一、原始生殖细胞体外培养及应用研究（论文文献综述）
康宇[1]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究说明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
李树斌[2]（2020）在《小鼠卵原干细胞分离建系及其体外分化形成功能性卵母细胞的研究》文中指出本论文首先利用差速贴壁法分别从出生7天后（7 days post parturition,7dpp）的新生小鼠以及4周龄（4 Weeks,4W）的青春期小鼠卵巢中分离、富集OSCs,分别命名为7dpp-putative OSCs以及4W-putative OSCs,经过体外培养传代、细胞形态观察、碱性磷酸酶染色、RT-PCR标志基因表达水平检测、细胞免疫荧光染色、体内卵巢移植实验以及转录组测序（RNA-seq）等技术手段,鉴定、分析从不同周龄小鼠卵巢中分离获得的细胞生物学特性。实验结果表明在体外培养过程中两种细胞在形态上具有很大差异,7dpp-putative OSCs形成串状克隆,细胞连接紧密,经过传代培养后细胞增殖聚集成簇;4W-putative OSCs部分细胞聚集形成较为立体的克隆,经过传代培养后克隆逐渐变为扁平上皮状。在基因表达水平上,7dpp-putative OSCs表达Oct4、Blimp1、Ddx4等生殖干细胞标志基因及蛋白,而4W-putative OSCs不表达Blimp1基因,同时Oct4、Ddx4表达水平较低,但Ifitm3、Cdh1表达水平较高。RNA-seq结果表明两种细胞基因表达模式差异显着,7dpp-putative OSCs中高表达的基因显着富集与生殖细胞、干细胞生物学过程,而4W-putative OSCs高表达基因显着富集于上皮细胞迁移、增殖相关的生物学过程。卵巢体内移植实验结果表明,7dpp-putative OSCs可以在体内卵巢分化形成卵子,而4W-putative OSCs并不能分化形成卵子,因此7dpp-putative OSCs是真正意义上的雌性生殖干细胞。本论文进一步分析了从出生后7天的小鼠卵巢中分离获得的OSCs是否具有在体外分化形成卵子的能力。在该部分,本论文从出生后7天的GFP小鼠卵巢中分离OSCs,并命名为7dpp-GFP-OSCs。与野生型小鼠（GFP阴性）卵巢体细胞体外共培养,通过形态学观察、卵母细胞体外成熟、卵胞浆单精子注射、胚胎移植以及Sycp3免疫荧光染色等方法,鉴定7dpp-GFP-OSCs是否能够与卵巢体细胞聚合形成重组卵泡以及7dpp-GFP-OSCs在体外是否可以通过减数分裂分化形成具有产生后代能力的卵母细胞。结果发现,7dpp-GFP-OSCs可以由有丝分裂转变为减数分裂,并能够与卵巢体细胞在体外聚合形成重组卵泡,经过体外培养,重组卵泡可由原始卵泡逐渐发育至有腔卵泡,体外成熟后,重组卵泡来源的卵子可以释放第一极体,发育至MII阶段,成熟率超过65.00%。卵子经过卵胞浆单精子注射及胚胎移植后,可以获得健康子代。最后本论文利用RNA-seq及荧光定量PCR分析了小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）、原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）以及OSCs之间的基因表达差异,结果表明在多能性相关基因表达水平上,OSCs显着低于ESCs,其表达水平与PGCs相近;在生殖细胞特异基因表达水平上,OSCs高于ESCs,与PGCs相近;在减数分裂基因表达水平上,OSCs显着低于PGCs。综上所述,本论文证明了新生小鼠的卵巢的确存在OSCs,这类OSCs不但能够在体外进行复制增殖,而且也能够进入减数分裂分化形成卵子,与卵巢体细胞共培养后可以发育形成重组卵泡,并完成卵泡体外生长、卵母细胞成熟,分化产生具有受精能力的正常卵子。本论文的实验结果为研究哺乳动物卵泡发育、卵子发生等研究奠定了一个技术平台,也为进一步研究女性卵子、卵泡发生的研究奠定了基础。
韦茏芹[3]（2020）在《鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证》文中认为转基因鸡输卵管生物反应器具有高产蛋能力,转基因鸡群快速扩繁能力和与人类相似的蛋白糖基化形式,在药用蛋白生产方面具有不可替代的作用。到目前为止,相继建立了鸡蛋卵白（eggwhite）中表达干扰素、溶菌酶、抗体、促红细胞生成素、表皮生长因子等重组蛋白的转基因鸡。但是对于不同长度卵清蛋白启动子（OVP）活性,以及雌激素应答元件（ERE）和卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）调控作用缺乏系统研究;其次,作为外源基因转移的有效载体,鸡原始生殖细胞（PGCs）分离培养方法也待探讨。本研究的目的是确定鸡OVP核心区域,筛选高转录活性的OVP;探讨ERE和COUP-TF调控作用;摸索鸡PGCs适宜培养方法;通过体外和体内验证试验,确定可望用于制备输卵管生物反应器的OVP。1.CRISPR-d Cas9-VP64介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析。将启动子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分别亚克隆至p GL3-Basic载体,构建了荧光素酶表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785、p GL3-cOVP-2785。利用Lipofectamine?2000将上述2个质粒以及p GL3cOVP-1548分别与p RL-TK质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估三个启动子的转录活性。利用在线软件Optimized CRISPR Design,依据鸡卵清蛋白（OVA）基因第一内含子、转录起始位点上游区域DNA序列,共设计11对sg RNA;依据鸡ERE序列设计了2对sg RNA,分别构建了11个p GL3-U6-OVPsg RNA和2个p GL3-U6-EREsg RNA重组质粒;将p GL3-cERE-cOVP-2785、pc DNAd Cas9或pc DNA-d Cas9-VP64质粒分别与单个或多个sg RNA表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估启动子和ERE对荧光素酶表达的影响。结果表明,（1）cERE-cOVP-2785启动子片段的转录活性最高,cOVP-2785次之;（2）d Cas9-VP64对荧光素酶激活效应强于d Cas9;（3）多个sg RNA引导的d Cas9-VP64转录激活效应优于单个sg RNA;（4）第1内含子和转录起始位点上游以及ERE区域每个sg RNA均能靶向激活荧光素酶表达。（5）培养液中添加雌激素显着提升荧光素酶表达水平。2.鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ（COUP-TFⅠ/Ⅱ）功能分析。构建pcDNA3.1-His C-COUP-TFⅠ及pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ重组质粒,利用Lipofectamine?2000分别或共同将pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅠ和pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ与p GL3-cERE-cOVP-2785或p GL3-cOVP-2785以及p RL-TK质粒共转染293 T细胞,检测荧光素酶活性,以此评估COUPTFⅠ/Ⅱ对荧光素酶表达调控作用。结果表明,（1）COUP-TFI/II与cEREOVP2785联合作用,上调荧光素酶表达,发挥正调控作用;（2）COUP-TF I/II与OVP2785联合作用,下调荧光素酶表达,呈现负调控作用;（3）COUPTFI和COUP-TFII两个转录因子发挥协同作用,调控荧光素酶表达,且COUP-TFⅡ调控作用大于COUP-TFⅠ。3.鸡原始生殖细胞（PGCs）的分离及培养。分别采用Ficoll密度梯度离心法和酶消化法从HH-14期鸡胚血液和HH-28期鸡胚性腺中分离PGCs,分别接种至BRL、STO和CEF饲养层上,比较PGCs增殖能力,并对其生物学特性加以鉴定;此外,对DMSO和乙二醇的冻存效能进行了对比研究。结果表明,（1）来自性腺的PGCs（g PGCs）增殖能力优于来自血液的PGCs（b PGCs）;（2）以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,可以使PGCs连续培养100天以上,是鸡PGCs培养的优选方法;（3）鸡PGCs对PAS和AKP染色,以及SSEA-1免疫荧光染色均呈现阳性反应,在体外分化培养时能形成类胚体;（4）与10%DMSO相比,用10%乙二醇冻存的鸡PGCs复苏后成活率较高,是鸡PGCs适宜的冻存剂。4.鸡卵清蛋白启动子体内外功能验证。采用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent,将慢病毒载体p Lenti6.4/cERE-cOVP-2785/c SLP-EGFP与包装质粒ps PAX2和p MD2.G以及p RSV-Rev共转染293T细胞,超速离心法浓缩慢病毒,La SRT法测定慢病毒滴度。慢病毒体外感染鸡OECs、鸡性腺PGCs以及293T细胞,以EGFP表达效率体外验证cERE-cOVP-2785功能;慢病毒注射2.5日龄鸡胚背主动脉,换壳培养,直至出壳。荧光蛋白手电筒和配套滤镜观察鸡胚性腺EGFP表达效率,PCR检测EGFP整合效率,体内验证cERE-cOVP-2785功能。结果表明,（1）EGFP在鸡OECs、性腺PGCs均有表达,但在293T细胞中没有表达,说明该启动子具有组织特异性;（2）EGFP在鸡胚性腺中表达,且EGFP可整合宿主性腺基因组,表明cERE-cOVP-2785能有效驱动外源基因在性腺中表达,但转基因表达稳定性尚需进一步验证。结论:卵清蛋白基因转录起始位点上游-54～-807bp区域和第1内含子均为卵清蛋白启动子核心序列;cERE-cOVP-2785是适宜的卵清蛋白启动子,因为其转录活性高,ERE具有增强子作用;COUP-TFⅠ/Ⅱ与cERE-cOVP-2785,对下游基因发挥正调控作用;以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,是鸡g PGCs培养的优选方法;启动子cERE-cOVP-2785可以有效驱动EGFP体外和体内特异性表达,有望用于输卵管特异性表达转基因鸡研究。
