊科分为3个亚科,即巨蚊亚科（Toxorhynchitinae）、按蚊亚科（Anophelinae）和库蚊亚科（Culicinae）,其种类繁多,迄今全世界已知种类达40个属,200多种。蚊媒病毒是由吸血蚊媒作为媒介进行传播的,主要是通过蚊媒叮咬敏感的脊椎动物。病毒首先在蚊媒的体内利用蚊媒自身的成分不断繁殖,然后蚊媒病毒再被蚊媒传给脊椎动物,最终引起人畜共患病,引起了很严重的公共卫生健康问题。蚊媒病毒病大多属于自然疫源性疾病,在流行季节从自然界捕获的媒介蚊媒分离蚊媒病毒,是了解当地蚊媒病毒流行的重要手段之一。上海市是全球最大的港口之一,人口密度大,流动性强,来自世界各地的大量人群和物资可携带各种蚊媒及其病原至上海市。尽管每年只有少量输入性蚊媒病病例报告,但在当前的环境下仍有可能形成蚊媒传染病发生的潜在风险。为有效预防控制蚊媒病的传播和流行,帮助疾病控制部门开展公共卫生安全保障工作,本研究于2014年对上海地区大型规模化猪场进行蚊媒与蚊媒病毒调查,分析了上海地区蚊种构成、分布及蚊媒病毒的携带情况,为上海当地的蚊媒及蚊媒病毒的预防控制提供依据。具体研究内容如下:试验一.上海地区蚊媒调查2014年6月、7月、8月集中在上海市闵行区,奉贤区,浦东区,嘉定区共11家大型规模化养猪场,采用紫外捕蚊灯进行捕获,前一晚的六点在猪场3 m高处悬挂捕蚊灯并打开开关至第二天的早晨六点收集样本。将蚊媒样本存放入随身携带的小冰箱内,立即送回实验室。送回实验室后根据实验需要可以先拿出一部分进行品种分选,后续实验用的先保存于实验室的液氮罐中。结果:此次试验共采集到3属7种30 396只蚊媒标本,其中三代喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）共采集了 28 856只,占捕获总数的95%;二代喙库蚊（Culex bitaeniohynchus）采集了 688只,占捕获总数的2.26%,中华按蚊（Anopheles sinensii）捕获的数量是789只,占总数的2.6%;其它4种不常见蚊媒（骚扰阿蚊、微小按蚊、致倦库蚊、淡色库蚊）共63只,占捕获总数的0.18%。试验二.上海地区蚊媒携带病毒的分离与鉴定将已经按照蚊媒品种分类的蚊媒样本进行充分的研磨,后经3日龄小鼠脑内扩增和细胞上（BHK-21和C6/36）增值。参考Genbank中常见的蚊媒病毒如乙型脑炎病毒、甲病毒、黄病毒、辛德毕斯病毒、版纳病毒的基因序列,应用primer5.0软件设计了特异性的引物,并通过RT-PCR扩增条带,回收产物,连接载体后送测序;同时使用间接免疫荧光法（IFA）进一步进行鉴定。结果:本次试验共分离到16株蚊媒病毒,其中8株是乙型脑炎病毒（2株来自猪源,其余6只来自蚊源）,8株版纳病毒（均来自蚊源）。试验三.上海地区蚊媒携带的乙型脑炎病毒的分子特征分析参考GenBank中已发表的JEV核苷酸序列,采用Primer 5.0软件设计了两对JEV特异性引物,使用QIAamp Virus RNA Mini Kit（Qiagen）试剂盒提取病毒RNA,对提取的RNA样品进行反转录以获得cDNA链,对反转录获得的cDNA样品进行扩增。测序结果经BLAST后,再利用DNAStar软件包及MEGA 4.0等软件进行序列分析、JEV进化树的构建,核苷酸序列和氨基酸序列比较及分析。用JEV分离株脑内接种3日龄小鼠,梯度稀释病毒后,依次加入培养有BHK-21细胞单层的96孔板,设置阴性对照孔,逐日记录病变孔数,通过Reed-Muench两氏法计算TCID50。结果表明:分离的8株JEV病毒都有较强的致病性,选用Chen等建立的JEV基因分型方法进行进化树构建分析,结果显示:此次分离到的8株JEV毒株,其中有4株为GⅠ（蚊源的有3株,猪源的1株）,有4株为GⅢ（蚊源的3株,猪源的1株）。8株分离株与经典毒株SA14-14-2的E基因核苷酸差异性为88%-98.2%,氨基酸差异性是86.5%-97.9%。JEV分离株之间的核苷酸差异是88.0%-100%,氨基酸差异是86.3%-100%。试验四.上海地区蚊媒携带的版纳病毒的分子特征分析在Genbank上下载版纳病毒序列,采用Primer 5.0软件设计了针对BAV第12片段的特异性引物,进行扩增回收,并连接T载体后送测序。测序结果经BLAST后,再利用DNAStar软件包及MEGA4.0等软件进行序列分析、BAV进化树的构建,核苷酸序列和氨基酸序列比较及分析。结果显示:上海首次分离到版纳病毒,版纳病毒的8个分离株之间的核苷酸序列比较,同源性都很高,可达99.5%～100%。与云南版纳株和北京版纳分离株的同源性分别为94.2-98.7%和98.3%-98.5%;与内蒙和印度尼西亚地区分离株的同源性分别为98.5%-98.8%和89.7%-90.7%;与匈牙利的版纳分离毒株亲缘性最远是44.5%-44.6%之间。此次分离的版纳病毒处于A2 一个较为独立的分支上,与北京和云南及内蒙分离株关系较近,即与A2亚型关系较近,与中国其它地区的分离株具有明显的差异性。
