一、调节性T细胞与免疫耐受（论文文献综述）
轩娟娟,白鸿太,张继翔,王耀权,陈国勇,魏思东[1]（2022）在《调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展》文中进行了进一步梳理背景:肝移植后的免疫排斥反应严重影响患者的生存质量,而调节性T细胞在抑制肝移植排斥反应及免疫耐受方面发挥着重要作用。目的:综述调节性T细胞在肝移植术中的作用及其在临床上的应用进展,为调节性T细胞在肝移植及其他器官移植方面的研究及临床应用提供思路。方法:第一作者于2021年2月应用计算机在PubMed和中国知网数据库检索1970年1月至2021年2月相关文献,以"regulatory T cells,liver transplantationg"为英文检索词,以"调节性T细胞、肝移植"为中文检索词,最终纳入49篇文献进行分析。结果与结论:（1）调节性T细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群,又称抑制性T细胞,调节性T细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞和诱导产生的适应性调节性T细胞,自然调节性T细胞主要为CD4+CD25+T细胞,占外周血及脾脏CD4+T细胞的5%-10%,调节性T细胞在抑制肝移植排斥反应及维持免疫耐受方面发挥着重要作用。（2）肝移植后,受者受到移植肝的刺激,调节性T细胞的数量及活性增加,同时叉状头转录因子的表达量增多。（3）肝移植后发生排斥反应时受者体内调节性T细胞的数量及活性较低。（4）肝移植后免疫耐受者体内调节性T细胞的数量及活性较高,并且调节性T细胞能够诱导及维持免疫耐受。（5）向肝移植后受者输注调节性T细胞能够减轻移植后的排斥反应,延长移植肝的存活时间。
王劲智[2]（2021）在《原发性肾病综合征与牛奶蛋白过敏中调节性T细胞应答异常及DOCK8缺陷致B细胞早期活化异常的机制研究》文中提出目的:原发性肾病综合征（Primary Nephrotic Syndrome,PNS）是儿童常见的原发肾小球疾病,也是引起我国儿童终末期肾病的重要疾病之一。由于其病因的复杂性及异质性,目前对于该病发病机制的认识仍十分有限。近年来的相关研究结果提示免疫功能紊乱及免疫炎症是PNS发病的重要机制,多种固有及适应性免疫应答异常可能参与PNS的发生发展,其中T细胞相关免疫应答失调的作用近年来越来越受到关注,被认为是介导PNS发生发展的核心环节之一。调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）是CD4+T细胞的亚群之一,以转录因子Foxp3表达为标志,具有强大的免疫抑制能力,在机体外周免疫耐受及免疫稳态的建立与维持中发挥核心作用。前期研究显示,PNS患儿急性期外周血中Treg水平下调,提示Treg应答异常参与PNS发生发展。同时既往的研究显示,在多种自身免疫、免疫紊乱及相关炎症条件下,存在Treg细胞谱系稳定性,可塑性及功能异常。但是,目前在肾病综合征、免疫相关肾病及相关动物模型中尚缺乏相关研究报道。故本研究目的主要为明确PNS条件下,Treg细胞是否存在谱系稳定性,可塑性及功能异常,并分析导致以上异常的潜在分子机制。以期加深对于PNS免疫发病机制的认识,同时为临床干预寻找新的靶标。方法:收集重庆医科大学附属儿童医院肾脏内科收治的初诊PNS患儿急性期外周血标本（PNS组）,同时在本院体检中心收集年龄性别相匹配的健康儿童外周血标本作为对照（HC组）:通过流式细胞术,分析Treg细胞相关免疫表型;通过分离纯化外周血Treg细胞、体外刺激其活化及增殖,分析Treg细胞稳定性及可塑性;通过分离纯化外周血Treg细胞及Tresponder细胞,体外共培养,分析Treg细胞的免疫抑制能力;通过分离纯化外周血Treg细胞,基因表达谱及生物信息学分析,磷酸化流式等检测,解析导致PNS条件下Treg异常的潜在信号通路及分子机制;通过分离纯化外周血Treg细胞,特异性抑制剂干预及体外功能、稳定性、可塑性实验,进一步明确相关分子机制在PNS-Treg细胞稳定性,可塑性及功能异常中的关键作用。结果:（1）PNS患儿外周血中Treg细胞谱系核心转录因子Foxp3表达稳定性显着受损,表现为PNS组中CD25+Foxp3-细胞比例显着升高,Treg细胞中Foxp3表达水平显着下降,同时体外稳定性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中存在Foxp3表达的显着丢失;（2）PNS患儿外周血中Treg细胞表现出显着的可塑性异常,表现为表达IFN-γ、T-bet、及CXCR3的Th1样Treg细胞水平显着升高,同时体外可塑性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中,伴随Foxp3表达的下调,Treg细胞显着向分泌IFN-γ的Th1样Treg细胞转化,甚至完全转分化为Th1细胞;（3）PNS患儿外周血中Treg细胞存在显着的功能失调,表现为对Tresponder细胞体外增殖的抑制能力显着减弱;（4）Treg细胞的以上异常应答,与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关,表现为与Treg及conventional T细胞活化及耗竭相关的分子标志显着上调,同时基因表达谱及生信分析也显示大量活化及耗竭相关的基因集在PNS-Treg细胞中显着富集;（5）介导T细胞活化的TCR信号,及其下游的PI3K-AKT、MAPK信号通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着富集,提示以上信号通路的异常活化,参与PNS中过度活化诱导的Treg耗竭。（6）作为PI3K-AKT、MAPK信号通路下游的共同调控靶点,m TORC1的活化水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着上调。（7）m TORC1诱导的下游转录因子,c-Myc及SREBPs的蛋白表达水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着上调,且受以上转录因子调控的靶基因集亦在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着富集,提示m TORC1-c-Myc/SREBPs可能是介导PNS条件下过度活化诱导的Treg耗竭及相关免疫应答异常的关键下游环节;（8）特异性抑制剂干预m TORC1、c-Myc、及SREBPs可显着恢复PNS-Treg细胞的体外抑制能力,下调活化诱导的耗竭标志PD-1的表达。显着改善PNS-Treg细胞体外增殖中的Foxp3稳定性异常,并抑制其IFN-γ的分泌,即减弱PNS-Treg的可塑性异常;（9）基因表达谱及生物信息学分析提示,多种生物合成以及生物能量产生相关的代谢通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显着富集,提示这些异常活跃的代谢程序在活化诱导的PNS-Treg耗竭过程中可能发挥关键作用。结论:以上研究结果提示,PNS病理条件下,外周血Treg细胞表现出明显的功能、稳定性及可塑性异常。PNS-Treg细胞以上应答异常与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关。TCR介导的m TORC1信号异常激活在此过度活化诱导的耗竭过程中发挥不可或缺的作用。同时,此过程中可能伴随有多种生物合成及生物能量产生相关的代谢通路的异常活跃。目的:将牛奶蛋白诱导的过敏性直肠结肠炎（cow’milk protein induced FPIAP,CM-FPIAP）婴儿的肠道菌群移植给无菌小鼠,通过检测受体小鼠肠道内菌群结构及免疫微环境的变化,研究非IgE介导型牛奶蛋白过敏中肠道菌群失调对调节性T细胞介导的免疫耐受和免疫稳态的影响。方法:收集明确诊断为牛奶蛋白诱导的过敏性直肠结肠炎婴儿（I-FPIAP组）及健康对照婴儿（I-HC组）的粪便标本,分别移植给无菌小鼠（M-FPIAP组和M-HC组）。两周后通过16S r RNA基因测序确认供体婴儿的菌群结构在受体小鼠肠道内的保持情况;通过流式细胞术分析受体小鼠肠道Treg细胞应答相关的免疫表型及肠道免疫稳态相关指标,并通过分离纯化及体外共培养技术分析受体小鼠肠道Treg细胞的免疫抑制功能;最后通过相关性分析,寻找CM-FPIAP条件下,可能影响Treg细胞免疫应答及免疫稳态的菌属。结果:1.菌群定植2周后,供体婴儿肠道菌群的主体结构在受体小鼠肠道内较能保持;2.M-FPIAP组小鼠结肠总Treg细胞、p Treg细胞、Ro R-γt+Treg细胞水平显着下降,Treg细胞的增殖及凋亡指标无显着差异;3.M-FPIAP组小鼠结肠Treg细胞表达ICOS、CTLA4的量显着下降,Treg细胞活化水平显着下调,抑制性细胞因子IL-10的分泌水平明显减少,同时对Responder T细胞体外增殖的抑制能力显着减弱;4.M-FPIAP组小鼠结肠T细胞活化水平显着提高,且主要表现为Th2型免疫应答;5.相关性分析显示,Raoultella及Clostridium sensu stricto两个菌属的丰度都与结肠Treg水平及功能呈高度负相关。结论:1.作为非IgE介导型CMPA的主要临床类型,CM-FPIAP中的菌群失调会显着地破坏肠道Treg细胞的发育及功能,影响Treg细胞参与维持的肠道免疫耐受和免疫稳态。2.Raoultella及Clostridium sensu stricto的丰度增加对肠道Treg细胞发育及功能的异常可能产生关键影响。目的:以Dock8缺陷病人外周血单个核细胞及Dock8基因敲除小鼠为研究对象,初步探讨Dock8这一鸟苷酸交换因子缺乏对B细胞活化早期关键分子事件及记忆B细胞活化的影响,以期深化对于Dock8缺陷病人体液免疫异常发病机制的理解与认识。方法:分离及纯化Dock8缺陷病人外周血及Dock8基因敲除小鼠脾脏B细胞,通过可溶性抗原-磷酸化流式系统及膜相关抗原-TIRFm系统,分析Dock8缺陷对总B细胞或记忆性B细胞（CD19+CD27+）早期活化相关信号转导、BCR动力学、及细胞形态学的影响;通过流式细胞术分析Dock8缺陷对体外活化所诱导的初始B细胞表型转变的影响;通过流式细胞术,RT-PCR,分析Dock8缺陷对B细胞活化共受体CD19及Dock8下游效应分子WASP表达的影响。结果:相较于野生型小鼠,Dock8基因敲除小鼠B细胞中早期活化关键信号分子的磷酸化水平（p Btk,p CD19）,及BCR信号相关蛋白酪氨酸磷酸化总体水平p Y,在活化后不同时间点均显着下调,反应Dock8敲除小鼠B细胞早期活化显着受损;体外活化后,Dock8下游效应分子WASP的磷酸化水平（p WASP）在Dock8敲除小鼠B细胞中亦显着下调;Dock8缺陷小鼠B细胞中共受体CD19的转录水平显着下调;Dock8缺陷小鼠B细胞中WASP的转录及蛋白水平亦显着下调。与健康对照相比,Dock8缺陷病人外周血B细胞体外活化后,p CD19、p Btk、p Y、p WASP及肌动蛋白F-actin水平均显着下调,这与小鼠模型观察到的结果呈现一致性,提示Dock8缺陷病人外周B细胞早期活化显着受损;同时,TIRFm结果显示,膜相关抗原激活后,Dock8缺陷病人外周血记忆B细胞早期活化亦显着受损,表现为:记忆B细胞与膜相关抗原接触区域内BCR聚集簇及B细胞扩张受限,BCR信号分子的招募及活化（p Y,p Btk）受损;磷酸化流式也显示,可溶性抗原激活后,Dock8缺陷病人外周记忆B细胞中Erk及Btk的磷酸化水平显着下调,进一步证实其早期活化受损;同时,体外活化诱导的初始B细胞向记忆B细胞表型转变,在Dock8缺陷病人中亦显着受限;流式结果显示Dock8缺陷病人外周记忆B细胞中CD19表达显着下调。结论:以上结果显示Dock8缺陷将显着损害总B细胞及记忆B细胞的早期激活;且以上效应可能是通过抑制共受体CD19或Dock8下游效应分子WASP的表达及活化得以实现。
