一、重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究（论文文献综述）
孙成彪[1]（2020）在《犬干扰素α/RTB重组融合蛋白制备及抗病毒活性研究》文中提出干扰素（Interferon,IFN）是机体抗病毒感染的第一道免疫屏障,应用领域已逐步发展到抗病毒、抗肿瘤等方面。犬干扰素α（Canine Interferon alpha,CaIFNα）是犬类动物在受到外界特定刺激后,免疫细胞分泌的细胞因子之一,具有广谱抗病毒、加强免疫应答反应、弱抗原性等一系列特点。CaIFNα的抗病毒作用主要与干扰素刺激基因产物（Interferon Stimuluated Genes,ISGs）有关,ISGs通过抑制病毒核酸的转录翻译及蛋白合成从而发挥抗病毒作用。但是由于CaIFNα半衰期短等原因限制了 CaIFNα在临床中的应用。蓖麻毒素（Ricin toxin,RT）为一种高毒性的植物蛋白,主要存在于蓖麻籽中,由A链和B链组成,两条链通过二硫键连接,其中RTA是毒性链,RTB是运载体,具有凝集素作用,与哺乳细胞膜表面甘露糖受体结合,运输RTA亚基进入细胞内部发挥毒性。课题组前期研究发现重组RTB可作为免疫增强剂,增强机体细胞免疫应答及体液免疫应答。并且可巨噬细胞增加JAK1、TYK2、STAT1等细胞因子磷酸化水平。本研究采用基因重组表达技术,将CaIFNα和RTB进行融合表达,制备一种新型干扰素融合表达蛋白,该蛋白性质稳定,并且在体内、体外试验中均能长效发挥抗病毒作用,优化剂型制成的纳米制剂,能显着提高融合表达蛋白稳定性。具体研究内容分以下四个方面:1.犬干扰素α/RTB的原核表达研究通过重叠PCR技术分别将CaIFNα、（G4S）3Linker、RTB进行连接,克隆至大肠杆菌表达载体pET28a中,获得含有rCaIFNα/RTB编码序列的重组质粒pET28a-CaIFNα/RTB,转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21（DE3）中,确定工程菌BL21/pET28a-CaIFNα/RTB 诱导表达条件为:IPTG 浓度 0.8 mmol/L,37℃,诱导8 h。rCaIFNα/RTB融合表达蛋白主要以包涵体形式表达。对变性后rCaIFNα/RTB蛋白进行离子交换层析、金属鳌合亲和层析后对其进行复性,最终得到具有活性的rCaIFNα/RTB融合表达蛋白。2.犬干扰素α/RTB的体外抗病毒活性研究通过MDCK-VSV方法检测犬干扰素α/RTB抗病毒活性,发现其抗病毒比活为1.04×109IU/mg,证明将CaIFNα与RTB融合表达后并未影响CaIFNα抗病毒活性。实验证实犬干扰素α/RTB无法抑制WISH细胞中VSV复制,表明rCaIFNα/RTB具有种属特异性。3.犬干扰素α/RTB犬体内药代动力学研究及抗犬细小病毒研究犬干扰素α/RTB药物代谢动力学研究显示,犬干扰素α/RTB经单次肌肉注射给药后,与rCaIFNα相比较,药物半衰期（t1/2）为49.65 h,半衰期增加9.5倍。药物达峰时间缩短,并且rCaIFNα/RTB在犬体内生物利用率增加。犬干扰素α/RTB在抗犬细小病毒试验中,预防率为100%,可有效降低致死率。经血常规分析对比,均显示出犬干扰素α/RTB具有较好的抗犬细小病毒作用。4.犬干扰素α/RTB纳米化剂型及其抗病毒活性研究利用高分子化合物PEI10000对该蛋白药物进行纳米化,表征试验证实rCaIFNα/RTB@PEI10000纳米颗粒药物具有纳米级尺寸（～300 nm）,体外MDCK-VSV方法检测其抗病毒活性,且纳米化过程中未发生蛋白药物抗病毒活性降低。研究证实rCaIFNα/RTB@PEI10000纳米颗粒具有pH及温度耐受性,可在极酸性条件:pH 2.0,透析4 h,65℃高温孵育4 h后仍具有显着抗病毒活性。本项研究为犬干扰素α的生物学修饰提供了新的思路和发展方向,并且对生物毒素亚基可作为一种载体蛋白提供了有力证据。通过重组犬干扰素α//RTB新剂型研究,证实PEI10000高分子化合物作为一种简单有效的纳米药物载体,在药物稳定性研究中具有较大应用潜力。