高晓艳[6]（2013）在《乙脑病毒时空动力学分析》文中研究表明乙型脑炎（Japanese Encephalitis, JE）,简称乙脑,是目前全世界无可争议的最严重的病毒性脑炎,发病率和病死率高,后遗症严重。乙脑病毒（Japanese Encephalitis virus, JEV）是蚊传虫媒病毒,可以被多种蚊虫携带和传播,猪是其主要的储存宿主,鸟被认为是乙脑病毒的传播宿主,人和马是乙脑病毒的终末宿主。本研究的目的是通过对优势基因型别乙脑病毒进行时空动力学研究分析,寻找乙脑病毒的播散规律和播散特点以及可能影响乙脑病毒传播的因素,预测乙脑病毒将来的分布变化趋势,为全球乙脑的预防控制提供依据。湖北省位于我国中南部,长江中游,每年降水充沛,具有丰富的蚊虫媒介种类。湖北省曾是蚊传虫媒病毒病乙脑的高发地区,湖北省是否还存在其他蚊传虫媒病毒,至今缺乏系统的调查研究。为系统了解湖北省蚊传虫媒病毒的分布情况及其种类,为当地虫媒病毒病的预防控制提供理论依据,本研究在2009年和2010年7-8月份,分别在湖北省的东西南北中挑选武穴市、通城县、恩施州、神农架林区、江陵县和随州市等6个地区进行蚊虫采集,并通过病毒分离和序列分析确定该地区的虫媒病毒种类、分布及分子生物学特征。1.乙脑病毒时空动力学分析本研究首先测定了中国2005-2010年在湖北、重庆、江西、山东、辽宁和云南省新分离的22株基因1型乙脑病毒的E基因序列,其中包括本研究2010年在湖北省新分离的乙脑病毒株,填补了湖北、重庆、江西等亚洲中部区域乙脑病毒的空白,为乙脑病毒时空动力学分析提供了条件。继而利用GenBank下载乙脑病毒序列,最终构建了本研究时空动力学分析所用的涵盖所有乙脑流行区域和多种媒介宿主的优势基因型别乙脑病毒序列数据集,共包括359株基因1型乙脑病毒的E基因序列。本研究采用贝叶斯马尔科夫蒙特卡洛方法对上述数据集进行乙脑病毒的分子进化分析,结果显示分布在不同区域的乙脑病毒形成了相对独立的病毒进化特征,并分别在亚洲最南部地区、亚洲东部沿海地区、亚洲西部地区和亚洲中部地区形成循环。进一步分析发现在以上4个地区形成的独立进化分支中都具有来自最南部地区的病毒,且最南部地区的病毒大都是每个分支中最早分化出来的病毒；另外,每个独立进化分支中最南部地区分离的毒株具有广泛的时间跨度,以上结果说明亚洲最南部地区分离的乙脑病毒既体现了种群多样性又维持了种群稳定性,提示亚洲大陆最南部地区在乙脑病毒向亚洲大陆传播的过程中担当了重要的源泉地区作用。本研究还讨论了乙脑病毒的传播路线,发现乙脑病毒在亚洲存在由南向北的传播特点,主要通过3条传播路线,而三条传播路线分别与候鸟在亚洲的迁徙路线吻合,提示候鸟在乙脑病毒远距离传播中发挥重要的作用。优势基因型别乙脑病毒的种群动态分析显示乙脑病毒在传播和地域播散过程中经历了平缓—快速增长—下降—平缓的种群变化。基于种群动态Skyline plots的时间节点对4个地域循环中毒株的分离时间进行分析,进一步证实了亚洲大陆最南部地区是乙脑病毒的源泉地区。乙脑病毒系统发生分析的结果显示乙脑病毒具有地域分布特征,但也存在毒株地域混合现象,提示乙脑病毒的分布分化机制除了族群结构分化外,还可能存在迁移事件（基因漂移）。因此,为详细地了解乙脑病毒的空间动力学特征,本研究还采用Migraphyla软件对乙脑病毒传播的空间动力学特征进行分析,结果显示乙脑病毒在亚洲的播散存在频繁的迁徙事件,迁徙事件也是促成乙脑病毒地域分布分化的重要方式。更进一步的分析发现,泰国、上海、山东、四川和越南是乙脑病毒重要的迁徙源泉地区。泰国是乙脑病毒向亚洲西部、东亚传播的主要源泉地区；上海维持了乙脑病毒在东亚沿海地区的循环；山东是乙脑病毒从沿海地区向中国内陆地区传播的源泉地区；四川维持了乙脑病毒在中国内陆的循环；而越南则是乙脑病毒从东南亚地区向中国内陆省份传播的源泉。2.湖北省虫媒病毒调查本研究在2009年和2010年的7-8月在分别在湖北省武穴市、通城县、恩施州、神农架林区、江陵县和随州市等6个地区采集蚊虫标本,共采集三带喙库蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、致倦库蚊和未分类杂蚊等3属5种共计22,269只蚊虫标本。三带喙库蚊是武穴市、通城县、随州市和江陵县的优势蚊种,致倦库蚊是恩施州的优势蚊种,在神农架林区主要采集到骚扰阿蚊。对所有标本分272批进行研磨和病毒分离,结果分离到42个阳性分离物,来自4个蚊种——三带喙库蚊、致倦库蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊。经过系统鉴定,共得到33株乙脑病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、6株盖塔病毒（Getah virus, GETV）（?）