王芳菲,吕少诚,贺强[3]（2020）在《肝移植术后免疫耐受机制及诱导方法的研究现状》文中认为肝移植历经近60年的发展,手术技术日臻完善,但目前术后排斥反应仍然是制约移植物和患者长期存活的关键因素之一。免疫耐受是指免疫系统接触抗原后的特异性免疫无应答或低应答状态,是器官移植术后的最理想状态,而肝脏作为免疫豁免器官,也最容易诱导出免疫耐受状态。目前大量的试验研究已经证实免疫耐受与肝移植术后多种细胞和分子机制有关,但实现临床转化仍有待进一步研究。本文就目前肝移植术后免疫耐受的研究现状进行综述,以阐释其可能机制和诱导方法。
赵媛媛[4]（2020）在《T细胞亚群及其免疫检查点分子在妊娠过程中的表达及意义》文中研究指明目的:1.全面分析不同来源（外周血、宫腔血、脐血）以及不同妊娠并发症如子痫前期（Pre-eclampsia,PE）和妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）中T细胞亚群,特别是调节性T（Regulatory T,Treg）细胞,及其免疫检查点分子的表达及意义。2.全面分析正常妊娠、原因不明复发性流产（Unexplained recurrent pregnancy loss,URPL）和GDM中外周血T细胞亚群,特别是Treg细胞,及其免疫检查点分子的表达及意义。方法:1.选择2019年3月至2019年9月烟台毓璜顶医院妇产科住院分娩的正常产妇28例,PE产妇25例和GDM产妇28例,采用流式细胞术检测研究对象外周血、宫腔血和脐血中T细胞亚群（CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+Treg和CD8+Treg细胞）百分比,以及这些细胞上程序化细胞死亡受体1（Programmed cell death receptor1,PD-1）、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（Glucocorticoid-inducible tumor necrosis factor receptor,GITR）、人白细胞抗原G（Human leucocyte antigen-G,HLA-G）和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4）的表达水平。2.选择2019年3月至2019年9月烟台毓璜顶医院妇产科就诊的正常早期妊娠妇女43例,正常中期妊娠妇女33例,正常晚期妊娠妇女35例,URPL妇女21例,中期妊娠GDM妇女25例,及同期我院查体中心进行体检的正常非妊娠妇女57例,采用流式细胞术检测研究对象外周血中T细胞亚群百分比,以及这些细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4的表达水平。结果:1.（1）与正常产妇相比,PE和GDM产妇外周血、宫腔血和脐血CD4+Treg细胞百分比降低,CD8+Treg细胞百分比升高（P<0.001）;外周血T细胞亚群中PD-1和GITR及宫腔血T细胞亚群中PD-1表达水平降低（P<0.001）。（2）正常、PE和GDM产妇中,宫腔血CD4+Treg和CD8+Treg细胞百分比低于外周血和脐血（P<0.01）;脐血PD-1+CD4+Treg和PD-1+CD8+Treg细胞百分比低于外周血和宫腔血（P<0.01）;外周血GITR+CD4+Treg和GITR+CD8+Treg细胞百分比高于宫腔血和脐血（P<0.01）;外周血T细胞亚群中HLA-G的表达低于宫腔血和脐血（P<0.01）。2.（1）与非妊娠妇女相比,早、中和晚期妊娠妇女外周血CD4+Treg细胞百分比以及中、晚期妊娠妇女外周血CD8+Treg细胞百分比升高（P<0.01）。晚期妊娠妇女外周血CD4+Treg和CD8+Treg细胞中PD-1和GITR表达高于早、中期妊娠和非妊娠妇女（P<0.01）。（2）与正常早期妊娠妇女相比,URPL妇女外周血CD4+Treg细胞百分比降低（P=0.04）,CD8+Treg细胞百分比升高（P=0.003）;PD-1+CD4+Treg（P=0.02）、GITR+CD4+Treg（P=0.03）和HLA-G+CD4+Treg细胞百分比（P=0.02）降低。与正常中期妊娠妇女相比,中期妊娠GDM妇女外周血CD4+Treg细胞百分比降低,CD8+Treg细胞百分比升高（P<0.001）;HLA-G+CD4+Treg（P=0.008）、PD-1+CD8+Treg（P=0.005）、GITR+CD8+Treg细胞百分比（P=0.006）降低。结论:1.正常妊娠过程中,外周血CD4+Treg细胞和CD8+Treg细胞百分比增加,可能在妊娠免疫耐受中可能发挥重要作用。2.PE和GDM患者外周血、宫腔血和脐血CD4+Treg细胞百分比降低,CD8+Treg细胞百分比升高,可能与PE和GDM的发生有关。3.正常妊娠情况下,脐血和宫腔血T细胞亚群中HLA-G表达升高,可能在维持母胎免疫耐受中起一定作用。4.PE和GDM患者外周血、宫腔血和脐血CD4+Treg和CD8+Treg细胞,URPL患者外周血CD4+Treg细胞以及中期妊娠GDM患者外周血CD8+Treg细胞上PD-1和GITR表达降低,可能与URPL、PE和GDM的发生有关。
刘佳[5]（2020）在《IL-35在免疫耐受微环境形成及肿瘤血管生成中的作用及其机制研究》文中指出研究背景白细胞介素-35（IL-35）是IL-12家族的新成员,是由EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene 3）和p35两个亚基组成的异源二聚体细胞因子。IL-35与IL-10、TGF-p同为免疫抑制性细胞因子。其生物学功能主要包括:（1）抑制T淋巴细胞或B淋巴细胞的增殖;（2）促进Treg细胞的增殖:（3）抑制Thl7细胞的极化和IL-17的产生;（4）诱导初始T淋巴细胞或B淋巴细胞转化为分泌IL-35的Treg（IL-35 induced regulatory Tcell,iTR35）或Breg（1L35+Breg）。基于IL-35的生物学功能,其在免疫抑制的调节及免疫耐受微环境的形成中可能发挥着重要作用。为深入探讨IL-35在免疫耐受形成中的作用,本研宂分别选取了两个典型-的免疫耐受微环境:病理性耐受微环境（乳腺肿瘤局部微环境）和生理性耐受环境（妊娠环境）作为研究对象,分别研究IL35在机体的病理和生理不同状态下对微环境内细胞的诱导及免疫耐受状态的维持作用。肿瘤微环境（Tumormicroenvironment,TME）是由肿瘤基质细胞（包括肿瘤浸润淋巴细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等）、细胞外基质和可溶性分子等共同构成的肿瘤细胞生活的特殊环境。在肿瘤发展的过程中,TME中的免疫细胞受到周围环境的训导,逐渐转化为抑制性免疫细胞,从而促进了局部免疫耐受状态的形成,这对于肿瘤的进展和远处转移起着不可或缺的作用。我们的前期研究发现,乳腺肿瘤细胞及TME中的调节性T细胞（Regulatory Tcell,Treg）均可表达和分泌免疫抑制性细胞因子IL-35。乳腺肿瘤组织中1L-35水平升高被认为是预后不良的独立因素。然而,肿瘤局部高水平的IL-35通过何种方式促进了肿瘤的发展和演进?IL-35是否可通过影响乳腺TME中的基质细胞,如肿瘤浸润淋巴细胞和血管内皮细胞,对肿瘤的进展发挥调节作用,尚不清楚。作为细胞间交流的重要媒介,外泌体（Exosomes）是细胞分泌的一种胞外膜泡,具有脂质双分子层膜结构,起着向特定靶细胞传递基因信息和进一步调节其表型和生物学过程的作用。肿瘤细胞能够通过外泌体影响肿瘤细胞的增殖代谢,免疫逃逸和远处转移。在这一过程中,血管生成对于肿瘤细胞的局部增殖和逃逸到血流进而建立远处转移有着重要意义。在TME中,由肿瘤细胞分泌的、富含蛋白和核酸的外泌体是否充当了肿瘤细胞和内皮细胞之间交流的关键介质,帮助肿瘤细胞调节血管生成?另一方面,乳腺TME中富含大量的肿瘤浸润淋巴细胞,包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。肿瘤局部微环境中具有免疫抑制作用的、高浓度的IL-35是否调节了这些淋巴细胞向抑制性细胞的转化（如转化为iTR35和IL-35+Breg）和局部免疫耐受的形成?均有待于进一步的研究证明。与肿瘤局部的免疫耐受微环境相似,妊娠早期的母胎界面也存在着大量具有抑制功能的免疫细胞和抑制性细胞因子,形成特殊的“免疫赦免”状态,避免母体对胎儿的排斥。例如,处于母体蜕膜的Treg细胞可抑制局部免疫活性、支持母体血管增殖,从而促进滋养层的侵袭和胎盘血液的供应。另一方面,妊娠期间,母体外周免疫系统也存在着大量抑制性免疫细胞,如Treg细胞和调节性B细胞（Regulatory B cell,Breg）。作为妊娠外周免疫耐受的重要组成部分,Breg细胞可以促进Treg细胞扩增、抑制Thl分化和树突状细胞成熟,同时降低炎性因子,如TNF-a和IL-6的产生。在妊娠期间的外周免疫耐受中发挥着重要作用。我们的前期研究发现,除Treg细胞和乳腺肿瘤细胞外,人早孕滋养细胞也可表达和分泌IL35,妊娠早期的孕妇外周血中IL-35水平显着升高。因此,我们推测由滋养细胞分泌的IL-35可能诱导了T和B淋巴细胞向iTR35或IL-35+Breg的转化,从而在母胎局部和母体外周发挥免疫调节作用,确保妊娠的顺利进行。在本研究中,我们分别构建了乳腺肿瘤小鼠模型和自然流产小鼠模型:并通过体内、体外实验分别探索IL-35在病理和生理状态下促进免疫抑制、诱导免疫耐受微环境形成的“双刃剑”作用及其机制。