李婷婷[4]（2019）在《水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究》文中研究表明水牛作为中国南方畜牧业中的重要家畜,不仅饲料转化率、乳制品的营养价值高,而且抗病力强,耐粗饲,具有较高的经济价值。然而水牛繁殖周期长,优质水牛数量少,水牛优良品种的培育成为了目前亟待解决的问题。精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是哺乳动物进行基因修饰和种系保存的理想种子细胞,由于其在医学、畜牧学等领域的广阔应用前景,受到越来越多的关注。水牛SSCs体外培养相关研究目前仍处于初级阶段,水牛SSCs尚未实现体外长期培养,原因可能在于对水牛SSCs所处微环境缺乏足够的了解,对水牛SSCs自我更新和分化等相关机制还知之甚少。本研究对比了不同培养体系对幼年水牛SSC-like cells体外培养的影响,利用转录组学手段,以曲细精管和类精原干细胞（spermatogonial stem cell-like cells,SSC-like cells）为研究对象,在成年水牛和幼年水牛间开展了差异转录组学分析,筛选调控水牛SSC-like cells自我更新的关键信号通路,挖掘关键基因。本研究的结果能为水牛SSCs自我更新和增殖相关机制及体外长期培养系统等研究提供一定的参考。本研究的内容和结果如下:（1）比较了不同体系对水牛SSC-like cells体外培养的影响。结果显示:与成分不明的培养体系相比,成分明确的培养体系在体外维持幼年水牛SSC-like cells表型的时间更长（6 d vs 10 d）,且能更好地维持幼年水牛SSC-like cells的分子特性。（2）开展了对成年和幼年水牛曲细精管转录组研究。结果显示:以幼年（4月龄）水牛睾丸的曲细精管和成年（2-3岁）水牛睾丸的曲细精管为研究对象,共鉴定到了17299个基因,其中表达量具有显着性差异的基因一共有13174个（差异倍数>2;P<0.05）。相对于成年水牛曲细精管而言,幼年水牛曲细精管上调表达基因参与的生物进程主要是关于细胞膜表面蛋白质的表达、定位和识别,与未分化精原细胞表面抗原的形成、识别或者归巢等行为密切相关;而下调表达基因主要参与的生物进程则是与精子分化形成密切相关的过程。同时还富集到了8条在曲细精管中可能调控水牛SSCs自我更新的信号调控通路及4个关键基因:MYC、FZD10、ID4和CCL27。（3）利用单细胞转录组学技术,开展了成年和幼年水牛SSC-like cells差异转录组研究。结果显示:以幼年（4月龄）水牛SSC-like cells和成年（2-3岁）水牛SSC-like cells为研究对象,共鉴定到了21803个基因,其中表达量具有显着性差异的基因一共有1419个（差异倍数>2;P<0.05）。相对于成年水牛SSC-like cells而言,幼年水牛SSC-like cells上调表达基因参与的生物进程主要是脂质代谢、细胞表面受体信号通路、迁移过程等与干细胞自我更新状态的维持以及与干细胞的迁移相关的生物进程;而下调表达基因主要参与的生物进程则是细胞减数分裂周期、减数分裂细胞周期过程以及雄性配子的生成等与后期配子形成及分化相关的生物进程。共富集到了151条可能与水牛SSCs自我更新、增殖迁移等调控过程密切相关的信号通路以及与通路相应的关键基因。总之,本研究通过水牛曲细精管及SSC-like cells差异转录组学分析及水牛SSC-like cells体外培养初步研究,为进一步探究水牛SSC-like cells体外自我更新机制以及长期培养等研究提供了丰富的参考数据,也为探究水牛SSC-like cells成分明确的体外培养体系奠定了一定的研究基础。
莫丽芬[5]（2019）在《鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究》文中研究表明诱导多能干细胞（Induced Pluripotent stem Cell,iPSC）具有分化成多种类型细胞的潜能。其中iPSC在体外诱导分化成生殖细胞对于畜禽保种育种、转基因动物以及发育生物学研究具有重要的意义。Dazl是调控生殖细胞发育与分化的关键因子,是生殖细胞鉴定的主要标志物。由于Dazl在iPSC不表达,因此可以作为报告基因追踪iPSC诱导分化为生殖细胞的过程。本研究利用 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）技术介导的同源末端连接（Homology-Mediated End Joining,HMEJ）将红色荧光蛋白基因mCherry定点敲入鸡内源Dazl基因第10个内含子处,通过Dazl启动子驱动mCherry表达,从而精确追踪内源Dazl在iPSC分化为原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）的过程中的表达情况。具体研究结果如下:（1）DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定。我们首先克隆鸡Dazl基因,制备DAZL多克隆抗体。纯化的抗体对鸡PGC进行Western blot,结果显示DAZL抗体能识别PGC中的特异性条带,相对分子量为33KDa,与预测分子量一致,说明DAZL抗体特异性高。q-PCR和免疫荧光染色结果显示DAZL在iPSC中不表达,在PGC中高表达,说明Dazl能作为报告基因追踪生殖细胞的特异性。（2）Dazl荧光报告载体的构建和定点敲入验证。首先针对Dazl基因设计和构建hpl80-sgRNA-spCas9表达载体和打靶供体质粒pDazl-HMEJ donor。然后将hpl80-sgRNA-spCas9转染DF-1细胞,验证CRISPR/Cas9系统的切割Dazl基因的效率。T7E1酶切鉴定证明hp180-sgRNA-spCas9质粒有效靶向目的位点实现基因敲除。而后将hpl80-sgRNA-spCas9表达载体和pDazl-HMEJ donor报告载体共转染PGC和iPSC,成功建立Dazl-mCherry+/EGFP+ PGC细胞系和Dazl-mCherry/EGFP+ iPSC细胞系。（3）Dazl荧光报告系统示踪PGC细胞迁移和iPSC细胞分化。本实验将Dazl-mCherry+/EGFP+标记的PGC细胞移植到15HH的鸡胚血液系统,结果显示细胞会随着血脉系统迁移并归巢到性腺,并且在新生鸡的睾丸继续发育。说明Dazl荧光报告系统能追踪生殖细胞的迁移。最后,我们将Dazl-mCherry/EGFP+标记的iPSC制作类配体（Embryoid body,EB）,并用EB培养液诱导,3天后形成的EB同时表达mCherry和EGFP。将EB收集检测生殖细胞特异性基因的和多能性相关基因的表达,q-PCR结果显示生殖细胞特异性基因显着上调,多能性相关基因显着下调。说明Dazl荧光报告系统在iPSC体外诱导分化过程中可起指示作用。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术建立鸡Dazl荧光报告系统,追踪生殖细胞的迁移和体外分化。通过可视化诱导iPSC获得生殖细胞,将为进一步利用iPSC进行珍稀禽类保种育种、转基因鸡制备以及发育生物学研究的奠定基础。