口4株版纳病毒（Banna virus, BAV）。从三带喙库蚊和致倦库蚊中分离到的病毒最多,分别是21株和15株,而且3种病毒都从三带喙库蚊中分离到；从恩施州分离的病毒最多,为31株；恩施州致倦库蚊中乙脑病毒的批次阳性率和现场最低感染率最高,分别为53.6%和1：103.3,其次是恩施州三带喙库蚊中乙脑病毒的批次阳性率和现场最低感染率最高,分别为44.4%和1：128.8。新分离病毒分子生物学特征分析显示,所有33株JEV均为基因Ⅰ型病毒,分离株之间E基因核苷酸和氨基酸序列同源性为98.7%-100%和99.8%-100%。新分离JEV与疫苗株SA14-14-2在E基因区段存在14处共同的氨基酸差异,但差异位点均不处于决定抗原性的关键氨基酸位点。新分离GETV与我国2002年分离株HB0234、YN0540和韩国2004年分离株Korea的进化关系最近,位于同一个进化分支中；而与俄罗斯分离株LEIV/16275的进化关系较远。新分离BAV第12片段核苷酸之间的同源性为100%,第12片段核苷酸和VP12蛋白序列中存在多个不同于其它地域分离株的共同差异位点,进化分析显示所有新分离株与中国北京和云南的分离株以及越南分离株处于同一亚群。本研究的意义本研究首次在全球范围内开展了乙脑病毒的时空动力学分析,阐明了乙脑病毒在亚洲的播散特征和播散方式,首次发现乙脑病毒的传播存在地域分布特征和播散源泉地区,首次发现迁徙事件是乙脑病毒重要的分布分化机制,并首次从系统进化角度揭示候鸟在乙脑病毒远距离传播中具有重要的作用。研究结果还提示乙脑病毒存在向欧洲等传统非流行区传播的可能性,为全球乙脑的预防控制提供了重要依据。本研究还对湖北省部分地区进行了虫媒病毒调查,分离到乙脑病毒、盖塔病毒和版纳病毒等3种虫媒病毒,并发现库蚊是湖北市携带病毒最多的蚊种。盖塔病毒和版纳病毒为湖北省首次分离；乙脑病毒在湖北的分离也填补了乙脑病毒在亚洲中部的空白,为乙脑病毒时空动力学分析提供了条件。本研究还明确了湖北省新分离病毒与国内外分离株之间的分子生物学差异,丰富了我国和湖北省虫媒病毒信息,为深入开展研究提供了基础数据,也为了解当地传染病病因以及积极预防和控制相关虫媒病毒疾病提供了重要的资料信息。
黄海楠[7]（2006）在《我国部分省区蜱传斑点热及其与莱姆病复合感染的流行病学调查研究》文中研究指明为调查我国部分省区蜱传斑点热的流行情况,本研究利用现场流行病学调查和分子生物学技术相结合的方法,从传播媒介、宿主动物、易感动物三个流行环节寻找发病和流行依据,对进一步制订该病的防治对策,指导其临床诊治提供科学依据。通过对各地区不同宿主动物、媒介带菌率的比较可以确定各地区的优势宿主动物以及主要媒介,对预防和控制疾病的传播与流行、降低误诊漏诊率有重要的流行病学意义。本研究选择黑龙江省、吉林省、内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区、浙江省和贵州省为调查点采集标本。利用PCR扩增OmpA基因片段的方法纵向检测和比较黑龙江省、吉林省、内蒙古自治区、浙江省、新疆维吾尔自治区和贵州省采集的鼠脏器中斑点热群立克次体的带菌率,特别在吉林地区从传播媒介、宿主动物、易感动物三个环节利用PCR和IFA检测斑点热群立克次体和莱姆病螺旋体的复合感染的情况。共检测了575只鼠,斑点热群立克次体的带菌率为12.0%,阳性率以新疆为首,内蒙古和贵州位居第二三名,其次是浙江和黑龙江,吉林为阴性,南北方的带菌率差异没有统计学意义。吉林珲春地区斑点热群立克次体在森林革蜱中带菌率显着高于全沟硬蜱;莱姆病在全沟硬蜱中的带菌率高于森林革蜱中的带菌率,但差异没有统计学意义。森林革蜱中的复合感染率显着高于全沟硬蜱中的复合感染率。在吉林的102只鼠中检测到13只鼠携带莱姆病螺旋体,阳性率12.7%,没有复合感染。用IFA检测了200份牛血清和203份绵羊血清,其中斑点热群立克次体的感染率分别为牛18.0%,羊19.2%;伯氏疏螺旋体的感染率为牛10.0%,羊15.8%,复合感染率为牛5.5%,羊7.9%。羊血清中斑点
毛贝,籍希平,张玉珲,李如森[8]（2004）在《新疆出血热的病理学观察及与临床联系的探讨》文中研究说明本文报道对2例完整、4例不全的新疆出血热尸体解剖材料进行病理组织学的观察结果。结果表明新疆出血热的基本病理改变是全身毛细血管的功能性障碍、主要脏器的弥漫性血管内凝血,实质脏器可见到程度和范围不同的细胞变性和坏死,而炎性细胞浸润不显,肾脏的病变轻微。本文对该病病原、出血机制、病理与临床联系等问题进行了分析和讨论,认为本病在病理与临床表现等方面有别于肾病综合症出血热,符合无肾病综合症出血热,并提出在临床治疗上要过“五关”,观察病情要“五注意”的建议。