本研究不仅丰富和补充了IL-35的研究范围,也为乳腺肿瘤和习惯性流产的治疗提供了新的方向和治疗靶点。第一0分IL-35通过调节乳腺肿瘤细胞来源外泌体的mRNA表达谱促进肿瘤血管生成目的:在肿瘤发展演进和转移的过程中,血管生成对于肿瘤细胞逃逸到血流中和建立远处转移是必不可少的。现有的研究证明,肿瘤细胞可通过分泌各种生物活性介质促进肿瘤血管的生成。外泌体（exosomes）是近年来发现的具有双层磷脂分子膜的细胞外囊泡,能够由大多数细胞分泌并被受体细跑吞噬。对乳腺TME的研宂表明,肿瘤细胞来源的外泌体可以通过与周围的基质细胞交流向受体细胞传递特定信息,从而改善肿瘤细胞的生长环境,促进肿瘤的生长。我们之前的研究表明,乳腺肿瘤细胞和肿瘤局部浸润淋巴细胞均可表达抑制性细胞因子IL-35。在乳腺肿瘤微环境中,肿瘤局部高浓度的IL-35对乳腺肿瘤细胞自身的活性和功能有何影响?经IL-35诱导后的乳腺肿瘤细胞分泌的外泌体是否可对TME中的血管内皮细胞起到调节作用?为回答以上问题,本部分研究将着重探讨乳腺肿瘤细胞分泌的外泌体在TME中的血管生成作用,以及IL-35对这一过程的影响。方法:1.采用超速离心法分离乳腺肿瘤细胞外泌体;通过透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析技术鉴定外泌体的形态和直径;通过Western blotting的方法检测外泌体表面标志蛋白CD9和TSG10]的表达情况。2.应用P1CH67荧光染料标记分离得到的外泌体,鬼笔环肽标记人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）,结合激光共聚焦显微镜观察HUVECs对外泌体的摄取。3.用乳腺肿瘤细胞来源的外泌体（con-Exo）和IL-35刺激后的肿瘤细胞分泌的外泌体（IL-35-Exo）分别诱导HUVECs,利用CCK8及流式细胞术检测HUVECs的增殖活性及细胞周期变化。4.con-Exo和IL-35-Exo分别诱导HUVECs,通过成管试验及鸡胚绒毛尿囊膜血管试验分析HUVECs的成管能力变化。5.采用基因芯片技术分析con-Exo和IL-35-Exo内mRNA表达谱,并筛选出显着差异的基因。6.通过生物信息学手段对差异表达的基因进行聚类分析和功能富集,得到参与外泌体调控血管生成的相关基因和信号通路。并通过构建蛋白互作（Protein-protein interaction,PPI）网络,筛选出关键中枢基因。结果:1.从乳腺肿瘤细胞中分离得到的外泌体为典型双层囊泡结构,直径主要分布在lOOnm左右,可表达外泌体表面标志蛋白CD9和TSGI01。2.乳腺肿瘤细胞来源的外泌体可被HUVECs内吞并且主要富集在细胞质中。3.CCK-8结果显示,乳腺肿瘤细胞来源外泌体显着促进HUVECs增殖;流式细胞术分析结果显示乳腺肿瘤细胞来源外泌体显着增加了处于S期和G2/M期的HUVECs细胞数量。与阴性对照组的外泌体（con-Exo）相比,IL-35-Exo对细胞的增殖活性和周期具有更加明显的促进作用。4.成管试验结果显示,来自乳腺肿瘤细胞的外泌体显着增加了HUVECs网络结构中的总分支长度。在鸡胚绒毛尿囊膜血管试验中,con-Exo和IL-35-Exo均能促进鸡胚绒毛尿囊膜分支血管的形成。与con-Exo组相比,IL-35-Exo刺激组形成更多的微血管。5.通过比较Exo和IL-35-Exo内mRNA表达谱,确定了3508个显着差异表达基因。聚类分析和功能富集结果显示,这些差异基因参与血管生成和细胞增殖等GO项目,并在RAS和PPAR信号通路中发挥作用。PPI网络分析进一步筛选出R-RAS,INSR和KDR等关键中枢基因。结论:本部分的研究表明,乳腺肿瘤细胞来源的外泌体可以被HUVECs内吞,并促进肿瘤微环境中的血管生成。IL-35通过改变乳腺肿瘤细胞来源外泌体的mRNA增强其血管生成作用。本研究证实,IL-35可改变肿瘤细胞的核酸信息,并通过其分泌的外泌体间接促进肿瘤血管的形成和肿瘤的发展。第二部分IL-35通过诱导乳腺肿瘠撖环境中淋巴细胞的转化促进肿瘤进展目的:乳腺肿瘤的复发和转移是造成不良预后的重要原因,其主要机制包括肿瘤细胞耐药、肿瘤免疫耐受微环境的形成和肿瘤细胞逃脱免疫监视等。在肿瘤免疫学中,免疫效应细胞和免疫抑制细胞之间的平衡在肿瘤发生和进展中发挥着至关重要的作用。肿瘤细胞可驯化TME中的免疫细胞,诱导产生免疫抑制性细胞亚群,从而加速免疫逃逸,导致肿瘤恶性进展。最近的研究已经确定了一系列的免疫细胞,如调节性T细胞（Treg）和调节性B细胞（Breg）等,它们是抑制抗肿瘤免疫反应和促进肿瘤进展的关键免疫调节因素。乳腺肿瘤细胞及乳腺TME中的Treg均可表达和分泌免疫抑制性细胞因子IL-35。肿瘤组织内IL-35水平升高被认为是预后不良的因素。我们的体外研究已证实,乳腺肿瘤细胞分泌的IL-35可通过介导T细胞向iTR35细胞的转化。另一方面,IL-35也可抑制B细胞的增殖,并介导B细胞转化为可分泌IL-10和IL-35的Breg细胞亚群,即丨L-35+Breg。乳腺TME中高水平的IL-35是否会通过诱导TME的浸润淋巴细胞转化为抑制性淋巴细胞,进而促进免疫抑制的形成?本研宂通过建立小鼠荷瘤模型,模拟高IL-35的肿瘤微环境,通过体内实验探索IL-35对乳腺TME中浸润淋巴细胞分化的诱导作用,以及IL-35对TME血管生成、肿瘤局部进展及远处转移的影响。方法:1.将小鼠乳腺癌4T1细胞悬液接种到BALB/c雌鼠胸壁皮下,构建小鼠荷乳腺肿瘤模型。2.将成瘤的BALB/c小鼠随机分为两组,对照组肿瘤给予PBS注射,实验组肿瘤给予IL-35注射,观察并记录肿瘤的生长曲线。3.利用磁珠分离CD19+B和CD4+T细胞,流式细胞术检测两组小鼠肿瘤内淋巴细胞分化情况。4.免疫组织化学方法检测不同组别中与细胞增殖相关的核抗原Ki67和血管内皮细胞标志物CD31表达,并对其在肿瘤组织中的表达强度和范围进行评分用以评估肿瘤增殖情况及血管密度。同时分离小鼠肺脏,免疫组织化学方法检测肺转移瘤情况。结果:1.与对照组相比,IL-35处理组的小鼠肿瘤生长速度较快且肿瘤体积显着增大。免疫组化结果显示,IL-35处理组肿瘤组织内Ki67阳性细胞的比例明显升高。2.与对照组相比,IL-35处理组小鼠肺脏乳腺肿瘤转移灶明显增多。3.流式细胞术检测结果显示,IL-35可诱导乳腺肿瘤TME中的淋巴细胞转化为iTR35及IL-35+Breg。4.免疫组化结果显示,IL-35处理组小鼠乳腺肿瘤内CD3]阳性细胞比例显着高于对照组。结论:本部分研究证实,IL-35可通过直接刺激肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤局部免疫抑制性淋巴细胞的转化,以及间接促进肿瘤血管的生成,形成有利于肿瘤生长的微环境,为肿瘤细胞的发展和转移创造有利条件。第三部分IL-35通过诱导淋巴细胞转化维持面期免疫耐受目的:在第二部分的研究中,我们主要探讨了IL-35在病理性环境（肿瘤微环境）中促进局部免疫耐受的作用和机制。本部分研究则主要聚焦于IL-35在生理性环境（妊娠）中促进免疫耐受的作用。妊娠早期的母体中存在大量免疫耐受淋巴细胞与抑制性细胞因子,与肿瘤的免疫耐受特性相似。妊娠期的免疫耐受主要包括母胎界面免疫耐受及外周免疫耐受。母胎界面中富含大量的T细胞。滋养层细胞可通过分泌IL-10、胸腺基质淋巴细胞生成素等细胞因子,调节ThlATi2平衡,增加Th2细胞含量,并抑制母胎界面Thl7细胞的免疫效应。我们先前的研究表明,妊娠早期滋养细胞可表达并分泌免疫抑制细胞因子IL-35,并且早孕妇女外周血中IL-35水平显着升高。考虑到IL-35的免疫抑制作用及其在滋养层细胞中的表达,我们推测母胎界面中IL-35可能通过诱导iTR35细胞分化参与维持母胎耐受。此外,作为抑制性免疫细胞的重要组成部分,Breg细胞可通过调节外周免疫应答在自身免疫性疾病和感染中发挥调节作用。作为Breg细胞的重要亚群,IL-10+Breg细胞（也被称为B10）通过分泌IL-10来发挥免疫抑制功能。BIO细胞在小鼠脾脏中呈现CD19+CD5+CDldhi表型。此外,IL-35可抑制B细胞的增殖,并介导B细胞转化为一种新的Breg细胞亚群:IL-35+Breg,该亚群通过分泌IL-35发挥免疫抑制作用。在前一部分的研究中我们证实,IL-35可通过促进乳腺肿瘤浸润的iTR35及IL-35+Breg细胞扩增促进肿瘤进展及肿瘤局部免疫耐受的形成。本部分研究将通过妊娠小鼠模型进一步探讨IL-35在促进T和B淋巴细胞转化,维持妊娠期免疫耐受中的作用。由于B淋巴细胞很少存在于母胎界面,因此我们主要研究了Breg细胞在妊娠期间外周免疫耐受中的调节作用。此外,妊娠期间,母体外周血中雌二醇（E2）及人绒毛膜促性腺激素（hCG）水平发生剧烈变化,其在免疫反应调控中的作用也在以往的研究中得到了证实。在本部分研究中,我们也探讨了这些妊娠相关激素在抑制性淋巴细胞转化中的作用和相关机制。方法:1.构建自然流产小鼠模型CBA/JXDBA/2J和正常妊娠小鼠模型CBA/JxBALB/c。2.通过Westen blotting的方法检测孕鼠母胎界面IL-35含量。流式细胞术检测孕鼠脾脏内BI0细胞的比例以及母胎界面iTR35含量。3.将小鼠重组IL-35细胞因子及IL-35中和性抗体分别对不同组孕鼠进行腹腔注射治疗,观察其对流产的影响以及母胎界面iTR35含量变化。4.提取未孕鼠脾脏原代CD19+B细胞,在体外用妊娠相关激素（人绒毛膜促性腺激素hCG,雌激素E2）及IL-35进行培养及诱导。采用CCK8检测诱导后的B细胞增殖情况。流式细胞术分析诱导后B10和IL-35+Breg的比例变化。5.通过Westen blotting的方法检测妊娠相关激素（人绒毛膜促性腺激素hCG,雌激素E2）及IL-35诱导产生B10和IL-35+Breg的相关信号通路和转录因子。结果:1.自然流产孕鼠胚胎丢失率明显高于正常妊娠孕鼠。2.自然流产孕鼠母胎界面IL-35水平和iTR35细胞的比例显着低于正常妊娠孕鼠。3.IL-35治疗显着提髙了母胎界面iTR35含量并抑制流产的发生;而IL-35中和性抗体则降低了母胎界面iTR35含量并增加了胎盘丢失率。4.正常妊娠孕鼠外周B10细胞明显扩增,而自然流产孕鼠的外周B10细胞比例则显着低于正常妊娠孕鼠。5.IL-35和hCG均能抑制小鼠脾脏B细胞的增殖。IL-35可激活B细胞内的STAT1和STAT3蛋白,诱导其转化生成B10及IL-35+Breg。hCG可促使小鼠B细胞内的STAT3磷酸化,诱导其转化生成BIO。E2在小鼠脾脏B细胞增殖及诱导转化方面无显着作用。结论:本部分研究证实,IL-35可分别在母胎界面和母体外周诱导抑制性iTR35细胞和IL-35+Breg、B10细胞产生,从而促进了母胎局部及妊娠期外周的免疫耐受形成。妊娠相关激素hCG也在外周B10细胞的诱导中发挥着重要作用。我们的研究为IL-35在治疗复发性流产中的应用提供了新的依据,具有重要的临床应用价值。