宋世斌[2]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中研究表明干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
王朋涛[3]（2020）在《猪α干扰素高效突变体的筛选及体内外抗病毒作用研究》文中提出猪α干扰素（PoIFN-α）具有广谱的抗病毒活性,在病毒病的治疗、抑制肿瘤细胞增殖和调节免疫功能等方面发挥重要作用。为了获得高活性的PoIFN-α,本研究利用生物信息学的方法对PoIFN-α亚型的基因序列进行分析,分析PoIFN-α等位氨基酸改变频率较高的位点,结合其三级结构的预测,对PoIFN-α的氨基酸位点进行定点突变。利用大肠杆菌表达系统对PoIFN-α进行表达纯化,通过抗病毒活性的测定,筛选出PoIFN-α的高效突变体并命名为PoIFN-α-156s,并对PoIFN-α-156s体内外抗病毒作用进行研究,具体内容如下:1.猪α干扰素突变体的构建、表达、纯化及结构测定为了获得高活性的PoIFN-α,在NCBI上下载不同猪α干扰素亚型的基因序列,运用生物信息学软件进行比对,分析等位基因较易改变的氨基酸位点并结合PoIFN-a三级结构预测,选择突变的位点为 38（S→F）、40（H→Q）、43（F→L）、78（N→D）、86（C→Y）、151（V→A）及156（T→R）,本试验设计了 4种猪α干扰素突变体序列,分别命名为PoIFN-α-38、PoIFN-α-86、PoIFN-α-156、PoIFN-α-156s。利用融合 PCR 方法,将天然 PoIFN-α 基因进行定点突变,并克隆到pET-32a载体上,转化至大肠杆菌Rosetta中诱导表达和鉴定。结果显示,重组蛋白表达形式为包涵体,蛋白分子质量约33KDa。利用CD光谱法测定PoIFN-α-156s和PoIFN-α的二级结构,结果表明它们的二级结构中均具有α螺旋结构。本试验成功的构建了猪α干扰素突变体并在大肠杆菌中表达,为下一步研究其生物活性奠定基础。2.猪α干扰素及突变体体外生物活性测定在ST细胞和Vero细胞中利用MTT法测定POIFN-α-1 56s和PoIFN-α在细胞上的安全浓度。用细胞维持液将蛋白2倍倍比稀释后孵育细胞72h,利用MTT试剂盒检测细胞的存活率。在 Vero 细胞上 PoIFN-α-156s和PoIFN-α的CC50分别为505.8μg/mL和482.1 μg/mL,在 ST 细胞上的 CC50 分别为 385.4μg/mL 和 185.5μg/mL。利用MTT法、TCID50和荧光定量PCR方法分别在Vero细胞和ST细胞上测定PoIFN-α-156s和PoIFN-α对VSV和PRV的抑制作用。用细胞维持液将蛋白2倍倍比稀释后孵育细胞24h,每孔接入100 TCID50/0.1 mL VSV或PRV,收取上清检测VSV和PRV病毒的TCID50和基因拷贝数。试验结果表明PoIFN-α-1 56s和PoIFN-α均能抑制VSV和PRV病毒在Vero细胞和ST细胞上的复制,呈现剂量依赖性。用100ng/mL的PoIFN-α-156s预处理的ST细胞培养液中VSV和PRV的滴度均下降约2个滴度,VSV的基因拷贝数下降约2Log10,PRV的基因拷贝数下降约1.5Log10,相比PoIFN-α处理组。