冯崇慧,王冬莉,刘银[9]（2004）在《新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定》文中进行了进一步梳理1983年通过病毒形态学的鉴定,证明了新疆出血热病毒是布尼安病毒科（Bunyaviridae）的成员。本次通过血清学方法与布尼安病毒属的西姆波组SMB-48株和内罗病毒属的刚果病毒K2/61株的免疫腹水进行比较。采用补体结合试验、反向被动血凝抑制试验和双抗体夹心抑制ELISA试验进行鉴定的结果,发现新疆出血热病毒与布尼安病毒属的代表毒株SMB-48株没有血清学联系,而与内罗病毒属的刚果病毒有显着的抗原关系。从而证明新疆出血热病毒与布尼安病毒属无关。其抗原性与内罗病毒属克里米亚-刚果出血热病毒一致。
陈德蕙,冯崇慧,张德芳,张贺秋[10]（1983）在《新疆出血热病毒的形态学鉴定》文中进行了进一步梳理 新疆出血热是一种自然疫源性急性传染病,病死率较高。1965年在新疆维吾尔自治区某地曾发生过一起人群暴发。病人的临床表现有高热、全身皮下出血、鼻衄、尿血、便血和注射
二、新疆出血热的病理学观察及与临床联系的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新疆出血热的病理学观察及与临床联系的探讨（论文提纲范文）
（1）病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 病毒样颗粒疫苗的简介 |
| 1.1.2 病毒样颗粒疫苗的表达系统 |
| 1.1.3 病毒样颗粒疫苗发展面临的挑战和解决方案 |
| 1.2 寨卡病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 寨卡病毒的流行病学 |
| 1.2.2 寨卡病毒的分类 |
| 1.2.3 寨卡病毒结构和基因组结构 |
| 1.2.4 寨卡病毒的生命周期 |
| 1.2.5 寨卡病毒E蛋白的结构和功能研究 |
| 1.2.6 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3 脊髓灰质炎病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 脊髓灰质炎的流行现状 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒的生物学 |
| 1.3.3 脊髓灰质炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 克里米亚刚果出血热病毒的研究进展 |
| 1.4.1 CCHFV的生物学 |
| 1.4.2 CCHFV的临床流行病学 |
| 1.4.3 CCHF的预防 |
| 1.4.4 CCHFV疫苗的研究进展 |
| 1.4.5 CCHFV单克隆抗体的研究进展 |
| 1.5 本论文的研究内容和意义 |
| 第2章 寨卡病毒样颗粒的构建和免疫原性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒与菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 抗体与抗体制备 |
| 2.1.4 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.1.5 ZIKV病毒蛋白的表达和鉴定 |
| 2.1.6 ZIKV病毒样颗粒和病毒粒子的纯化与检测 |
| 2.1.7 ZIKV VLPs的免疫原性评价 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.2.2 ZIKV pr M和 E蛋白形成VLPs |
| 2.2.3 ZIKV VLPs的免疫原性研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于杆状病毒表达的VLP诱导合胞体现象的抗黄病毒药物筛选方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 抗体与抗体纯化 |
| 3.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.1.5 质粒的构建及转染实验 |
| 3.1.6 序列比对和进化分析 |
| 3.1.7 免疫荧光分析 |
| 3.1.8 ZIKV滴度测定(空斑实验) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导Sf9细胞形成合胞体 |
| 3.2.2 黄病毒E蛋白在Sf9细胞中的细胞定位研究 |
| 3.2.3 ZIKV prME和E蛋白形成VLPs |
| 3.2.4 基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体现象的抗病毒筛选 |