文冬梅[6]（2019）在《E2与FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖和凋亡的影响》文中研究说明卵泡发育主要是卵泡颗粒细胞（GCs）和内膜细胞（TCs）增殖的结果,卵泡颗粒细胞和内膜细胞的增殖主要依赖于雌二醇（E2）和促卵泡素（FSH）的共同作用。水牛的繁殖率低,超数排卵效果一直很不理想。为提高水牛的超数排卵效果,本研究探讨了E2和FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖和凋亡的影响,以便为建立水牛超数排卵的技术方法奠定理论依据。研究取得结果如下:1.不同浓度FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖的影响采用FSH（0、2、8、14、20、26μg/mL）处理水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞24 h后,检测细胞的增殖情况,结果显示:14、20、26 μg/mL组的细胞增殖水平显着高于对照组、2μg/mL和8μg/mL组（p<0.05）,而14、20、26μg/mL三组间无显着差异（p>0.05）。2.E2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖的影响不同浓度的E2（0、0.5、1、2、4ng/mL）联合FSH（14μg/mL）分别处理水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞24h,E2=0ng/mL、FSH=00μg/mL为对照组,检测细胞的增殖情况,结果发现:E2（1 ng/mL）+FSH组的颗粒细胞增殖水平显着高于对照组、FSH（14 μg/mL）单独处理组和E2（0.5 ng/mL）+FSH组（p<0.05）;而E2（1 ng/mL）+FSH组的内膜细胞增殖水平显着高于其余各组（p<0.05）。因此,以下所有试验主要以E2=0ng/mL、FSH=0 μg/mL为对照组,分别对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞进行FSH（14μg/mL）单独处理和E2（1 ng/mL）+FSH（14 μg/mL）联合处理。3.E2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞凋亡的影响24小时后,检测细胞凋亡情况,结果显示:E2+FSH联合处理组的细胞死亡率和早期凋亡率显着低于FSH单独处理组和对照组（p<0.05）,而存活率显着高于FSH单独处理组和对照组（p<0.05）。4.E2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞受体基因表达的影响24小时后,检测受体基因的表达情况,结果显示:E2+FSH联合处理组细胞中FSHR、LHR的mRNA表达量显着高于对照组和FSH单独处理组;而颗粒细胞中ER-β的mRNA表达量显着低于对照组（p<0.05）,但与FSH单独处理组无显着差异（p>0.05）;内膜细胞中ER-β的mRNA表达量显着低于对照组和FSH单独处理组（p<0.05）。5.E2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖基因表达的影响24小时后,检测细胞增殖基因的表达情况,结果显示:E2+FSH联合处理组细胞中PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2的mRNA表达量显着高于对照组和FSH单独处理组（p<0.05）。6.E2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞凋亡基因表达的影响24小时后,检测凋亡基因的表达情况,结果显示:E2+FSH联合处理组水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞中Bcl-2的mRNA表达量显着高于对照组和FSH单独处理组,且Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达量显着低于对照组（p<0.05）。以上结果表明,FSH（14 μg/mL）或E2（1 ng/mL）+FSH（14 μg/mL）联合作用均能够促进水牛GC和TC的增殖,并抑制细胞凋亡,但E2+FSH联合作用的效果优于FSH单独处理。E2+FSH的联合作用可能是通过提高激素受体FSHR、LHR mRNA的表达,抑制ER-β mRNA的表达,提高了水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞对FSH和LH的应答能力,从而促进增殖基因PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2和凋亡抑制基因Bcl-2的表达,抑制促凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达,最终促进水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖,且抑制细胞的凋亡。因此,在应用FSH对水牛进行超数排卵处理时,注射E2将有望提高水牛的超数排卵效果。
高菲[7]（2017）在《利用piggyBac转座子及CRISPR文库规模化制备突变体鸡的研究》文中进行了进一步梳理鸡是十分重要的发育生物学模式动物,制备鸡的遗传修饰动物模型意义重大。首先,可利用鸡的输卵管生物反应器生产药用蛋白;其次,可利用遗传修饰技术促进家禽分子育种,制备具有优良农业生产性状的新品种;最后,可结合遗传修饰技术制备基因敲除模型进而深入解析基因功能。然而,有关鸡的遗传修饰研究却进展缓慢。截止目前,制备鸡的遗传修饰动物模型主要面临以下问题:具备生殖系嵌合潜能的鸡原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）体外培养难度大且缺乏高效的遗传修饰手段;纯合突变个体制备周期长,技术难度大且未能规模化制备;缺乏稳定的雄性不育受体鸡品系,进而使得获得高效生殖系嵌合体的难度加大。针对以上问题,本课题通过优化培养条件建立鸡PGCs稳定的体外培养体系;利用piggyBac转座子系统与CRISPR/Cas9技术相结合构建鸡的全基因组单链导向RNA（Single guide RNA,sgRNA）文库,规模化制备突变体;结合Tet-On与TMP双调控系统实现靶细胞凋亡,探索雄性不育受体鸡的制备。本研究从饲养层细胞的种类及处理方法、培养液组分等条件针对鸡的PGCs体外培养条件进行优化,最终建立鸡PGCs稳定的体外培养体系。本研究分别从白来航鸡胚胎的性腺组织、农大3号鸡胚胎的生殖新月区及性腺组织成功分离并体外培养获得39株PGC系。这些细胞系在体外可无限增殖,碱性磷酸酶呈阳性,具有正常的二倍体核型。RT-PCR结果显示,分离得到的PGCs可表达生殖细胞标志基因CVH和DAZL。免疫荧光染色结果进一步表明CVH和DAZL呈阳性,干细胞表面抗原SSEA-1和SSEA-4在PGCs中高表达,SSEA-3在PGCs中微弱表达。此外,利用piggyBac转座子系统成功实现了 PGCs的稳定转染,并通过开天窗显微注射法高效获得G0代生殖系嵌合体,随后通过传代实验成功获得G1代阳性个体。结合Southern Blot及Genome Walking技术针对G1代阳性个体进行分析,发现外源基因为单拷贝插入,插入位点位于鸡14号染色体Fam20C基因的第4个内含子中。本研究利用生物信息学方法针对鸡的全基因组编码基因进行sgRNA的靶点设计,利用芯片合成技术共合成93961条sgRNAs序列,共涵盖鸡的16821个基因,平均每个基因设计了 5-6个sgRNAs。结合Tet-On调控的CRISPR/Cas9和piggyBac介导的sgRNA文库成功制备稳定转染的PGC系。利用该细胞系成功制备了阳性的G0代嵌合体,且在细胞水平及个体水平灵活响应DOX调控。此外,对两只G0代嵌合体睾丸进行sgRNAs的深度测序,经分析发现,共检测到102个针对不同基因的sgRNAs,且每个sgRNA靶向的基因均匀分布在鸡的常染色体及性染色体上。针对雄性不育鸡品系的探究,本研究采用Tet-On与TMP双调控系统在PGCs细胞水平成功实现特异性细胞凋亡。综合以上实验结果,本研究通过PGCs体外培养条件的优化可成功制备遗传修饰的G0代嵌合体及G1代阳性个体。利用针对鸡的CRISPR/Cas9的sgRNA文库获得包含不同种类sgRNAs的G0代生殖系嵌合体,为今后规模化制备突变体鸡奠定基础。结合Tet-On和TMP调控系统在PGCs水平实现特异性细胞凋亡,为雄性不育受体鸡的培育提供新的思路。
汪妹[8]（2017）在《生殖细胞体外减数分裂获得功能精子细胞》文中研究指明近年来,根据世界卫生组织（WHO）的统计,不孕不育症已困扰着全球约15%的育龄夫妇,其中,由于男性因素导致的不育约占到不孕不育总数的一半。对不孕不育症,目前仅能通过辅助生殖技术来进行治疗,但包括人工体外受精（In vitro fertilization,IVF）、卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection,ICSI）在内的辅助生殖技术都要求夫妻双方提供健康的配子。而对于功能精子缺乏导致的男性不育患者,由于没有成熟的雄性配子而只能接受精子库的供精,因而仍无法得到真正意义上的自己的后代。因此,通过细胞培养与组织培养的方法将具有多向分化潜能的胚胎干细胞或睾丸组织在体外经过生殖细胞分化和减数分裂来获得功能的雄性配子能为无精症患者提供新的希望。本研究中,我们围绕如何在体外环境通过人工培养获得功能精子展开论述。本文主要利用小鼠胚胎干细胞和新生小鼠睾丸组织运用细胞工程与组织工程的手段使得具有分化潜能的细胞和组织完全在体外培养的环境中完成减数分裂,并最终产生具有受精能力的功能精子。具体来说,本文主要进行了以下几方面的研究。1、小鼠胚胎干细胞体外减数分裂获得单倍体精子样细胞的发育功能研究。