试验结果表明PoIFN-α-156s在细胞上抑制病毒复制的能力高于PoIFN-α,具有更高的抗病毒活性。3.PoIFN-α-156s抑制小鼠体内对VSV复制作用研究将雌性小鼠随机分为PoIFN-α-156s处理组、PoIFN-α处理组和阴性对照组。PoIFN-α-156s和PoIFN-α处理组的小鼠采用腹腔注射的方式注射,注射量为2.5 mg/kg,阴性对照组注射等量的生理盐水。通过眼球采血的方式在0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,12,24,36,48和72 h采集小鼠的血液,分离血清,利用猪α干扰素检测试剂盒检测干扰素在小鼠体内的代谢时间。结果表明PoIFN-α-156s在小鼠体内的代谢时间为48h,而PoIFN-α对照组的代谢时间为24h。为了验证PoIFN-α-156s是否抑制VSV在小鼠体内的增殖,将试验组分为阴性对照组、VSV感染组、VSV+PoIFN-α-1 56s组（二者同时处理组）、VSV-PoIFN-α-156s组（接种病毒1d后,蛋白再接种小鼠）。蛋白以2.5 mg/kg通过腹腔注射的方式接种小鼠,VSV病毒通过滴鼻接种200μL VSV（每只小鼠10.39Log10 GE）,阴性对照组接种等量的生理盐水。试验结果表明VSV感染组的小鼠的肺部的VSV病毒含量最高,其次是脑和脊髓。与VSV感染组相比,VSV+PoIFN-α-156s组小鼠肺部在1dpi时病毒含量下降约2 Log10GE,在2dpi时下降约0.8 Log10GE;脑部和脊髓病毒含量在1dpi时下降约0.5Log10GE,在2dpi时下降约2Log10GE;表明在小鼠体内PoIFN-α-156s能有效的抑制VSV病毒复制。VSV-PoIFN-α-156s组检测结果表明在接种PoIFN-α-156s后,小鼠肺部、脑部和脊髓的VSV病毒含量在2dpi时相比VSV感染组下降约1.2 Log10GE,表明PoIFN-α-156s在VSV感染小鼠后具有抑制其增殖的作用。4.猪α干扰素与IgG-Fc融合蛋白的构建、表达、纯化及抗病毒活性的测定为了延长猪α干扰素的半衰期,将IgG-Fc片段与PoIFN-α-156s连接,构建融合蛋白并在小鼠体内验证融合蛋白的半衰期。利用融合PCR的方法扩增出融合蛋白的基因序列,并在IgG-Fc片段与PoIFN-α-1 56s之间加入“GGGGS”柔性肽。结果表明本试验成功构建了3个猪α干扰素和IgG-Fc融合蛋白,并命名为PoIFN-α-Fc、PoIFN-α-GS-Fc和PoIFN-α-2GS-Fc。在ST细胞和Vero细胞上测定融合蛋白抗病毒活性,证实本试验融合蛋白PoIFN-α-2GS-Fc具有较高的抗病毒活性:利用猪α-干扰素定量检测试剂盒对小鼠血清内干扰素蛋白的检测,结果证实PoIFN-α-2GS-Fc相比PoIFN-α在小鼠体内的代谢时间延长了约3倍。
姚凌云[4]（2018）在《犬干扰素α2的克隆表达与抗病毒活性分析》文中研究表明干扰素是由多种细胞分泌的蛋白家族成员之一,具有广谱的抗病毒、抗肿瘤细胞增殖和免疫调节等生物学功能。根据干扰素的核苷酸序列和染色体定位,及其与特定受体的相互作用方式、结构与理化性质等,干扰素可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3大类。干扰素α属Ⅰ型干扰素家族,是由白细胞分泌产生的一种糖蛋白,具有较高的抗病毒活性,在试验研究和抗病毒治疗中具有很高的临床应用价值。干扰素也存在半衰期短、给药频繁等缺陷,限制了它的临床应用。