| 3.2.5 AMS通过影响病毒入侵抑制黄病毒感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 脊髓灰质炎病毒样颗粒的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 抗体与抗体制备 |
| 4.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 4.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PVⅡP1多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 4.2.2 重组杆状病毒的构建 |
| 4.2.3 PVⅡVP0,VP1和VP3 蛋白形成VLPs |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 克里米亚刚果出血热病毒样颗粒的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 抗体 |
| 5.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 5.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 重组杆状病毒v Ac-Gn Gc NP和 v Ac-Gn Gc的构建 |
| 5.2.2 CCHFV VLPs的纯化和鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株、质粒与细胞系 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc胞外区的诱导表达 |
| 6.1.4 单克隆抗体制备的流程 |
| 6.1.5 小鼠血清和杂交瘤细胞上清识别能力的检测 |
| 6.1.6 单克隆抗体线性识别位点的鉴定 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 小鼠血清的检测 |
| 6.2.2 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的筛选 |
| 6.2.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体识别表位的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc宿主相互作用组的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 抗体 |
| 7.1.4 细胞转染 |
| 7.1.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) |
| 7.1.6 非标定量质谱分析 |
| 7.1.7 生物信息学分析 |
| 7.1.8 免疫荧光和共聚焦实验 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 诱饵蛋白Gn/Gc及其宿主互作蛋白的SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 7.2.2 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的非标定量质谱分析 |
| 7.2.3 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 7.2.4 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的相互作用网络分析 |
| 7.2.5 间接免疫荧光验证质谱结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 线粒体 |
| 7.3.2 内质网 |
| 7.3.3 细胞骨架 |
| 7.3.4 外泌体和囊泡 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）中国新疆啮齿类动物和北方地区蜱携带荆门病毒的分子特征研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 中国新疆啮齿类动物携带荆门病毒的分子特征研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 啮齿类动物的采集及荆门蜱病毒的筛查 |
| 3.2 荆门蜱病毒在啮齿类动物各组织器官的感染情况 |
| 3.3 啮齿类动物荆门蜱病毒基因组结构特征分析 |
| 3.4 啮齿类动物荆门蜱病毒同源性分析 |