郑高颖[6]（2020）在《CD4+CD25+调节性T细胞在J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受中的作用机制研究》文中研究表明J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）诱导鸡免疫耐受是肿瘤发生的先决条件。然而,病毒诱导免疫耐受的原因和致病机制尚不完全明确。先前研究显示,ALV-J可以导致免疫器官中淋巴细胞的严重耗竭,提示T、B淋巴细胞受到了严重的损伤与抑制,也提示免疫抑制性作用在机体中占主导作用。而且有大量研究表明,CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）在维持机体的免疫耐受中发挥着重要的调控作用,参与多种慢性感染性疾病的发展过程。那么,Tregs是否参与了ALV-J诱导的免疫耐受,且通过何种方式发挥作用?因此,为解析Tregs在ALV-J诱导免疫耐受中的作用,本研究通过建立ALV-J免疫耐受模型,从多个角度评估了免疫应答能力的损伤,利用分子生物学技术,系统研究和阐述了ALV-J先天感染下CD4+CD25+Tregs在鸡免疫器官及血液中的动态变化及其与细胞因子、病毒载量变化之间的关系,以期揭示CD4+CD25+Tregs在ALV-J诱导的免疫耐受中可能发挥的作用及其病理机制。为模拟ALV-J诱导的机体持续性免疫耐受过程,通过在6胚龄尿囊腔注射ALV-J,建立了先天感染动物模型,通过ELISA与qPCR方法检测到感染鸡体内持续带毒且不产生特异性抗体,确定成功建立免疫耐受模型,以便后续试验展开。通过大体剖检观察与免疫指数检测以及病理组织学观察,对鸡免疫器官的损伤进行评估。大体剖检结果显示,ALV-J感染组鸡的胸腺、法氏囊和脾脏等免疫器官发育不良,表现为体积较小且免疫指数显着降低等特征。病理学组织检查结果进一步显示感染组鸡胸腺、法氏囊中的间质结缔组织较多,而淋巴小结或淋巴滤泡发育不良,淋巴细胞数量较正常组少,提示ALV-J感染后淋巴细胞损伤严重。为进一步探究ALV-J对淋巴细胞的损伤,通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）等方法检测了法氏囊B细胞数量及脾脏中B细胞的数量分布、发育分化能力,结果显示感染组鸡法氏囊与脾脏B细胞数量显着减少,脾脏中IgM+和IgG+浆细胞数量显着减少。上述结果提示,ALV-J抑制了B细胞的增殖以及发育分化。为探究T细胞在ALV-J感染后的免疫功能变化,通过FCM和qPCR方法连续分析和监测了鸡血液及免疫器官中CD4+、CD8+T细胞亚群比例和细胞因子表达量的变化,FCM结果显示,ALV-J感染后免疫器官和血液的CD4+T细胞亚群比例显着下降,尤其在7日龄下降最为显着;而CD8+T细胞亚群比例在早期的血液和脾脏、盲肠扁桃体显着下降,但是在胸腺、法式囊显着上升,后期时各器官均与对照组无差异。qPCR结果显示,ALV-J感染后IL-2、IL-4的表达量持续降低,IFN-γ表达量早期有升高也有降低趋势,在45日龄几乎与对照组无差异,IL-10表达量的持续升高。上述结果提示ALV-J抑制了T细胞的增殖与功能,对CD4+T细胞的抑制较严重,且机体免疫抑制功能占主导。上述实验结果提示ALV-J感染后免疫负调控的细胞亚群被激活,为解析CD4+CD25+Tregs在ALV-J诱导免疫耐受中的作用,运用FCM连续监测了760日龄鸡免疫器官及血液中CD4+CD25+Tregs频率的变化规律,结果显示,ALV-J感染后血液与免疫器官中Tregs频率显着升高,尤其是在幼龄时期（715日龄）,随着日龄的增长,Tregs频率仍然维持着在某些免疫器官中的波动性增长。进一步通过FCM分选出CD4+CD25+Tregs亚群,qPCR检测细胞中IL-10、TGF-β、CTLA-4的转录水平,结果显示,胸腺、法氏囊、脾脏的IL-10、TGF-β、CTLA-4均显着上升,且与CD4+CD25+Tregs数量升高趋势几乎相同,而盲肠扁桃体的Tregs数量升高趋势仅与IL-10的转录水平升高趋势一致,TGF-β、CTLA-4的转录水平仅在个别日龄升高。以上结果提示,ALV-J感染导致免疫器官和血液的CD4+CD25+Tregs持续增殖,并通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子以及表达CTLA-4等表面抑制性因子发挥免疫抑制功能;且不同免疫器官的Tregs活化的能力强弱不同。为进一步探究不同免疫器官中Tregs免疫功能的差异是否与病毒相关,通过qPCR对免疫器官中ALV-J病毒载量进行动态监测。结果显示,ALV-J的病毒载量变化趋势与Tregs频率与功能变化趋势呈正相关,而且Tregs免疫抑制功能较低的盲肠扁桃体的病毒载量较其他免疫器官最低。以上现象提示,ALV-J可以诱导机体的Tregs大量增殖,但是Tregs功能的激活需要达到一定的病毒载量。也提示ALV-J可以在Tregs中复制,为验证该推论,通过FCM检测了CD4+CD25+Tregs中ALV-J的表达情况,结果显示,约50%的Tregs表面表达ALV-J的SU蛋白。也证明了ALV-J可以在Tregs中复制,即ALV-J可直接作用于Tregs。综上所述,CD4+CD25+Tregs在体内的持续增殖活化是ALV-J诱导持续性免疫耐受的重要原因,胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官的Tregs发挥重要免疫抑制功能。ALV-J可直接作用于Tregs,诱导机体的Tregs大量增殖,但是Tregs功能的激活需要达到一定的病毒载量。不过,ALV-J与Tregs互相作用的分子机制仍需更深入的研究。
隗继浩[7]（2020）在《新橙皮苷二氢查耳酮对OVA诱导口服耐受的影响》文中研究说明食物过敏已被世界卫生组织列为五大重要的公共卫生问题之一。人体早期接触过敏原可诱导机体产生免疫耐受,但受自身生理条件以及饮食习惯的影响,可能会抑制免疫耐受的形成,诱导食物过敏的发生。研究表明,某些食品甜味剂有可能会打破机体免疫耐受,诱导食物过敏。新橙皮苷二氢查耳酮（Neohesperidin dihydrochalcone,NHDC）是由新橙皮苷氢化得到的黄酮类衍生物,是一种具有良好遮苦效果的功能性甜味剂,现在被广泛应用于食品、医疗、饲料等领域,具有甜味高、热量小、余味持久的特点。然而,关于NHDC是否会打破口服耐受诱导食物过敏方面的研究尚未报道。本研究通过卵白蛋白（OVA）诱导小鼠建立口服耐受模型,考察NHDC对口服耐受的影响,并明确作用机制;通过建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型,研究NHDC对细胞脱颗粒的影响。具体研究内容如下:体内试验:通过建立OVA诱导的小鼠口服耐受模型,检测小鼠体重、体温、粪便状态、血清中特异性IgE、IgG1、MCP-1含量,考察NHDC对口服耐受的影响;通过检测脾脏中免疫T细胞CD4+T/CD8+比值、CD4+CD25+T比值,以及结肠组织GATA3、STAT5、Foxp3、MHCⅡ、CXCR1、CCR7蛋白水平的表达,明确NHDC作用机制。结果表明,耐受组和NHDC作用组能够显着抑制由食物过敏导致的体重减轻、体温下降和腹泻症状,显着降低血清中特异性抗体水平,说明口服耐受的建立有利于减轻食物过敏引起的症状,且NHDC在一定程度上能够有效抑制特异性抗体含量升高;耐受组与NHDC组中小鼠体内的免疫T细胞比例趋于正常水平,并且显着降低了结肠组织中GATA3、MHCⅡ、CXCR1蛋白水平的表达,提高了STAT5、Foxp3、CCR7蛋白表达水平,且相对于耐受组,NHDC组对于蛋白表达的影响更大,由此证明,NHDC对口服耐受的建立有一定的促进作用。体外试验:通过原子力显微镜考察NHDC对细胞形态变化的影响,检测细胞中β-HEX、组胺和白介素-4的释放情况,探讨NHDC对RBL-2H3细胞脱颗粒的抑制作用;通过考察Ca2+内流、细胞ERK、JNK、p-38蛋白表达情况,研究NHDC的作用机制。结果表明,NHDC对β-HEX、组胺、白介素-4的释放都有一定的抑制作用,由此证明,NHDC能够显着抑制RBL-2H3细胞脱颗粒;NHDC能够抑制Ca2+内流以及ERK、JNK、p-38蛋白的磷酸化,由此抑制了MAPK通路,进而实现对RBL-2H3细胞的脱颗粒的抑制作用。
刘芮伶[8]（2020）在《MiR-21-Tipe2调控口服免疫耐受和miR-21-Pdcd4调控葡萄糖耐受的机制研究》文中进行了进一步梳理miR-21是较早发现的人类微小RNA（miRNA）之一,其作为癌基因参与转录后的基因调控,在细胞的分化、增殖以及凋亡中等都发挥着非常重要的作用。虽然关于miR-21在肿瘤的发生和发展中的作用和机制研究取得了较大的进展,但是由于miR-21可以调控多个靶点的表达,因此越来越多的研究发现miR-21在其它的生物学功能中也发挥了重要的作用。树突状细胞（DC）在免疫调控中发挥了重要的作用。骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）在分化完成以后处于半成熟状态,可发挥免疫耐受的作用,而BMDCs在遇到刺激以后可变成完全成熟的状态,从而激活相关的免疫反应,因此DC的分化和发育有一个从半成熟到成熟的过程,而半成熟和成熟阶段的DC对免疫反应可发挥相反的调控作用。有研究报道miR-21在肾缺血再灌注模型中抑制DC的完全成熟,我们的前期研究发现miR-21在BMDCs的分化过程中抑制DC的半成熟,而作为miR-21的直接靶基因,虽然肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8样2（TNFAIP8L2或Tipe2）抑制刺激介导的DC完全成熟,但是在BMDCs的分化过程中Tipe2促进细胞的半成熟。虽然miR-21和Tipe2在调控DC完全成熟过程中的作用和机制已经有了相关的研究,但由于调控DC半成熟和完全成熟的机制不尽相同,因此miR-21和Tipe2在BMDCs分化过程中调控DC半成熟的机制及在免疫耐受中的作用目前尚不清楚;此外,亦有报道在胰岛细胞株中过表达miR-21降低GSIS（葡萄糖刺激介导的胰岛素分泌）。但是,考虑到利用细胞株和过表达微小RNA进行研究的局限性,从细胞株中得到的结论仍然需要在原代细胞中进行验证,而利用基因缺失小鼠来进行相关研究仍然是揭示疾病发病机制的金标准。在本研究中,我们利用miR-21全身性缺失小鼠(miR-21-/-)、Tipe2全身性缺失小鼠(Tipe2-/-)和miR-21胰岛β细胞特异性缺失小鼠（miR-21βKO）来探索miR-21及其靶基因调控口服免疫耐受和葡萄糖耐受的机制。