血清白蛋白是天然存在于动物体内的一类大分子蛋白质,具有性质稳定和半衰期长的特点,在维持胶体渗透压、运输物质和清除自由基等方面有着重要的生理作用,适合用来与干扰素融合表达以延长干扰素的半衰期。本试验通过大肠杆菌表达系统和昆虫/杆状病毒表达系统表达犬干扰素α2,并鉴定其抗病毒活性;再在昆虫/杆状病毒表达系统中分泌表达犬血清白蛋白与犬干扰素α2的融合干扰素,并进一步检测其抗病毒活性,为犬干扰素的研究与临床应用奠定基础。试验1、犬干扰素α2在大肠杆菌的表达与抗病毒活性分析根据Genbank公布的犬干扰素α2序列（M28625.1）,设计并合成编码犬干扰素α2（CaIFN-α2）的成熟蛋白基因,同时引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。将合成的CaIFN-α2基因插入表达载体pET-28a（+）,构建表达质粒pET-28a-CaIFN-α2。将鉴定正确的表达质粒pET-28a-CaIFN-α2转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western bolt分析可见分子量约为23 kDa的目的蛋白,主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。蛋白包涵体经变性、复性和纯化后,获得的重组CaIFN-α2纯度为92%。用犬肾细胞（MDCK）/水疱性口炎病毒（VSV）系统检测重组CaIFN-α2的抗病毒活性为3.16×106U/ml。本试验成功构建pET-28a-CaIFN-α2表达质粒,并在大肠杆菌中实现表达,表达的重组CaIFN-α2具有较好的抗病毒活性,为进一步研究新型犬用干扰素制品提供了依据。试验2、犬干扰素α2在昆虫细胞的表达与抗病毒活性测定本试验将合成的编码CaIFN-α2成熟蛋白基因插入pFastBacHTA载体,转化DH1OBac细胞。经过3次筛选纯化,获得重组穿梭质粒Bacmid-CaIFN-α2,并转染Sf 9细胞后收获重组杆状病毒rBac-CaIFN-α2。rBac-CaIFN-α2传至第3代后,用P3代rBac-CaIFN-α2感染Sf 9昆虫细胞3 d,收获昆虫细胞进行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析CaIFN-α2的表达。IFA结果表明,CaIFN-α2可在昆虫细胞中表达,SDS-PAGE和Western blot均检测到25和28 kDa的表达产物。利用MDCK/VSV系统检测重组CaIFN-α2的抗病毒活性,表达的重组CaIFN-α2能够有效抑制VSV对MDCK细胞的攻击,细胞裂解物的抗病毒活性为5.58×105 U/mL。试验3、犬融合干扰素α2在昆虫细胞的表达将编码犬血清白蛋白（Alb）基因与CaIFN-α2成熟蛋白基因用柔性肽（GGGGS）连接,并在犬血清白蛋白基因N端接入蜂素信号肽基因（HBM）。将合成的融合基因HBM-Alb-CaIFN-α2插入pFastBacI载体,转化DH1OBac细胞。经过3次筛选纯化,获得重组穿梭质粒Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-α2,并转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2。重组杆状病毒传至第3代后,用P3代感染Sf 9昆虫细胞3 d,收获昆虫细胞进行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析重组犬融合干扰素α2的表达。IFA结果表明,重组犬融合干扰素α2可在昆虫细胞表达;SDS-PAGE和Western blot均检测到上清培养物存在90 kDa的表达产物,表明获得分泌性表达,符合预期结果。用MDCK/VSV系统检测重组犬融合干扰素a2的抗病毒活性,表达的重组犬融合干扰素α2对MDCK细胞遭受VSV的攻击具有抑制作用,细胞培养上清的抗病毒活性为 1.78×104U/mL。