| 3.5 啮齿类动物荆门蜱病毒系统发生分析 |
| 3.6 啮齿类动物系统发生分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 中国北方地区蜱携带荆门病毒的分子特征研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 蜱的采集及荆门蜱病毒的筛查 |
| 3.2 蜱荆门蜱病毒同源性分析 |
| 3.3 蜱荆门蜱病毒系统发生分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 荆门病毒的生物学特征、流行现况和遗传进化规律 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 已发表文章 |
| 致谢 |
（3）粪类圆线虫感染沙鼠模型的建立及CRISPR/Cas9基因敲除方法的初步尝试（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 寄生线虫概述 |
| 1.2 粪类圆线虫简介概述 |
| 1.2.1 粪类圆线虫生活史 |
| 1.2.2 粪类圆线虫形态学 |
| 1.2.3 粪类圆线虫病的症状及其流行病学 |
| 1.2.4 粪类圆线虫的诊断,治疗和防控 |
| 1.3 沙鼠属研究概述 |
| 1.3.1 长爪沙鼠生物学特征 |
| 1.3.2 子午沙鼠生物学特征 |
| 1.4 秀丽隐杆线虫的dpy-2基因的相关研究 |
| 1.5 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9系统基本结构和作用机制 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9系统在寄生虫领域的应用 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物及试验用菌株、载体 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验溶液的配置 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 虫体的收集及实验动物感染模型的建立 |
| 3.3.2 生物信息学网站及软件 |
| 3.3.3 DNA的提取 |
| 3.3.4 RNA的提取 |
| 3.3.5 粪类圆线虫18SrRNA基因的扩增及测序 |
| 3.3.6 构建粪类圆线虫转基因质粒 |
| 3.3.7 粪类圆线虫CRISPR/Cas9系统的构建 |
| 3.3.8 构建gRNA打靶质粒 |
| 3.3.9 gRNA靶点切割效率检测实验 |
| 3.3.10 反转录PCR |
| 3.3.11 巢式PCR扩增 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 长爪沙鼠和子午沙鼠感染粪类圆线虫模型的建立 |
| 4.1.1 1000条感染性三期幼虫(iL3)感染长爪沙鼠 |
| 4.1.2 170条感染性三期幼虫(iL3)感染长爪沙鼠 |
| 4.1.3 1000条感染性三期(iL3)感染子午沙鼠 |
| 4.1.4 寄生在长爪沙鼠体内寄生雌虫的鉴定 |
| 4.1.5 寄生在长爪沙鼠体内寄生雌虫的观察 |
| 4.1.6 粪类圆线虫寄生雌虫和自感染三期的DIC和激光共聚焦观察 |
| 4.1.7 比格犬、长爪沙鼠和子午沙鼠体内寄生雌虫和自感染三期的体长、直径参数的测定 |
| 4.1.8 比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠感染粪类圆线虫前后血液生理值、血清生化值的测定 |
| 4.1.9 感染的比格犬、长爪沙鼠和子午沙鼠十二指肠HE染色 |
| 4.2 通过粪类圆线虫雄虫生殖细胞的转基因研究 |
| 4.2.1 pAJ20转基因自由生活雌虫的表达谱 |
| 4.2.2 pAJ20转基因自由生活雄虫的表达谱 |
| 4.3 粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除方法的初步尝试 |
| 4.3.1 候选敲除基因Dumpy-2的生物信息学分析 |
| 4.3.2 候选敲除基因Dumpy-2的扩增 |
| 4.3.3 pAJ50-Cas9质粒的构建 |
| 4.3.4 pXL-BACII-gRNA载体的构建 |
| 4.3.5 gRNA靶点效率检测 |
| 4.3.6 构建同源修复模板 |
| 4.3.7 反转录PCR |
| 4.3.8 显微注射和检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 理想的粪类圆线虫实验动物模型建立和分析 |