我们首先利用体外定向分化胚胎干细胞为原始生殖细胞样细胞分化技术,模拟体内胚胎期生殖细胞发育过程,将小鼠ESCs首先分化成上胚层样细胞（Epiblast Like Cells,EpiLCs）,再使EpiLCs在骨形成蛋白4（Bone morphogenetic protein 4,BMP4）等PGCs诱导的关键因子的作用下分化为（Primordial germ cell like cells,PGCLCs）。随后,通过PGCs特异表达的Blimp1-mVenus和Stella-ECFP报告基因系统或PGC特异的表面标志物SSEA1和Intergrin-β3进行PGCLCs的纯化富集。此后,我们利用新生的唯支持细胞综合征小鼠的睾丸细胞与分选得到的PGCLCs混合培养,在多种细胞因子与激素的共同作用下,PGCLCs能体外环境中启动并完成减数分裂。最终,我们能利用流式细胞分选技术在培养两周的PGCLCs与无精症小鼠睾丸细胞的混合细胞中分选出单倍体细胞。这些单倍体细胞直径约89μm,小而圆且存在明显集中的染色质区域;免疫荧光染色的结果显示这些单倍体细胞表达生殖细胞标志分子DDX4且通过PNA的作用显示精子特异的顶体颗粒或顶体帽的存在;父源印记基因H19的甲基化模式建立完全,母源印记基因Snrpn几乎处于完全开放的状态,说明其表观遗传特征已经建立;我们收集这些单倍体细胞进行表达谱分析发现这些细胞在聚类分析上与体内来源的圆形精子细胞最为接近。由于我们得到的经过体外减数分裂而来的单倍体细胞在多方面的特征上都与睾丸曲细精管中的圆形精子细胞非常类似,因此将其命名为精子细胞样细胞（Spermatid like cells,SLCs）。随后,我们对流式分选而来的SLCs进行了圆形精子细胞卵浆注射（Round spermatid injection,ROSI）以验证其发育潜能同时这也是配子功能的“黄金标准”。在两个不同背景的胚胎干细胞系分化而来的SLCs中,我们共注射379枚卵母细胞,最终通过移植到假孕母鼠体内得到9只健康出生且可育的子代小鼠。至此,本研究首次实现了完全利用体外培养条件将小鼠多能性干细胞经过减数分裂分化为有功能的雄性配子,为干细胞分化技术治疗男性不育症提供了新的治疗思路和良好的研究基础。我们相信,经过科学家们的不断努力,这一技术在其他物种或人类中的应用终将为未来的不育症患者带来福音。2、高效地获得小鼠睾丸组织体外培养来源的功能配子我们将新生小鼠睾丸曲细精管在体外利用琼脂块作为支撑,在气液结合的培养条件下进行培养,进而通过添加此前报道能够促进减数分裂与精子发生的细胞因子和激素共同培养,从而来筛选在组织培养条件下对体外减数分裂和精子发生起到促进作用的因子。在七种添加的因子中,通过对曲细精管中单倍体含量进行检测,我们筛选到睾酮（Testosterone,T）和垂体提取物（Bovin pituitary extract,BPE）对单倍体生成的促进作用较其他组别更加明显。在后续更加细化的时间点监测中,我们发现BPE能够在更早且更高效率的促成曲细精管的体外精子发生。在此条件下,BPE添加组能够获得约12%的单倍体比例,且这些单倍体细胞在形态上具有圆形精子细胞典型的直径大小、染色质分布特征。随后,为了验证通过这种组织培养得到的单倍体细胞是否具有正常的配子发育潜能,我们对其经流式分选富集后进行ROSI。对照组与BPE组分别注射66与44枚卵母细胞后,分别有90.9%和95.5%的胚胎能发育到2-细胞时期,将这2-细胞移植到假孕母鼠输卵管后,我们在两组中各得到2只健康出生的子代小鼠。在本研究中,我们首次发现垂体提取物对体外睾丸组织培养的精子发生具有重要的促进作用,垂体提取物的添加显着提高了体外曲细精管培养获得功能精子细胞的效率。由于组织培养较传统的二维细胞培养能更好的保留细胞间的信号转导以及相互作用,因此,睾丸组织培养能更真实的模拟体内减数分裂的发生和精子形成的过程。借助这一培养体系,我们对精子发生过程进行更深入的研究为此系统从小鼠延伸到人类睾丸组织培养的应用提供了更多参考价值。综上所述,本研究为人工精子的获得提供了新的研究思路,并为男性不育症的临床治疗提供了理论研究基础。
王利[9]（2015）在《黄羽鸡原始生殖细胞的分离培养及转基因的初步研究》文中认为作为精子和卵子的前体细胞,禽类的原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,简称PGCs）在生产转基因鸡和保存濒危物种的遗传资源中具有广阔的应用前景,而建立一个能使禽类PGCs有效增殖和传代的体外培养系统是这些应用的前提条件。黄羽鸡是我国重要的肉鸡品种,在广西及中国南方各省广泛养殖。为了更好的保护和利用这一地方家禽品种资源,本研究尝试从黄羽鸡分离PGCs,建立黄羽鸡PGCs的体外培养体系,并探索利用这一细胞工具进行黄羽鸡基因修饰的可能性。从黄羽鸡鸡胚血液或性腺中分离PGCs,与MEF或BRL饲养层直接接触培养或在BRL饲养层存在时,在细胞培养小室中培养。结果表明,跟直接和饲养层接触培养的PGCs相比,经细胞培养小室培养的PGCs的增殖速度更快,可以获得高达33%（1/3）的建系成功率。尽管最初是从多个混合性别的鸡胚分离而来,但是最终建系的每个PGCs株都是雄性而表现出雌性PGCs的缺失,这间接表明体外培养的雄性PGCs比雌性PGCs增殖得快。这些PGCs经长期体外培养后仍呈AP染色阳性。免疫荧光染色分析显示这些PGCs表达生殖细胞相关的标记物 SSEA-1 和 EMA-1。RT-PCR 分析表明它们表达 Nanog、PouV、CVH、CDH和DAZL这些多能性基因。PKH26标记的体外培养两个月的PGCs仍能定居到性腺。然后用脂质体LTX&PLUS试剂将构建在转座子质粒中的GFP基因导入培养的PGCs中,得到8.5%的转基因效率。用嘌呤霉素筛选GFP阳性的PGCs,并将这些阳性细胞注射到13～15期的鸡胚血液中,结果发现,这些遗传修饰后的PGCs仍能迁移到性腺。总之,本研究成功分离出黄羽鸡PGCs并建立了一套黄羽鸡PGCs的体外长期扩增培养的方法。这些PGCs不仅能在体外有效增殖,表达所有测试的标记物而且即使在进行遗产修饰后,还具有较高的性腺定居能力。因而,本研究分离获得的黄羽鸡PGCs将为地方家禽品种遗传资源的保存及生物育种提供一套有用的细胞平台。
陈波[10]（2012）在《异位发育补偿促进小鼠卵母细胞发育的研究》文中研究指明建立稳定、高效的雌性生殖细胞体外发生、发育模型是当今生殖生物学领域的紧迫任务之一,但由于我们对生殖细胞发生、发育过程中的复杂环境和营养需求还缺乏足够的了解,致使难以在体外培养环境中有效地模拟生殖细胞发生的体内环境。本实验旨在借助异位移植技术,使体外长期培养后出现发育阻滞的雌性生殖细胞的发育进程得以恢复。本实验分离12.5dpc的胎鼠卵巢,使用无血清培养液分别悬浮培养7天或14天后,将其移植到免疫缺陷鼠的肾包囊下分别发育21天（7+21组）或14天（14+14组）。相对于本实验室先前建立的贴壁培养方法,悬浮培养的卵巢中的生殖细胞发育模式更类似于体内对照组。染色体联会复合体分析及卵巢免疫组化证明,在无血清悬浮培养条件下,体外培养过程并未影响雌性生殖细胞减数分裂的发生,但是其减数分裂及卵泡发育进程出现延迟。将7+21组和14+14组卵巢分别异位移植到体内环境发育21天和14天后,供体卵巢使卵巢摘除受体内血液雌激素水平得到恢复。7+21组卵巢卵泡发育进程与体内对照组相似,而14+14组卵巢卵泡发育进程出现明显延迟。从两个实验组获得的GV期卵母细胞,其卵母细胞直径、GVBD和MⅡ比例,体外受精后2-细胞胚胎和囊胚发育比例等皆与体内对照组相似。单细胞定量RT-PCR检测表明,7+21组的卵母细胞发育中相关基因表达水平与体内对照组相似,而14+14组呈现出明显延迟。12.5dpc胎鼠卵巢来源的卵母细胞体外受精后进行胚胎移植,两实验组来源的卵母细胞均获得健康后代。总之,在无血清悬浮培养条件下,12.5dpc胎鼠卵巢的体外培养使其卵母细胞发育进程延迟,但是这种延迟可以在卵泡发育募集前通过体内微环境进行补偿和恢复,在次级卵泡阶段之前通过体内微环境得到部分恢复。本研究为诱导干细胞向卵母细胞分化提供了重要技术支持。
二、原始生殖细胞体外培养及应用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原始生殖细胞体外培养及应用研究（论文提纲范文）
（1）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（2）小鼠卵原干细胞分离建系及其体外分化形成功能性卵母细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 干细胞的定义 |
| 1.1.1 胚胎早期发育与干细胞来源 |
| 1.1.2 干细胞的分类与定义 |
| 1.2 生殖干细胞 |
| 1.2.1 生殖干细胞的定义 |
| 1.2.2 精原干细胞的定义 |
| 1.2.3 精原细胞的分类 |
| 1.2.4 精原干细胞的增殖调控 |
| 1.3 卵原干细胞 |
| 1.3.1 卵原干细胞及其研究进展 |
| 1.3.2 卵原干细胞的特征 |
| 1.3.3 卵原干细胞的增殖调控 |
| 1.3.4 卵原干细胞体外分化形成卵母细胞的研究 |
| 1.3.5 卵泡发育 |
| 1.3.6 卵原干细胞的研究意义 |
| 第二章 OSCs体外分离建系及其生物学特性的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验所用主要试剂的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 饲养层细胞的准备 |
| 2.2.2 OSCs的分离、纯化、培养 |