我们的结果主要体现在以下两个方面:1.miR-21-Tipe2通路在BMDCs分化过程中抑制DC半成熟并促进口服免疫耐受通过检测BMDCs分化过程中miR-21和Tipe2的表达,我们发现miR-21和Tipe2的表达呈现负相关的关系,即在BMDCs分化初期miR-21的表达水平较低,Tipe2的表达水平较高,而在BMDCs分化后期miR-21的表达水平逐渐升高,Tipe2的表达水平逐渐降低。已知Tipe2是miR-21的直接调控靶点,我们的数据也显示在缺失miR-21的BMDCs中Tipe2的表达较WT（野生型,wild type）明显升高,并且缺失miR-21的BMDCs表达更强的成熟标志,而缺失Tipe2的BMDCs表达较低的成熟标志,因此我们认为miR-21可能通过负调控Tipe2的表达从而在BMDCs分化过程中抑制细胞半成熟。机制研究发现,Tipe2在BMDCs分化过程中可以激活PDK1-PKC?-MAPK信号通路,进而促进BMDCs成熟标志的表达。成熟度低的DC可以在外周诱导调节性T细胞（pTregs）的产生,我们的研究发现,Tipe2的缺失导致肠道粘膜中外周调节性T细胞（pTreg）的比例显着增加。2.miR-21-Pdcd4通路维持葡萄糖耐受通过比较野生型和miR-21βKO小鼠的葡萄糖耐受能力,我们发现胰岛β细胞特异性缺失miR-21小鼠呈现严重的葡萄糖耐受缺陷和胰岛素分泌缺陷,这与用胰岛细胞株得到的结果不一致;机制研究发现,虽然β细胞特异性缺失miR-21不影响胰岛?细胞的数目和大小、胰岛素的合成以及胰岛素的转运和释放,但是miR-21βKO小鼠胰岛的葡萄糖转运蛋白2（Glut2）表达显着降低。进一步研究发现,miR-21通过miR-21-Pdcd4-AP-1信号通路促进Glut2的表达。更为重要的是,我们的研究发现在2型糖尿病db/db小鼠胰腺中特异性增加miR-21可以显着降低血糖水平。综上所述,我们的研究发现:1)在BMDCs分化过程中,miR-21可能通过负调控Tipe2的表达从而抑制BMDCs的半成熟,而Tipe2通过激活PDK1-PKC?-MAPK信号通路来促进BMDCs的半成熟并抑制口服免疫耐受;2)在胰岛β细胞中,miR-21-Pdcd4通路促进Glut2的表达从而促进胰岛素的分泌和维持葡萄糖耐受,在2型糖尿病小鼠胰腺中特异性增加miR-21可以显着降低血糖水平。以上结果也提示,miR-21可能是预防和治疗炎症相关疾病以及2型糖尿病的一个重要靶点。
姚仲鹏[9]（2020）在《阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受》文中指出目的:研究阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞（ECDI-SPs）能否协同诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受,并探讨其作用机制,为临床诱导预致敏受者免疫耐受提供新的方法。方法:（1）通过皮肤移植（BALB/c→C57BL/6）使小鼠致敏,在受体小鼠致敏6周后行心脏移植建立（BALB/c→C57BL/6）预致敏小鼠心脏移植模型。（2）实验分为空白对照组、单独ECDI-SPs组、单独抗OX40L抗体组、ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组,并设置单独IgG对照组、ECDI-SPs联合IgG对照组,共6个分组（n=5-6）。（3）根据实验分组,于受体小鼠于心脏移植术前7天、手术当天和术后第7、14天（d-7、d0、d7、d14）通过阴茎背静脉予输注1×108 ECDI-SPs;在心脏移植术当天至术后第10天（d0-d10）,每天腹腔注射抗OX40L抗体（0.5 mg/只）,IgG给药方法与抗OX40L抗体一致。术后每天触诊移植心脏,以移植心脏停跳定义为排斥时间点并记录移植心脏存活时间。（4）对联合处理组小鼠,即ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组小鼠,于心脏移植术前2天、手术当天及术后第2天（d-2、d0、d2）腹腔注射抗CD25抗体（0.5mg/只）,同时使用IgG（0.5mg/只）作为对照,给药方法与抗CD25抗体一致,比较两组小鼠移植心脏存活时间和Tregs比例。（5）对ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组小鼠,在心脏移植术后第30、100天（d30、d100）分别过继输注供体小鼠（BALB/c）预致敏和第三方供体小鼠（C3H）预致敏的受体小鼠（C57BL/6）脾脏来源的纯化T细胞（5×106;纯度>97%）,比较两组小鼠移植心脏存活时间和Tregs比例。（6）流式细胞术检测各实验组小鼠脾脏中记忆性T细胞（包括CD4+CD44+Tms,CD8+CD44+Tms）和调节性T细胞（CD4+CD25+Foxp3+Tregs）的比例。（7）体外混合淋巴细胞反应实验:提取各实验组受体小鼠脾脏CD11c+DC细胞作为刺激细胞,供体小鼠脾脏CD3+T细胞作为反应细胞,将刺激细胞以2.5×104/well密度、反应细胞以1×105/well密度进行混合培养（刺激细胞和反应细胞比例为1:4）,培养96小时后收集细胞用于检测各组小鼠T细胞增殖程度。（8）HE染色观察移植心脏病理改变情况,通过ELISA方法检测各组小鼠血清中炎症细胞因子（IFN-γ和IL-6）的水平。结果:（1）小鼠经皮肤移植预致敏后体内脾脏中Tms比例小幅升高,当行心脏移植后Tms比例显着升高,最高可达50%以上;而采用抗OX40L抗体阻断OX40/OX40L通路后可同时抑制预致敏小鼠和预致敏行心脏移植小鼠Tms的扩增。（2）与对照组相比,单独ECDI-SPs组和单独抗OX40L抗体组均可显着延长预致敏小鼠移植心脏存活时间,其平均存活时间分别约为25天和38天,而ECDI-SPs+抗OX40L抗体组可诱导66.7%预致敏小鼠移植心脏长期存活（>100天）。（3）与对照组、单独ECDI-SPs组和单独抗OX40L抗体组相比,ECDI-SPs+抗OX40L抗体组可显着减轻移植心脏病理损伤和减少炎症细胞浸润,抑制Tms扩增,抑制血清中促炎症因子IFN-γ和IL-6释放,上调脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Tregs百分比,降低外周血中抗供体抗体水平。（4）在体外MLR实验中,对照组中T细胞被DC细胞刺激后显着增殖;单独使用抗OX40L抗体组和单独使用ECDI-SPs组的T细胞的增殖水平明显低于对照组;而ECDI-SPs+抗OX40L抗体组的T细胞的增殖水平最低,直到术后第100天仍维持在低水平。（5）在ECDI-SPs+抗OX40L抗体组中,围手术期通过注射抗CD25抗体清除受体小鼠体内的Tregs可阻断已建立的移植免疫耐受;（6）在ECDI-SPs+抗OX40L抗体组中,过继输注供体来源T细胞可抑制Tregs扩增并破坏已存在的免疫耐受,而输注第三方供体来源T细胞未能打破免疫耐受,因此推测ECDI-SPs+抗OX40L抗体诱导的免疫耐受具有供体特异性。结论:阻断OX40/OX40L通路联合ECDI-SPs可通过共同诱导调节性T细胞产生和扩增、抑制记忆性T细胞分化和扩增、抑制促炎症因子的释放、降低抗供体抗体水平,从而诱导预致敏小鼠心脏移植物的长期存活,并获得供体特异性免疫耐受。
严诗丝[10]（2020）在《从TGF-β1切入研究中医药多途径介入肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET长方案患者免疫耐受的机制》文中进行了进一步梳理【目的】探究转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）、叉头状/翼状螺旋转录因子3（forkhead or winged helix transcription,FOXP3）细胞免疫调节机制;观察中医药多途径介入肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET长方案患者治疗前后外周血TGF-β1、Treg及FOXP3表达水平的变化,比较治疗前后表达水平的差异,并分析TGF-β1、Treg、FOXP3表达水平变化与临床疗效的相关性,探究中医药多途径干预调控再次IVF-ET长方案患者的免疫耐受机制,给中医药临床助孕提供理论支撑。【方法】1. 根据纳入标准和排除标准纳入2016年09月至2018年02月于四川大学华西第二医院长方案失败后拟再次行IVF-ET长方案肾虚肝郁血瘀型患者20例,分为治疗组和自然等待组,每组各10例。治疗组于成都中医药大学附属医院中医妇科予中药口服、穴位贴压、直肠导法治疗3个月;同期纳入的自然等待组于长方案失败后自然等待3个月。治疗组患者分别在干预前和干预3个月后的黄体中期,即LH峰后6～7天[d（LH+6）],P≥5ng/ml,Gn RH-a启动前抽取空腹静脉血5ml;自然等待组在IVF-ET失败后和自然等待3个月后于相同时间点抽取空腹静脉血5ml。2.采用ELISA方法检测外周血TGF-β1、FOXP3蛋白表达量;同时应用实时荧光PCR技术检测外周血TGF-β1m RNA、FOXP3m RNA的表达量;采用流式细胞术分析Treg细胞表达量,在Excel中将检测的数据资料录入整理后,对录入的数据采用SPSS 25.0统计软件进行统计比较与分析。采用空白对照和自身前后对照方法,观察两组患者再次IVF-ET前后妊娠结局及中医证候疗效的情况、患者自身前后及两组之间的外周血TGF-β1、FOXP3及Treg细胞表达水平的变化,分析他们表达水平变化之间的相关性,探讨中医药多途径介入以补肾益精、疏肝活血法干预再次IVF-ET患者调节免疫耐受及助孕的作用机制。【结果】1. 自然妊娠率:两组各10例IVF-ET失败拟再次行IVF-ET长方案患者,治疗组干预期间自然妊娠3例,自然等待组等待后IVF-ET治疗前自然妊娠0例。治疗组自然妊娠率高于自然等待组（P<0.05）。2. 再次IVF-ET妊娠结局:治疗组7例行再次IVF-ET长方案治疗,其中3例IVF-ET着床成功;自然等待组10例行再次IVF-ET长方案治疗,2例IVF-ET着床成功,其中包含1例生化妊娠。治疗组临床妊娠率高于自然等待组（P<0.05）。3. 中医证候积分及疗效:治疗组患者多途径干预后肾虚肝郁血瘀型中医证候积分值明显较干预前降低（P<0.05）;自然等待组患者未行中医药干预等待前后肾虚肝郁血瘀型证候积分值差异不明显（P>0.05）。两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组中医证候疗效总有效率显着高于自然等待组（P<0.05）。