张德芳[5]（2017）在《重组干扰素α-2b合成研究进展》文中研究表明干扰素α-2b具有抗病毒、抗肿瘤、影响细胞分化和调节机体免疫功能等活性,临床上得到了广泛的应用。本文就干扰素α-2b的重组基因合成、发酵、蛋白表达的研究进展进行综述,同时探讨干扰素α-2b的长效化研究,展望干扰素α-2b的研究和应用方向。
梁果义,刘晓航[6]（2016）在《重组人干扰素α2b的制备研究》文中研究表明为了获得高活性高纯度的rh IFNα2b,对重组人干扰素α2b进行克隆、表达,并深入研究了其纯化工艺。采用重叠延伸PCR法合成了编码IFNα2b的基因,用DNA重组技术构建了原核表达载体p BV220-IFNα2b,获得了稳定的工程菌种。发酵产物通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过变性、复性、离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化,得到rh IFNα2b纯品,其比活可达1×108IU/mg。实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础。
郭子聪[7]（2015）在《重组人干扰素α2b生产中防止二聚体再发生的工艺验证研究》文中指出验证是检验产品生产操作规程（或方法）、检验方法、生产工艺或系统能达到预期结果的一系列活动。近年来随着生物科学技术的飞速发展并广泛运用于制药行业,人民群众对药品生产和质量保证手段的认识逐步深化,法制观念不断健全,生物药品使用者的产品质量意识也在不断提高,药品监管力度加大,以及GMP内容的日臻完善,全球大大小小的药品生产企业都逐步意识到了验证的重要性,无论是在满足药政要求,还是在保证药品质量上,验证的重要性越来越大。本论文探讨了工艺验证的历史由来,在理解工艺验证的由来、各项组成、实施和最新进展的基础上分析了药品质量管理体系对工艺验证的引入的意义和最终目的,以及在我国现阶段的《药品生产质量管理规范（2010年修订）》体系要求下如何执行工艺验证,研究了重组人干扰素α2b生产过程中出现二聚体的问题,通过一系列的实验,找到防止重组人干扰素α2b二聚体再发生的方法。用工艺验证系统地论述并证明该方法有效可行,能够用于重组人干扰素α2b工艺生产,为工艺验证的实际应用增加了一个成功案例。
李强[8]（2013）在《干扰素α-2b蛋白的制备与纯化》文中提出干扰素（IFNs）是宿主细胞在受到病原体例如病毒、微生物、寄生虫、肿瘤细胞的侵染后产生并释放的。干扰素属于糖蛋白的一种，具有干扰病毒在宿主体内复制的能力，它对于提高宿主免疫系统对病毒的识别和抵抗起到十分重要的作用，现在被广泛的运用在病毒引起的疾病和肿瘤的治疗中。本实验中的研究对象是干扰素α-2b，它属于干扰素α，同样具有抗病毒、抗肿瘤等作用。现代已经广泛的应用于肿瘤和癌症的治疗中。但是天然态的干扰素α-2b产量稀少，这样就使得需要这种药物治疗的病人承受巨大的经济负担，那么提高干扰素蛋白的产量就是摆在现在科研人员面前的一道难题。运用重组DNA技术，人们已经可以用E coli表达系统高效表达干扰素α-2b基因，干扰素α-2b蛋白以包涵体的形式存在，这样就需要将包涵体蛋白变性、复性来得到具有生物活性的干扰素α-2b，然而这一步中极易形成聚集体和错误折叠，这个问题已经是影响干扰素大量生产的瓶颈问题。本文通过以下途径来讨论解决提高干扰素蛋白产量的问题：1.脱氧胆酸钠促进了包涵体蛋白提取，使得产量提高了近25%；2.优化变性、复性的条件以及方法使杂质蛋白和二聚体的量显着减少；3.对离子交换层析条件、方法的优化使得一步离子交换就可以分离出二聚体和单体干扰素α-2b，提高了分离的效率简化了分离步骤。通过对以上方法的综合改良使得1L的复性液可以得到145-160mg正确折叠的干扰素2b蛋白。