| 2.2.4 OSCs的标志基因蛋白以及碱性磷酸酶鉴定 |
| 2.2.5 OSCs体内分化形成卵子潜能的鉴定 |
| 2.2.6 OSCs转录组测序分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 OSCs体外培养细胞形态 |
| 2.3.2 NBT/BCIP染色鉴定OSCs碱性磷酸酶表达结果 |
| 2.3.3 RT-PCR检测OSCs标志基因的表达 |
| 2.3.4 免疫荧光染色检测OSCs标志蛋白表达 |
| 2.3.5 OSCs体内卵巢移植结果 |
| 2.3.6 OSCs转录组测序分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 OSCs体外分化形成功能性卵母细胞的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验所用主要溶液试剂的配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 OSCs与新生小鼠卵巢体细胞聚合形成聚合细胞团 |
| 3.2.2 OSCs与卵巢体细胞形成聚合细胞团的体内肾包膜下移植 |
| 3.2.3 OSCs与卵巢体细胞形成聚合细胞团肾包膜下移植后雌激素的测定 |
| 3.2.4 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植后卵巢再生的检测 |
| 3.2.5 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团在体外培养形成重组卵巢 |
| 3.2.6 MII期卵母细胞孤雌激活 |
| 3.2.7 MII期卵母细胞体外单精注射 |
| 3.2.8 胚胎移植及子代鉴定 |
| 3.2.9 OSCs体外分化进入减数分裂Sycp3 染色 |
| 3.2.10 OSCs体外分化形成GV期卵子与体内正常GV期卵子的转录组测序分析 |
| 3.2.11 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植结果 |
| 3.3.2 OSCs与卵巢体细胞聚合形成细胞团体内肾包膜下移植雌激素分泌结果 |
| 3.3.3 OSCs与卵巢体细胞体外共培养不同阶段形成重组卵泡 |
| 3.3.4 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞形态及成熟率分析 |
| 3.3.5 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞孤雌激活后胚胎发育 |
| 3.3.6 OSCs体外分化进入减数分裂Sycp3 染色鉴定 |
| 3.3.7 OSCs体外分化形成MII期卵母细胞ISCI后产生子代 |
| 3.3.8 OSCs体外分化形成GV期卵母细胞形态 |
| 3.3.9 OSCs体外分化形成GV期卵母细胞与体内正常GV期卵母细胞转录组分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 OSCs、PGCs及 ESCs基因表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PGCs的获得 |
| 4.2.2 ESCs细胞培养 |
| 4.2.3 OSCs细胞培养 |
| 4.2.4 q-PCR检测OSCs、PGCs和 ESCs基因表达 |
| 4.2.5 转录组测序分析OSCs、PGCs及 ESCs差异基因表达 |
| 4.2.6 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 q-PCR检测OSCs、PGCs和 ESCs差异基因表达 |
| 4.3.2 转录组测序分析OSCs、PGCs和 ESCs基因表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及成果 |
（3）鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 启动子的概念 |
| 1.1.1 核心启动子元件(CPE) |
| 1.1.2 上游启动子元件(UPE) |
| 1.2 鸡卵清蛋白 |
| 1.2.1 卵清蛋白简介 |
| 1.2.2 鸡卵清蛋白的组织特异性与诱导表达 |
| 1.2.3 卵清蛋白增强子序列 |
| 1.3 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子 |
| 1.3.1 COUP-TFs作用的分子机制 |
| 1.3.2 COUP-TFs的生理功能 |
| 1.4 启动子研究分析方法 |
| 1.4.1 启动子预测工具 |
| 1.4.2 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.5 CRISPR-d Cas9 与基因转录后调控 |
| 1.5.1 dCas9简介 |
| 1.5.2 CRISPR-d Cas9 转录激活或转录抑制效应元件 |
| 1.6 鸡原始生殖细胞 |
| 1.6.1 鸡胚原始生殖细胞的起源 |
| 1.6.2 鸡胚原始生殖细胞超微结构 |
| 1.6.3 PGCs的分离 |
| 1.6.4 鸡PGCs分离培养相关影响因素 |
| 1.6.5 PGCs的生物学特性 |
| 1.6.6 PGCs在转基因家禽研究中的应用 |
| 1.7 输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.7.1 转基因鸡研究方法 |
| 1.7.2 输卵管特异性表达转基因鸡研究简史 |
| 1.7.3 输卵管特异基因的高通量筛选及其启动子的应用 |
| 1.7.4 CRISPR/Cas9介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 CRISPR-d Cas9-VP64 介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 含雌激素应答元件的启动子片段(cERE-cOVP-2785)的克隆 |
| 2.3.2 重组表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.3 重组表达载体p GL3-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.4 sgRNA的设计 |
| 2.3.5 sgRNA表达载体构建 |
| 2.3.6 重组质粒中量抽提 |
| 2.3.7 转染 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 启动子载体构建结果 |
| 2.4.2 质粒与转染试剂转染最优比例筛选 |
| 2.4.3 不同长度启动子活性的比较 |
| 2.4.4 卵清蛋白启动子(cERE-cOVP-2785)不同区域转录活性分析 |
| 2.4.5 雌激素对启动子的影响 |
| 2.4.6 激活雌激素应答元件不同区域作用结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转录因子重组表达载体构建 |
| 3.3.2 去内毒素重组质粒提取 |
| 3.3.3 COUP-TFⅠ/Ⅱ调控作用 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 含转录因子载体构建结果 |
| 3.4.2 COUP-TFⅠ与COUP-TFⅡ的调控作用 |
| 3.4.3 两个转录因子协同作用分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 鸡原始生殖细胞的分离及培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 有关溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 饲养层的准备 |
| 4.3.2 从5.5日龄的鸡胚(28期)性腺中分离PGCs |
| 4.3.3 从2.5日龄的鸡胚(14期)血液中分离PGCs |
| 4.3.4 鸡PGCs的体外培养体系 |
| 4.3.5 PGCs的传代 |
| 4.3.6 PGCs的冷冻保存 |
| 4.3.7 PGCs的复苏 |
| 4.3.8 PGCs的鉴定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 两种不同来源PGCs的分离培养 |
| 4.4.2 两种不同来源PGCs的克隆形成能力 |
| 4.4.3 不同培养体系对鸡PGCs增殖能力的影响 |
| 4.4.4 PGCs的冷冻保存 |
| 4.4.5 PGCs生物学特性鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 鸡PGCs的分离培养 |
| 4.5.2 鸡PGCs体外长期培养的难点 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 鸡卵清蛋白启动子的功能验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 有关溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 慢病毒的包装 |