4. TGF-β1:治疗组中医药多途径干预后TGF-β1蛋白、TGF-β1m RNA表达水平明显高于干预前（P<0.05）;自然等待组未行中医药干预等待前后TGF-β1蛋白、TGF-β1m RNA表达水平差异不明显（P>0.05）;两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组干预后TGF-β1m RNA表达水平高于自然等待组等待后水平（P<0.05）。5. FOXP3:治疗组中医药多途径干预前后比较,FOXP3蛋白、FOXP3m RNA表达水平干预后明显高于干预前（P<0.05）。自然等待组未行中医药干预等待前后FOXP3蛋白、FOXP3m RNA表达水平差异不具有统计学意义（P>0.05）。两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组FOXP3m RNA表达水平治疗组高于自然等待组（P<0.05）。6. Treg:治疗组中医药多途径介入干预三个月后Treg表达水平明显高于干预前（P<0.05）;自然等待组等待前后Treg细胞表达水平差异无明显变化（P>0.05）;两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组干预后Treg表达高于自然等待组等待后表达水平（P<0.05）。7. TGF-β1与Treg表达水平呈正相关（r=0.649,P=0.042）,中医证候积分变化与FOXP3值（r=-0.363,P=0.021）、Treg值（r=-0.334,P=0.035）前后变化呈负相关性。8.3例自然妊娠患者的外周血TGF-β1、FOXP3、Treg表达在中医药多途径干预后均升高;TGF-β1、FOXP3及Treg在干预/等待前后表达水平趋势升高在5例IVF-ET着床成功患者中所占的比例分别是80.0%、80.0%、100%,在8例妊娠患者中分别是87.5%、87.5%、100%。TGF-β1与Treg的变化趋势与妊娠结局有统计学意义（P<0.05）。【结论】中医药多途径干预肾虚肝郁血瘀型IVF-ET长方案失败患者可改善患者妊娠结局及肾虚肝郁血瘀型中医临床症状;初步得出其机制可能是:以补肾益精、疏肝活血法的中医药多途径治疗,可上调IVF-ET长方案移植失败患者外周血TGF-β1的表达水平,诱导Treg细胞的“核转录因子、重要调控基因”FOXP3的表达,促使初始性CD4+T细胞分化成Treg细胞,使母胎界面局部Treg细胞表达量得以扩增,介导母胎免疫耐受,发挥免疫抑制作用,保护半同种异体移植物免受母体免疫的攻击而顺利植入,从而帮助着床。
二、调节性T细胞与免疫耐受（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、调节性T细胞与免疫耐受（论文提纲范文）
（1）调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.1.1 检索人及检索时间 |
| 1.1.2 检索文献时限 |
| 1.1.3 检索数据库 |
| 1.1.4 检索词 |
| 1.1.5 检索文献类型 |
| 1.1.6 手工检索情况 |
| 1.1.7 检索策略 |
| 1.1.8 检索文献量 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.2.1 纳入标准 |
| 1.2.2 排除标准 |
| 1.3 数据提取 |
| 2结果Results |
| 2.1 调节性T细胞的研究历程 |
| 2.2 调节性T细胞的亚型及分类 |
| 2.3 调节性T细胞的作用机制 |
| 2.4 调节性T细胞在肝移植抑制同种异体排斥反应中的作用 |
| 2.4.1 肝移植后检测调节性T细胞的变化对肝移植后的排斥反应预测具有重要意义 |
| 2.4.2 在肝移植前向受体输注调节性T细胞能够减轻术后的排斥反应 |
| 2.5 调节性T细胞在肝移植后受者免疫耐受中的作用 |
| 2.5.1 肝移植后免疫耐受组受者体内调节性T细胞升高 |
| 2.5.2 体外输注调节性T细胞能够使患者部分或者完全停用免疫抑制剂 |
| 3 讨论Discussion |
| 3.1 既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题 |
| 3.2 该综述区别于他人他篇的特点 |
| 3.3 综述的局限性 |
| 3.4 综述的意义 |
（2）原发性肾病综合征与牛奶蛋白过敏中调节性T细胞应答异常及DOCK8缺陷致B细胞早期活化异常的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 儿童原发性肾病综合征中调节性T细胞稳定性、可塑性、功能异常及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 研究非IgE介导型牛奶蛋白过敏中肠道菌群失调对调节性T细胞介导的肠道免疫耐受和免疫稳态的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 Dock8 缺陷对B 细胞早期激活及记忆性B 细胞活化的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控T细胞免疫应答的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（4）T细胞亚群及其免疫检查点分子在妊娠过程中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 正常、子痫前期和妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群及其免疫检查点分子的表达及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象与标本收集 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 2 主要试剂与仪器 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 3 实验方法与步骤 |
| 4 统计性分析 |
| 结果 |
| 1 正常产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群百分比 |
| 2 正常产妇外周血、宫腔血和脐血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 3 正常产妇外周血、宫腔血和脐血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 4 子痫前期产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群百分比 |
| 5 子痫前期产妇外周血、宫腔血和脐血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 6 子痫前期产妇外周血、宫腔血和脐血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 7 妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群百分比 |
| 8 妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 9 妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和 CTLA-4 的表达水平 |
| 讨论 |
| 第二部分 正常妊娠、原因不明复发性流产和妊娠期糖尿病妇女外周血T细胞亚群及其免疫检查点分子的表达及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象与标本收集 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 2 主要试剂与仪器 |
| 3 实验方法与步骤 |
| 4 统计性分析 |
| 结果 |
| 1 正常妊娠妇女外周血T细胞亚群百分比 |
| 2 正常妊娠妇女外周血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 3 正常妊娠妇女外周血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4的表达水平 |
| 4 原因不明复发性流产妇女外周血T细胞亚群百分比 |
| 5 原因不明复发性流产妇女外周血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 6 原因不明复发性流产妇女外周血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 7 妊娠期糖尿病妇女外周血T细胞亚群百分比 |
| 8 妊娠期糖尿病妇女外周血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 9 妊娠期糖尿病妇女外周血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表（附录） |
| 致谢 |
（5）IL-35在免疫耐受微环境形成及肿瘤血管生成中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 IL-35通过调节乳腺肿瘤细胞来源外泌体的mRNA表达谱促进肿瘤血管生成 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 6.附图 |
| 第二部分 IL-35通过诱导乳腺肿瘤微环境中淋巴细胞的转化促进肿瘤进展 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 6.附图 |
| 第三部分 IL-35通过诱导淋巴细胞转化维持妊娠期免疫耐受 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 6.附图 |
| 创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
（6）CD4+CD25+调节性T细胞在J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽白血病病毒概述 |
| 1.1.1 禽白血病病毒特征及分类 |
| 1.1.2 J亚型禽白血病病毒的致病特性 |
| 1.2 J亚群禽白血病病毒诱导的免疫耐受及研究进展 |
| 1.2.1 J亚群禽白血病诱导的免疫耐受 |
| 1.2.2 J亚群禽白血病诱导的免疫耐受研究进展 |
| 1.3 调节性T细胞在介导免疫耐受中的作用 |