| 5.2 通过粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究 |
| 5.3 影响CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用的因素 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（4）东北地区蜱携带新型病毒的发现及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蜱虫 |
| 1.2 蜱传疾病 |
| 1.3 病毒宏基因组学 |
| 第二章 吉林省、黑龙江省蜱种调查及病毒宏基因组测序 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 森林脑炎病毒、南湾病毒和内罗毕病毒新种的阳性率调查和分离鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 附表 RNA病毒宏基因组学病毒注释信息 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）上海地区规模化猪场蚊媒及其携带病毒的调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 蚊媒及其携带病毒的研究进展 |
| 1 蚊媒的分类及危害 |
| 2 蚊媒携带病毒的流行和危害 |
| 第二章 乙型脑炎病毒的研究进展 |
| 1 乙型脑炎病毒的流行病学情况 |
| 2 乙型脑炎的基因组结构 |
| 3 乙型脑炎病毒的预防与控制 |
| 第三章 版纳病毒的研究进展 |
| 1 版纳病毒的流行病学情况 |
| 2 版纳病毒的蚊媒媒介 |
| 3 版纳病毒地理因素分析 |
| 4 版纳病毒的分子生物学研究 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 上海地区蚊媒调查 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 蚊媒采集的数量及品种统计 |
| 2.2 采集的蚊媒种类在各区域所占的比例 |
| 3 讨论 |
| 3.1 蚊媒采集的数量及品种统计 |
| 3.2 采集的蚊媒种类在各区域所占的比例 |
| 第五章 上海地区蚊媒携带病毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 采集样品的背景 |
| 2.2 上海地区蚊媒携带病毒的分离 |
| 2.3 上海地区蚊媒携带病毒的鉴定 |
| 2.4 上海地区分离毒株阳性率比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 采集样品的背景 |
| 3.2 上海地区蚊媒携带病毒的分离 |
| 3.3 上海地区蚊媒携带病毒的鉴定 |
| 3.4 上海地区分离毒株阳性率比较 |
| 第六章 上海地区蚊媒携带的乙型脑炎病毒的分子特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 分离的8株JEV毒株的进化树分析 |
| 2.2 分离的8株JEV分离株与SA14-14-2 E基因同源性分析 |
| 2.3 分离的8株JEV分离株碱基替代情况 |
| 2.4 新分离病毒株的病毒滴度分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 分离的8株JEV毒株的进化树分析 |
| 3.2 分离的8株JEV分离株与SA14-14-2 E基因同源性分析 |
| 3.3 分离的8株JEV分离株碱基替代情况 |
| 3.4 新分离病毒株的病毒滴度分析 |
| 第七章 上海地区蚊媒携带的版纳病毒的分子特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 版纳病毒分离株的进化树分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 版纳病毒分离株的进化树分析 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（6）乙脑病毒时空动力学分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 乙脑病毒的时空动力学分析 |
| 前言 |
| 第一节 乙脑病毒分布研究及乙脑病毒基因序列分析数据集的构建 |
| 第二节 乙脑病毒系统进化和种群历史分析 |
| 第三节 乙脑病毒的空间动力学分析 |
| 第二部分 湖北省蚊传虫媒病毒调查与病毒分子特征分析 |
| 前言 |
| 第一节 湖北省蚊虫标本采集和病毒分离 |