| 5.3.2 鸡输卵管上皮细胞(OECs)的分离 |
| 5.3.3 慢病毒体外感染鸡OECs及 PGCs |
| 5.3.4 体外感染后外源基因表达情况检测 |
| 5.3.5 慢病毒体内注射 |
| 5.3.6 外源基因表达检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 LaSRT法测定病毒滴度 |
| 5.4.2 OECs细胞分离培养 |
| 5.4.3 cERE-cOVP-2785 体外功能验证 |
| 5.4.4 cERE-cOVP-2785 体内功能验证 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 精原干细胞的研究进展 |
| 1.1 精子发生与的精原干细胞起源与发展 |
| 1.2 精原干细胞干细胞龛 |
| 1.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 1.4 精原干细胞的表型鉴定 |
| 1.5 精原干细胞的体外培养 |
| 1.6 精原干细胞的体外分化及应用前景 |
| 2 干细胞的衰老 |
| 3 转录组学的研究与应用 |
| 3.1 单细胞转录组学的研究进展 |
| 3.2 单细胞转录组学的发展历程 |
| 3.3 单细胞转录组学测序的基本步骤 |
| 3.4 单细胞转录组学的应用 |
| 4 选题依据及研究内容 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 不同体外培养系统对水牛类精原干细胞体外培养效果的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.2.1 主要试验试剂 |
| 1.2.2 试验材料来源 |
| 1.2.3 主要的实验仪器: |
| 1.2.4 主要溶液的配置 |
| 1.2.4.1 成分不明的SSC-like cells培养液的配置 |
| 1.2.4.2 成分明确的SSC-like cells培养液的配置 |
| 1.2.5 引物合成 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 水牛睾丸材料的收集 |
| 1.3.2 水牛睾丸组织的固定及石蜡包埋 |
| 1.3.3 水牛睾丸组织的石蜡切片免疫荧光染色 |
| 1.3.4 水牛睾丸总细胞的分离 |
| 1.3.5 水牛原代类精原干细胞的富集及抹片鉴定 |
| 1.3.6 细胞总RNA的提取以及荧光定量聚合酶链反应 |
| 1.3.7 不同体系对水牛类精原干细胞体外培养的效果对比及传代方法 |
| 1.3.8 体外培养水牛类精原干细胞的功能鉴定 |
| 1.4 试验结果 |
| 1.4.1 水牛睾丸组织的石蜡切片免疫荧光染色 |
| 1.4.2 水牛原代类精原干细胞的富集及抹片鉴定 |
| 1.4.3 水牛类精原干细胞在不同培养体系中的体外培养 |
| 1.4.4 在成分明确的培养体系中使用RA进行体外诱导 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 2 成年与幼年水牛曲细精管的差异转录组学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 生物信息学分析工具 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 引物合成 |
| 2.2.6 实验过程 |
| 2.2.6.1 水牛睾丸组织的固定及石蜡包埋 |
| 2.2.6.2 水牛睾丸曲细精管HE切片染色 |
| 2.2.6.3 水牛睾丸曲细精管的分离 |
| 2.2.6.4 水牛睾丸曲细精管转录组测序基本流程 |
| 2.2.6.5 Gene Ontology(GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 成年水牛曲细精管和幼年水牛曲细精管HE染色分析 |
| 2.3.2 成年水牛曲细精管和幼年水牛曲细精管转录组的差异分析 |
| 2.3.3 幼年水牛曲细精管相对于成年水牛曲细精管显着上调基因集的分析 |
| 2.3.4 幼年水牛曲细精管相对于成年水牛曲细精管显着下调基因集的分析 |
| 2.3.5 qRT-PCR的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 成年和幼年水牛的类精原干细胞差异转录组学研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 生物信息学分析工具 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 引物合成 |
| 3.3 实验过程 |
| 3.3.1 水牛睾丸单细胞悬液的获取 |
| 3.3.2 THY1阳性单细胞的获取 |
| 3.3.3 水牛类精原干细胞的免疫鉴定 |
| 3.3.4 单细胞转录组的扩增 |
| 3.3.5 单细胞转录组测序文库的建立 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 成年与幼年水牛类精原干细胞的分离与鉴定 |
| 3.4.2 水牛睾丸中类精原干细胞mRNA转录组图谱的构建 |
| 3.4.3 成年和幼年水牛类精原干细胞转录组的差异分析 |
| 3.4.4 幼年水牛类精原干细胞相对于成年水牛类精原干细胞显着上调表达基因集的分析 |
| 3.4.5 幼年水牛类精原干细胞相对于成年水牛类精原干细胞显着下调表达基因集的分析 |
| 3.4.6 qRT-PCR的验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
（5）鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 附录：缩略词（中英文对照） |
| 第一部分 综述 |
| 前言 |
| 1 家禽种质资源的保存 |
| 1.1 利用胚盘细胞制备生殖系嵌合体 |
| 1.2 利用ESC制备生殖系嵌合体 |
| 1.3 利用PGC制备生殖系嵌合体 |
| 2 转基因鸡的产生 |
| 3 iPSC的研究进展 |
| 3.1 iPSC的概述 |
| 3.2 禽类iPSC的研究进展 |
| 3.3 诱导多能干细胞分化为生殖细胞的研究进展 |
| 4 Dazl的研究进展 |
| 4.1 DAZ基因家族的起源与结构 |
| 4.2 Dazl在生殖细胞发育中的作用 |
| 5 基因组定点编辑技术 |
| 5.1 基因组定点编辑技术的分类 |
| 5.2 CRISPR/Cas9技术 |
| 5.3 CRISPR/Cas9的在转基因动物中的应用 |
| 5.4 脱靶效应 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 DAZL多克隆抗体的制备 |
| 2.2 DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 鸡Dazl荧光报告载体的构建和定点敲入验证 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建与敲除效率验证 |
| 2.2 Dazl荧光报告基因载体的构建 |
| 2.4 荧光报告载体在PGC打靶Dazl的验证 |
| 2.5 荧光报告载体在iPSC打靶Dazl的验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Dazl荧光报告基因示踪PGC细胞迁移和iPSC分化 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 Dazl荧光标记PGC的迁移归巢鉴定 |
| 2.2 鸡Dazl报告基因示踪iPSC分化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（6）E2与FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 哺乳动物卵泡生长发育和水牛超数排卵的研究进展 |
| 1 哺乳卵泡生长发育过程概述 |
| 1.1 原始生殖细胞的形成 |
| 1.2 原始卵泡的活化和生长 |
| 1.3 初级卵泡到次级卵泡阶段 |
| 1.4 三级卵泡至排卵前阶段 |
| 1.5 排卵 |
| 2 颗粒细胞和卵泡膜细胞在卵泡发育过程中的研究进展 |
| 2.1 颗粒细胞在卵泡发育过程中的研究进展 |
| 2.2 卵泡膜细胞在卵泡发育过程中的研究进展 |
| 3 FSH和E_2在颗粒细胞/卵泡膜细胞增殖和凋亡过程中的研究进展 |
| 3.1 细胞增殖和凋亡的概述 |
| 3.2 促卵泡素(FSH)和雌二醇(E_2)对颗粒细胞/卵泡膜细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4 水牛超数排卵的研究进展 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| E_2与FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1 试验设备和试验试剂 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试验仪器设备和耗材 |