| 1.3.1 调节性T细胞的分类及作用特点 |
| 1.3.2 调节性T细胞在机体免疫系统中的调节作用 |
| 1.3.3 调节性T细胞在感染性疾病中的调节作用 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要缓冲液 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 试验地点 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 细胞的传代培养 |
| 2.2.3 病毒的纯化与扩增 |
| 2.2.4 病毒滴度的测定 |
| 2.2.5 鸡胚内病毒接种 |
| 2.2.6 ALV-J p27 抗原检测 |
| 2.2.7 抗ALV-J抗体检测 |
| 2.2.8 免疫指数检测 |
| 2.2.9 鸡免疫器官病理组织学观察 |
| 2.2.10 免疫组织化学检测 |
| 2.2.11 免疫荧光检测 |
| 2.2.12 流式细胞术的分析与分选 |
| 2.2.13 荧光定量PCR |
| 2.2.14 ALV-J绝对荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.2.15 生物统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ALV-J先天感染免疫耐受鸡模型的建立 |
| 3.2 ALV-J对鸡免疫器官的损伤及评估 |
| 3.2.1 免疫器官的形态学评估 |
| 3.2.2 病理组织学观察 |
| 3.3 ALV-J感染对B细胞增殖与功能的影响 |
| 3.4 ALV-J感染对T细胞增殖与功能的影响 |
| 3.4.1 ALV-J感染后血液与免疫器官CD4+、CD8+T细胞比例变化规律 |
| 3.4.2 ALV-J对 T细胞分泌细胞因子能力的影响 |
| 3.5 ALV-J感染后CD4+CD25+调节性T细胞频率的变化规律 |
| 3.6 ALV-J对 CD4+CD25+调节性T细胞分泌抑制性因子能力的影响 |
| 3.7 ALV-J感染鸡病毒载量的变化规律 |
| 3.7.1 ALV-J绝对荧光定量检测体系的建立 |
| 3.7.2 ALV-J感染鸡免疫器官病毒载量的变化规律 |
| 3.8 ALV-J对 CD4+CD25+调节性T细胞具有嗜性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ALV-J先天感染诱导的持续性免疫耐受 |
| 4.2 ALV-J感染后免疫功能低下 |
| 4.3 ALV-J诱导的免疫耐受状态下CD4+CD25+调节性T细胞持续增殖活化 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（7）新橙皮苷二氢查耳酮对OVA诱导口服耐受的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食物过敏概述 |
| 1.1.1 食物过敏 |
| 1.1.2 食物过敏反应机制 |
| 1.1.3 免疫耐受与食物过敏的关系 |
| 1.2 免疫耐受 |
| 1.2.1 免疫耐受机制 |
| 1.2.2 免疫耐受的人工诱导 |
| 1.2.3 口服免疫耐受模型的建立 |
| 1.3 新橙皮苷二氢查耳酮 |
| 1.3.1 NHDC的结构和理化性质 |
| 1.3.2 NHDC的研究现状 |
| 1.4 本论文研究意义和内容 |
| 第二章 新橙皮苷二氢查耳酮对OVA诱导口服耐受的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 主要仪器与实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及实验动物 |
| 2.2.3 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验分组 |
| 2.3.2 口服耐受模型建立 |
| 2.3.3 小鼠体重测定 |
| 2.3.4 小鼠体温测定 |
| 2.3.5 小鼠腹泻评分 |
| 2.3.6 小鼠脾脏系数 |
| 2.3.7 小鼠胸腺系数 |
| 2.3.8 小鼠血清处理 |
| 2.3.9 血清中OVA-sIgE、OVA-sIgG1、MCP-1 测定 |
| 2.3.10 T、B混悬细胞的制备 |
| 2.3.11 T细胞纯化 |
| 2.3.12 流式细胞术检测 |
| 2.3.13 小鼠结肠组织蛋白提取以及定量 |
| 2.3.14 小鼠结肠组织STAT5、Foxp3、GATA3、MHCⅡ、CXCR 1和CCR7 表达水平测定 |
| 2.4 统计学方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 NHDC对小鼠体重变化的影响 |
| 2.5.2 NHDC对小鼠体温变化的影响 |
| 2.5.3 NHDC对小鼠粪便状态的影响 |
| 2.5.4 NHDC对小鼠脾脏系数的影响 |
| 2.5.5 NHDC对小鼠胸腺系数的影响 |
| 2.5.6 小鼠血清OVA-sIgE浓度检测 |
| 2.5.7 小鼠血清中OVA-sIgG1 浓度检测 |
| 2.5.8 小鼠血清MCP-1(CCL2)浓度检测 |
| 2.5.9 小鼠脾脏中CD4+T/CD8+T细胞比值 |
| 2.5.10 小鼠脾脏中CD4+CD25+T细胞比值 |
| 2.5.11 小鼠结肠组织STAT5、Foxp3、GATA3、MHCⅡ、CCR7、CXCR1 蛋白表达水平分析 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 新橙皮苷二氢查耳酮对抗原诱导RBL-2H3 细胞脱颗粒的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 主要实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 RBL-2H3 细胞培养 |
| 3.3.2 CCK8 法检测NHDC对于RBL-2H3 细胞活性的影响 |
| 3.3.3 原子力显微镜观察RBL-2H3 细胞脱颗粒状态变化 |
| 3.3.4 抗原诱导RBL-2H3 细胞脱颗粒β-HEX释放的测定 |
| 3.3.5 抗原诱导RBL-2H3 细胞脱颗粒组胺释放的测定 |
| 3.3.6 抗原诱导对RBL-2H3 细胞脱颗粒IL-4 释放的测定 |
| 3.3.7 细胞蛋白提取及定性 |
| 3.3.8 抗原诱导RBL-2H3 细胞p-38、JNK、ERK蛋白的表达 |
| 3.4 统计学方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 NHDC对 RBL-2H3 细胞活性的影响 |
| 3.5.2 NHDC对抗原诱导RBL-2H3 细胞形貌的影响 |
| 3.5.3 NHDC对抗原诱导RBL-2H3 细胞β-HEX释放的影响 |
| 3.5.4 NHDC对抗原诱导RBL-2H3 细胞脱颗粒组胺释放的影响 |
| 3.5.5 NHDC对抗原诱导RBL-2H3 细胞脱颗粒IL-4 释放的影响 |
| 3.5.6 NHDC对抗原诱导RBL-2H3 细胞胞外Ca2+内流的影响 |
| 3.5.7 NHDC对抗原诱导RBL-2H3 细胞MAPK蛋白表达影响 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.2 创新性 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）MiR-21-Tipe2调控口服免疫耐受和miR-21-Pdcd4调控葡萄糖耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 调节性T细胞(Treg)在口服免疫耐受中的研究进展 |
| 1.1.1 口服免疫耐受的研究现状 |
| 1.1.2 Treg与口服免疫耐受 |
| 1.1.2.1 Treg与口服免疫耐受的相关性 |
| 1.1.2.2 肠道Treg的分类 |
| 1.1.2.3 口服免疫耐受中Treg的积累机制研究 |
| 1.1.3 小结与展望 |
| 1.2 糖耐受异常和2型糖尿病发病机制研 |
| 1.2.1 糖耐受异常 |
| 1.2.2 2型糖尿病的发病机制研究进展 |
| 1.2.2.1 2型糖尿病的发病机制研究进展概论 |
| 1.2.2.2 miRNA在2型糖尿病发病中的作用研究进展 |
| 1.2.2.2.1 miRNA在2型糖尿病发病中的作用研究进展概论 |
| 1.2.2.2.2 miR-21 在2型糖尿病发生中的作用研究进展 |
| 1.3 miR-21,Pdcd4和Tipe2 |
| 1.3.1 miR-21 简介 |
| 1.3.2 miR-21 和PDCD4 |
| 1.3.3 miR-21 和Tipe2 |
| 1.4 本论文的研究内容 |
| 1.4.1 miR-21-Tipe2通路调控口服免疫耐受的研究 |
| 1.4.2 miR-21-Pdcd4通路调控葡萄糖耐受的研究 |
| 第2章 MiR-21 在口服免疫耐受和葡萄糖耐受中的作用和机制 |
| 2.1 MiR-21-Tipe2通路促进口服免疫耐受 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.2.1 实验材料 |
| 2.1.2.1.1 实验小鼠 |
| 2.1.2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.2.2 实验方法 |
| 2.1.2.2.1 细胞培养基配置 |
| 2.1.2.2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.1.2.2.3 BMDCs的诱导 |
| 2.1.2.2.4 流式检测细胞表面标记物以及分子信号通路 |
| 2.1.2.2.5 Western blot |
| 2.1.2.2.6 斑点杂交 |
| 2.1.2.2.7 构建载体pGL3-PU.1, pLVX-IRES-Zs Green1-Tipe2 |
| 2.1.2.2.8 构建Tipe2稳定表达的Hela细胞株 |
| 2.1.2.2.9 质粒转染细胞并检测双荧光素酶 |
| 2.1.2.2.10 荧光定量PCR |
| 2.1.2.2.11 过继性T细胞转移和口服抗原诱导pTreg |
| 2.1.2.2.12 统计学分析 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.3.1 miR-21 和Tipe2的表达在BMDCs分化过程中呈现负相关 |