| 第二节 湖北省蚊传虫媒病毒分离物的鉴定和分子特征研究 |
| 第三部分 病毒性脑炎病人脑脊液标本病原体的检测 |
| 1.材料方法 |
| 2.结果与分析 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 我国新分离虫媒病毒及其感染 |
| 附表 湖北省蚊虫标本采集记录表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）我国部分省区蜱传斑点热及其与莱姆病复合感染的流行病学调查研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 蜱及蜱媒传染病 |
| 第二章 我国斑点热群立克次体研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 不同省区鼠中斑点热群立克次体感染的调查研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 吉林珲春地区蜱和鼠中斑点热群立克次体和伯氏疏螺旋体复合感染的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 吉林珲春地区家畜中斑点热群立克次体与伯氏疏螺旋体复合感染的血清学调查研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（8）新疆出血热的病理学观察及与临床联系的探讨（论文提纲范文）
| 1 材料来源 |
| 2 结果 |
| 2.1 体表观察: |
| 2.2 体腔观察: |
| 2.3 各内脏检查: |
| 2.3.1 心脏: |
| 2.3.2 肺及气管: |
| 2.3.3 肝: |
| 2.3.4 胆囊: |
| 2.3.5 胰腺: |
| 2.3.6 食道: |
| 2.3.7 胃及肠: |
| 2.3.8 脾: |
| 2.3.9 淋巴腺: |
| 2.3.10 骨髓: |
| (1) 粒细胞: |
| (2) 红细胞: |
| (3) 淋巴细胞: |
| (4) 单核细胞: |
| (5) 网状细胞: |
| 2.3.11 垂体: |
| 2.3.12 肾上腺: |
| 2.3.13 甲状腺: |
| 2.3.14 胸腺: |
| 2.3.15 脑及中枢神经系: |
| 2.3.16 肾、肾盂及输尿管: |
| 2.4 基本病理变化: |
| 3 讨论 |
| 3.1 病原问题: |
| 3.2 引起毛细血管扩张、充血及通透性、脆性增加的机制: |
| 3.3 关于出血的机制: |
| 3.4 肾及肝的病理变化对认识本病的启示: |
| 3.5 病理与临床的联系: |
（9）新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒抗原: |
| 1.2 免疫血清和免疫腹水: |
| 1.3 补体结合试验: |
| 1.4 反向被动血凝抑制试验: |
| 1.5 酶联免疫吸附试验: |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
四、新疆出血热的病理学观察及与临床联系的探讨（论文参考文献）
- [1]病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究[D]. 戴诗雨. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [2]中国新疆啮齿类动物和北方地区蜱携带荆门病毒的分子特征研究[D]. 余竹梅. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [3]粪类圆线虫感染沙鼠模型的建立及CRISPR/Cas9基因敲除方法的初步尝试[D]. 胡锦阳. 华中农业大学, 2018(01)
- [4]东北地区蜱携带新型病毒的发现及鉴定[D]. 马宏宇. 吉林农业大学, 2017(02)
- [5]上海地区规模化猪场蚊媒及其携带病毒的调查[D]. 吴亚玲. 南京农业大学, 2016(04)
- [6]乙脑病毒时空动力学分析[D]. 高晓艳. 中国疾病预防控制中心, 2013(12)
- [7]我国部分省区蜱传斑点热及其与莱姆病复合感染的流行病学调查研究[D]. 黄海楠. 吉林大学, 2006(09)
- [8]新疆出血热的病理学观察及与临床联系的探讨[J]. 毛贝,籍希平,张玉珲,李如森. 地方病通报, 2004(S1)
- [9]新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定[J]. 冯崇慧,王冬莉,刘银. 地方病通报, 2004(S1)
- [10]新疆出血热病毒的形态学鉴定[J]. 陈德蕙,冯崇慧,张德芳,张贺秋. 中华病理学杂志, 1983(03)