| 1.3 主要试剂和配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞的分离和纯化 |
| 2.2 水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞的冻存与复苏 |
| 2.3 细胞无菌培养的注意事项和污染的处理方法 |
| 2.4 水牛卵泡颗粒细胞和卵泡内膜细胞的无血清培养 |
| 2.5 细胞增殖检测方法 |
| 2.6 细胞凋亡检测——流式细胞分析技术 |
| 2.7 引物的设计和合成 |
| 2.8 水牛卵泡颗粒细胞和卵泡内膜细胞RNA样品的制备 |
| 2.9 样品RNA浓度的测定和电泳 |
| 2.10 反转录PCR |
| 2.11 相对荧光定量PCR |
| 3 试验设计 |
| 3.1 无血清培养基对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞生长情况的影响 |
| 3.2 FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖的影响 |
| 3.3 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖的影响 |
| 3.4 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞凋亡的影响 |
| 3.5 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞受体基因表达的影响 |
| 3.6 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖基因表达的影响 |
| 3.7 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞凋亡基因表达的影响 |
| 4 统计方法 |
| 5 试验结果与分析 |
| 5.1 无血清培养基对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞生长情况的影响 |
| 5.2 不同浓度的FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖的影响 |
| 5.3 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖的影响 |
| 5.4 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞凋亡的影响 |
| 5.5 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞受体基因表达的影响 |
| 5.6 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖基因表达的影响 |
| 5.7 E_2和FSH联合作用对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞凋亡基因表达的影响 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及专利 |
（7）利用piggyBac转座子及CRISPR文库规模化制备突变体鸡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡生殖系嵌合潜能干细胞概述 |
| 1.1.1 胚盘细胞和胚胎干细胞及应用 |
| 1.1.2 原始生殖细胞及应用 |
| 1.1.3 胚胎生殖细胞及应用 |
| 1.1.4 精原干细胞及应用 |
| 1.2 禽类遗传修饰方法的研究进展 |
| 1.2.1 病毒载体法 |
| 1.2.2 原始生殖细胞法 |
| 1.2.3 转座子高效转座法 |
| 1.2.4 定点基因组编辑法 |
| 1.2.5 体内直接转染法 |
| 1.2.6 制备鸡的遗传修饰模型的意义及应用前景 |
| 1.3 制备高效的生殖系嵌合体的研究进展 |
| 1.3.1 制备高效的生殖系嵌合体的前期探索 |
| 1.3.2 不育受体模型的研究意义及应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒及细胞系 |
| 2.1.2 实验鸡蛋和种母鸡 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 原始生殖细胞的分离 |
| 2.2.4 原始生殖细胞的体外培养 |
| 2.2.5 体外培养的原始生殖细胞的特征分析 |
| 2.2.6 G_0代嵌合体鸡的制备与鉴定 |
| 2.2.7 G_1代阳性鸡的筛选与鉴定 |
| 2.2.8 单基因CRISPR/Cas9靶点的设计与突变分析 |
| 2.2.9 全基因组CRISPR/Cas9靶点的设计 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 利用piggyBac转座子系统制备遗传修饰鸡 |
| 3.1.1 PGCs的分离与培养 |
| 3.1.2 构建piggyBac转座子系统相关质粒 |
| 3.1.3 制备G_0代基因修饰的嵌合体公鸡 |
| 3.1.4 利用G_0代嵌合体获得G_1代遗传修饰鸡 |
| 3.2 利用CRISPR/Cas9技术规模化构建鸡的全基因组突变 |
| 3.2.1 利用CRISPR/Cas9技术在鸡的细胞中实现单基因编辑 |
| 3.2.2 利用生物信息学方法设计针对鸡的全基因组的sgRNA文库 |
| 3.2.3 结合Tet-On调控系统构建piggyBac介导的鸡的CRISPR/Cas9文库 |
| 3.2.4 制备CRISPR/Cas9文库的G_0代嵌合体 |
| 3.2.5 获得CRISPR/Cas9文库的G_1代突变体鸡 |
| 3.3 利用Tet-On与TMP双调控系统制备雄性不育鸡品系 |
| 3.3.1 Tet-On与TMP双调控系统质粒的构建 |
| 3.3.2 Tet-On与TMP双调控系统在PGCs中的应用 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 PGCs的体外培养 |
| 4.2 可调控的CRISPR/Cas9系统制备规模化突变体 |
| 4.3 利用双调控系统构建雄性不育受体模型 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附表S1 本论文中所用引物序列 |
| 附表S2 G_0代嵌合体中sgRNAs深度测序结果分析 |
| 附表S3 统计文库设计及二代测序检测到的sgRNAs在每条染色体上的分布情况 |
| 个人简历 |
（8）生殖细胞体外减数分裂获得功能精子细胞（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 生殖细胞命运决定 |
| 1.2 原始生殖细胞特化的信号调控网络 |
| 1.3 精原细胞的自我更新与减数分裂启动 |
| 1.3.1 精原细胞的自我更新模式 |
| 1.3.2 精原细胞的异质性与基因表达特征 |
| 1.3.3 精原细胞的减数分裂启动 |
| 1.3.4 减数分裂的激素调节 |
| 1.4 体外生殖细胞发生的研究进展 |
| 1.4.1 多能干细胞的生殖细胞分化 |
| 1.4.2 睾丸组织培养的体外配子发生 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 第二章 小鼠胚胎干细胞体外减数分裂获得单倍体精子样细胞的发育功能研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 2.1.3 主要实验试剂及配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 流式分选单倍体细胞 |
| 2.2.2 流式分选出的单倍体进行免疫荧光染色 |
| 2.2.3 从小鼠睾丸中分离圆形精子 |
| 2.2.4 分选得到的单倍体细胞及体内分离的圆形精子的亚硫酸氢盐测序 |
| 2.2.5 对流式分选出的单倍体进行表达谱测序 |
| 2.2.6 对流式分选出的单倍体进行卵母细胞注射验证发育潜能 |
| 2.2.7 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.8 小鼠尾尖成纤维细胞核型鉴定 |
| 2.2.9 小鼠尾尖成纤维细胞印记基因甲基化检测 |
| 2.2.10 小鼠尾尖组织的简化表观亚硫酸氢盐测序(RRBS) |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)经过原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)阶段发生减数分裂 |
| 2.3.2 体外培养获得的单倍体的配子特征检测研究 |
| 2.3.3 通过显微注射获得精子样细胞发育而来的健康小鼠子代 |
| 2.3.4 BVSC细胞系单倍体功能检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小鼠睾丸组织体外培养获得功能配子的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 3.1.3 主要实验试剂及配置方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 新生小鼠睾丸组织体外培养 |