| 2.1.3.2 缺失miR-21 的BMDCs的CD80和CD86表达显着上调 |
| 2.1.3.3 缺失Tipe2的BMDCs的CD80和CD86表达显着下调 |
| 2.1.3.4 Tipe2的表达在缺失miR-21 的BMDCs中显着上调 |
| 2.1.3.5 过表达Tipe2促进转录因子PU.1 的活性 |
| 2.1.3.6 Tipe2缺失的BMDC分化时磷酸化PKCδ(Thr505)和ERK(Thr202/Tyr204) 表达显着下调 |
| 2.1.3.7 Tipe2缺失的BMDC分化时磷酸化PDK1 (Ser241)水平显着下调 |
| 2.1.3.8 Tipe2促进BMDC分化时磷酸酰肌醇代谢 |
| 2.1.3.9 Tipe2缺失的BMDC分化时磷酸化的AKT(Thr308)表达显着下调 |
| 2.1.3.10 小鼠肠道淋巴结中诱导调节性T细胞的设计图 |
| 2.1.3.11 Tipe2缺失促进肠道黏膜pTregs的诱导 |
| 2.1.3.12 Tipe2调控DC半成熟的分子信号通路图 |
| 2.1.4 小结与讨论 |
| 2.2 MiR-21-Pdcd4 通路维持葡萄糖耐受能力 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2.1.1 实验小鼠 |
| 2.2.2.1.2 细胞系 |
| 2.2.2.1.3 实验试剂 |
| 2.2.2.1.4 主要耗材 |
| 2.2.2.1.5 主要仪器 |
| 2.2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.2.1 miR-21β KO小鼠的构建及基因鉴定 |
| 2.2.2.2.2 胰岛及胰岛细胞的分离 |
| 2.2.2.2.3 胰岛石蜡切片及H&E染色 |
| 2.2.2.2.4 胰岛冰冻切片及免疫荧光 |
| 2.2.2.2.5 腹腔葡萄糖耐量试验 |
| 2.2.2.2.6 体外葡萄糖刺激分泌胰岛素 |
| 2.2.2.2.7 酶联免疫吸附法(ELISA)检测胰岛素 |
| 2.2.2.2.8 G6P检测 |
| 2.2.2.2.9 脂代谢检测 |
| 2.2.2.2.10 RNA提取及荧光定量PCR检测 |
| 2.2.2.2.11 载体构建(Pgl3-Glut2, p RK5-c-Jun) |
| 2.2.2.2.12 β-TC6的质粒,si RNA转染 |
| 2.2.2.2.13 双荧光素酶检测 |
| 2.2.2.2.14 免疫蛋白印迹(Western blot)检测 |
| 2.2.2.2.15 靶向小鼠胰腺注射miR-21agomir |
| 2.2.2.2.16 统计学分析 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.3.1 2型糖尿病db/db小鼠的体重、血糖水平、胰岛素分泌和胰岛中miR-21 的表达显着增加 |
| 2.2.3.2 ob/ob小鼠的体重、血糖水平、胰岛素分泌和胰岛中miR-21的表达 |
| 2.2.3.3 各种2型糖尿病相关小鼠的表征及miR-21 在其胰岛中的表达 |
| 2.2.3.4 β 细胞缺失miR-21 后不影响小鼠的体重和血糖水平 |
| 2.2.3.5 β 细胞miR-21 缺失不影响小鼠胰岛以及 β 细胞的数目和大小 |
| 2.2.3.6 β 细胞缺失miR-21 后导致葡萄糖刺激下的胰岛素分泌缺陷 |
| 2.2.3.7 miR-21βKO小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素分泌受损 |
| 2.2.3.8 β 细胞特异性缺失miR-21 不影响胰岛素合成 |
| 2.2.3.9 β 细胞缺失miR-21 后不影响胰岛素的转运和释放 |
| 2.2.3.10 miR-21βKO小鼠胰岛中Glut2的表达显着降低 |
| 2.2.3.11 miR-21 通过 miR-21-Pdcd4-AP-1 途径促进 Glut2 的表达 |
| 2.2.3.12 miR-21 agomir能有效地降低2型糖尿病小鼠的血糖水平 |
| 2.2.3.13 验证miR-21 agomir被特异性输送到胰腺 |
| 2.2.3.14 miR-21 agomir增加2型糖尿病小鼠胰岛中Glut2的表达和胰岛素的产生 |
| 2.2.3.15 miR-21 agomir处理不影响小鼠的体重和脂代谢 |
| 2.2.3.16 miR-21 促进Glut2表达和胰岛素分泌的示意图 |
| 2.2.4 小结与讨论 |
| 第3章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受（论文提纲范文）
| 中英文对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料和方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）从TGF-β1切入研究中医药多途径介入肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET长方案患者免疫耐受的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 TGF-β1-FOXP3-Treg维持妊娠的免疫调控机制 |
| 1.1 Treg介导母胎免疫耐受,维系妊娠 |
| 1.2 FOXP3为Treg细胞的核转录因子及重要调控基因 |
| 1.3 TGF-β1 诱导CD4+T分化为Treg细胞,发挥免疫抑制作用 |
| 1.4 TGF-β1-FOXP3-Treg在母胎界面的作用机制 |
| 2 IVF-ET与 TGF-β1-FOXP3-Treg的关系 |
| 3 中医药对母胎界面TGF-β1、FOXP3、Treg表达的影响 |
| 4 中医药多途径治疗再次IVF-ET失败的前期研究基础 |
| 第二部分 试验研究 |
| 研究流程图 |
| 1 研究资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 病例选择标准 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.5 试验材料 |
| 1.6 试验检测方法 |
| 2 安全性评价及质量控制 |
| 3 伦理审批及临床注册 |
| 4 统计分析 |
| 5 研究结果 |
| 5.1 两组患者一般资料情况比较 |
| 5.2 两组患者干预/等待三月后自然妊娠及妊娠结局比较 |
| 5.3 两组患者中医证候疗效情况比较 |
| 5.4 两组患者外周血TGF-β1表达水平比较 |
| 5.5 两组患者外周血FOXP3表达水平比较 |
| 5.6 两组患者外周血Treg表达水平比较 |
| 5.7 TGF-β1与FOXP3、Treg表达水平变化的相关性分析 |
| 5.8 证候积分与TGF-β1、FOXP3、Treg表达水平变化相关性分析 |
| 5.9 妊娠结局与TGF-β1、FOXP3、Treg表达水平变化趋势的关系 |
| 6 讨论 |
| 6.1 导师对再次IVF-ET的病因病机的认识及治疗经验 |
| 6.2 中医药多途径介入IVF-ET方案的机制分析 |
| 6.3 中医药多途径介入对肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET患者中医证候的影响 |
| 6.4 中医药多途径介入对肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET患者妊娠结局的影响 |
| 6.5 中医药多途径介入对肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET患者外周血TGF-β1 表达水平的影响 |
| 6.6 中医药多途径介入对肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET患者外周血Treg细胞表达水平的影响 |
| 6.7 中医药多途径介入对肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET患者外周血FOXP3 表达水平的影响 |
| 6.8 基于TGF-β1-FOXP3-Treg免疫调控机制探讨中医药多途径介入再次IVF-ET患者的助孕机制 |
| 7 结论 |
| 不足及展望 |
| 特色及创新性 |
| 参考文献 |
| 综述 调节性T细胞在母胎界面的免疫调节研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
四、调节性T细胞与免疫耐受（论文参考文献）
- [1]调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展[J]. 轩娟娟,白鸿太,张继翔,王耀权,陈国勇,魏思东. 中国组织工程研究, 2022(07)
- [2]原发性肾病综合征与牛奶蛋白过敏中调节性T细胞应答异常及DOCK8缺陷致B细胞早期活化异常的机制研究[D]. 王劲智. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]肝移植术后免疫耐受机制及诱导方法的研究现状[J]. 王芳菲,吕少诚,贺强. 国际外科学杂志, 2020(06)
- [4]T细胞亚群及其免疫检查点分子在妊娠过程中的表达及意义[D]. 赵媛媛. 青岛大学, 2020(01)
- [5]IL-35在免疫耐受微环境形成及肿瘤血管生成中的作用及其机制研究[D]. 刘佳. 山东大学, 2020(12)
- [6]CD4+CD25+调节性T细胞在J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受中的作用机制研究[D]. 郑高颖. 山东农业大学, 2020(10)
- [7]新橙皮苷二氢查耳酮对OVA诱导口服耐受的影响[D]. 隗继浩. 吉林大学, 2020(08)
- [8]MiR-21-Tipe2调控口服免疫耐受和miR-21-Pdcd4调控葡萄糖耐受的机制研究[D]. 刘芮伶. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2020(07)
- [9]阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受[D]. 姚仲鹏. 广州医科大学, 2020(01)
- [10]从TGF-β1切入研究中医药多途径介入肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET长方案患者免疫耐受的机制[D]. 严诗丝. 成都中医药大学, 2020