| 3.3.2 碘化丙啶分析睾丸组织中所有细胞的染色体倍性 |
| 3.3.3 圆形精子细胞卵胞浆注射 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 新生小鼠睾丸组织体外培养发生减数分裂 |
| 3.3.2 几种不同因子对睾丸组织体外培养的影响 |
| 3.3.3 添加垂体提取物能提高睾丸组织培养的单倍体生成率并获得功能精子细胞 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间的科研成果及获奖情况 |
| 致谢 |
（9）黄羽鸡原始生殖细胞的分离培养及转基因的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 引言 |
| 1 禽类原始生殖细胞和干细胞 |
| 1.1 精原干细胞(SSCs)或卵原干细胞(OSCs) |
| 1.2 胚胎生殖细胞(EGCs) |
| 1.3 胚胎干细胞(ESCs) |
| 1.4 诱导多能性干细胞(iPSCs) |
| 1.5 ESCs和iPSCs在一定条件下可特化为PGCs |
| 2 禽类PGCs的起源、迁移和生物学形态 |
| 2.1 禽类PGCs的起源及迁移 |
| 2.2 形态特征及生物学特性 |
| 3 禽类PGCs的分离及体外培养 |
| 3.1 禽类PGCs的分离 |
| 3.2 禽类PGCs的体外培养 |
| 4 禽类PGCs的体外鉴定 |
| 4.1 形态鉴定 |
| 4.2 过碘酸雪夫氏试剂(PAS)染色检测 |
| 4.3 碱性磷酸酶活性(AP)检测 |
| 4.4 免疫荧光染色检测 |
| 4.5 嵌合体试验 |
| 5 禽类PGCs的研究进展及应用前景 |
| 5.1 种质资源保存 |
| 5.2 转基因应用 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 黄羽鸡原始生殖细胞的分离、培养及鉴定 |
| 引言 |
| 第一节 黄羽鸡原始生殖细胞的分离及培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器和耗材 |
| 1.4 主要溶液配置 |
| 1.5 MEF的分离、培养及冷冻 |
| 1.6 饲养层的制备 |
| 1.7 BRL条件培养液的制备 |
| 1.8 PGCs的分离 |
| 1.9 PGCs的体外培养 |
| 1.10 PGCs的冷冻保存及复苏 |
| 1.11 生长曲线的制作 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 饲养层的制备 |
| 2.2 血液来源的PGCs(cPGCs)的体外培养 |
| 2.3 性腺来源的PGCs(gPGCs)的体外培养 |
| 2.4 不同分离来源的PGCs之间的比较 |
| 2.5 细胞培养小室对PGCs体外培养的影响 |
| 2.6 不同饲养层对PGCs体外培养的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 饲养层的制备及对PGCs体外培养的影响 |
| 3.2 细胞培养小室对PGCs建系能力的影响 |
| 4 小结 |
| 第二节 体外培养的PGCs的生物学特性的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器及耗材 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 形态鉴定 |
| 2.2 多能性基因的RT-PCR鉴定 |
| 2.3 碱性磷酸酶染色鉴定 |
| 2.4 SSEA-1和EMA-1免疫荧光染色 |
| 2.5 性别鉴定 |
| 2.6 向性腺的迁移能力鉴定 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 形态观察 |
| 3.2 碱性磷酸酶活性检测 |
| 3.3 SSEA-1和EMA-1免疫荧光染色 |
| 3.4 RT-PCR分析多能性基因的表达 |
| 3.5 向性腺迁移能力的验证 |
| 3.6 性别鉴定雌性株的缺失 |
| 4 小结 |
| 第二章 鸡PGC转基因应用的初步研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器和耗材 |
| 1.4 脂质体转染法优化 |
| 1.5 电穿孔转染法优化 |
| 1.6 转染效率的计算方法 |
| 1.7 GFP基因导入PGCs |
| 1.8 GFP-PGCs的筛选建系 |
| 1.9 GFP-PGCs向性腺迁移 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脂质体转染效率的优化 |
| 2.2 电转染效率的优化 |
| 2.3 GFP-PGCs细胞系的建立 |
| 2.4 GFP-PGCs向性腺迁移 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸡PGCs转基因效率的优化 |
| 3.2 PGCs的基因修饰及向性腺的迁移 |
| 4 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附录 重要缩略词中英文对照表 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（10）异位发育补偿促进小鼠卵母细胞发育的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 卵母细胞发生发育的基本过程 |
| 1.1 小鼠胚胎期卵母细胞发生发育的基本过程 |
| 1.2 小鼠卵泡卵母细胞发育的基本过程 |
| 2 卵母细胞体外发生 |
| 2.1 干细胞向卵母细胞的诱导分化 |
| 2.1.1 胚胎干细胞向卵母细胞的定向分化 |
| 2.1.2 诱导多能干细胞向卵母细胞的定向分化 |
| 2.1.3 成体干细胞向卵母细胞的定向分化 |
| 2.1.4 干细胞向卵母细胞的诱导分化小结 |
| 2.2 卵母细胞的体外培养 |
| 2.2.1 胚后发育阶段卵母细胞的体外发育 |
| 2.2.2 胚胎期发育阶段卵母细胞的体外发育 |
| 2.2.3 卵泡培养的3D培养体系 |
| 3 利用体内微环境促进卵子发生的相关研究进展 |
| 3.1 与体细胞共培养促进卵母细胞体外发生 |
| 3.2 体内移植促进卵子发生 |
| 试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 减数分裂前卵巢体外培养过程中的卵泡发育延迟 |
| 2.2 减数分裂前卵巢体外培养过程中的减数分裂进程延迟 |
| 2.3 体外培养的减数分裂前卵巢中卵泡移植后的发育进程恢复 |
| 2.4 单细胞定量RT-PCR检测 |
| 2.5 12.5dpc卵巢体外培养后移植回收卵母细胞的功能检测 |
| 2.6 12.5dpc卵巢体外培养后移植回收的卵母细胞受精后能获得后代 |
| 3 讨论 |
| 3.1 体外培养的减数分裂前生殖细胞能自觉进入减数分裂并阻滞 |
| 3.2 卵巢结构完整性对于卵母细胞发育的作用 |
| 3.3 卵巢体外培养过程中,原始卵泡库耗竭 |
| 3.4 卵泡发育阶段在卵母细胞体外发生过程中的重要性 |
| 3.5 MOF来源的卵母细胞的发育潜能 |
| 3.6 结束语 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师组意见 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 发表论文 |
四、原始生殖细胞体外培养及应用研究（论文参考文献）
- [1]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [2]小鼠卵原干细胞分离建系及其体外分化形成功能性卵母细胞的研究[D]. 李树斌. 内蒙古大学, 2020(01)
- [3]鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证[D]. 韦茏芹. 广西大学, 2020(02)
- [4]水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究[D]. 李婷婷. 广西大学, 2019(02)
- [5]鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究[D]. 莫丽芬. 广西大学, 2019(01)
- [6]E2与FSH对水牛卵泡颗粒细胞/内膜细胞增殖和凋亡的影响[D]. 文冬梅. 广西大学, 2019(01)
- [7]利用piggyBac转座子及CRISPR文库规模化制备突变体鸡的研究[D]. 高菲. 中国农业大学, 2017(05)
- [8]生殖细胞体外减数分裂获得功能精子细胞[D]. 汪妹. 湖南师范大学, 2017(01)
- [9]黄羽鸡原始生殖细胞的分离培养及转基因的初步研究[D]. 王利. 广西大学, 2015(01)
- [10]异位发育补偿促进小鼠卵母细胞发育的研究[D]. 陈波. 青岛农业大学, 2012(07)