韩霭辰[9]（2013）在《重组人干扰素-α2b分离纯化的研究》文中进行了进一步梳理干扰素是由不同细胞产生的可溶性糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。Ⅰ型干扰素中的干扰素-α因具有很强的抗病毒活性而被用于治疗慢性乙肝和丙肝感染。干扰素治疗中最大的缺点是具有极短的半衰期，这就降低了干扰素的药效和生物利用性。目前，提高干扰素半衰期的方法是采用聚乙二醇对干扰素-α2进行蛋白修饰。由Bolder Biotechnology, nc生物技术公司构建的含有干扰素-α基因的质粒转化进大肠杆菌W3110，IPTG诱导后经SDS-PAGE分析，表达产物的分子量为19KDa左右，并且蛋白以不溶性的包涵体形式存在。利用超声破碎对菌体细胞进行破碎可以提取包涵体，使用6mol/L盐酸胍对包涵体进行溶解变性，变性蛋白缓缓注入复性溶液稀释20倍，4℃静置48h后即可复性。采用疏水相互作用层析分离重组人干扰素-α2b，去除干扰素样品中的二聚体，得到高纯度的干扰素用于进一步的研究。首先采用阳离子交换层析纯化复性重组人干扰素-α2b，去除了大部分的杂蛋白，然后采用疏水相互作用层析纯化重组人干扰素-α2b，去除复性过程中产生的错误折叠体和二聚体，并考察盐浓度、pH值、流速和洗脱液中尿素对疏水相互作用层析纯化效果的影响。最终确定硫酸铵初始浓度1.2mol/L、缓冲液pH值6.0、流速2.5mL/min、洗脱液中添加尿素浓度为2mol/L时疏水相互作用层析纯化效果最佳。最终得到的重组人干扰素-α2b非还原型SDS-PAGE电泳均呈单一条带。本文确定了疏水层析纯化重组人干扰素-α2b的最优条件，成功提取到具有高活性、高纯度的重组人干扰素-α2b纯品，样品回收率达到63.07%。
郑博[10]（2013）在《重组人干扰素-α2b位点特异性的PEG化修饰》文中研究说明重组干扰素-α是一种具有抗病毒、免疫调节、抑制细胞增殖等生物活性的细胞因子，临床上用于治疗病毒性疾病和癌症。由于干扰素在体内的循环半衰期短，因此为维持有效的血药浓度需要每天或一周三次对病人进行给药。聚乙二醇化学修饰可以有效的改善干扰素的物理化学性质和生物学特性，延长体内循环半衰期。本文中制备的重组人干扰素-α2b是利用基因重组技术在蛋白质的氨基酸序列中引入了游离的半胱氨酸，随后应用马来酰亚胺PEG修饰剂对引入的游离巯基进行位点特异性修饰，从而得到了结构单一的单PEG化干扰素蛋白。重组人干扰素-α2b在大肠杆菌中以不溶性包涵体的形式表达。实验对比优化了包涵体蛋白的洗涤和体外变性、复性的条件，以提高蛋白产率和纯度。同时，对重组人干扰素-α2b的PEG化修饰反应条件进行了优化，分别对还原剂、反应体系pH、反应温度、反应时间、蛋白浓度等条件进行了优化。通过这些反应条件的优化，提高单PEG化重组人干扰素-α2b蛋白的产率。目前，用于分离纯化PEG化蛋白的色谱方法多为离子交换层析和凝胶过滤层析。PEG分子共价键合到蛋白质分子上时会覆盖蛋白质分子表面的部分电荷，使其带电荷量减少。实验中利用这种电荷量的差异，使用阳离子交换层析对重组人干扰素-α2b的PEG化反应产物进行了初步的分离纯化研究。
二、重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究（论文提纲范文）
（1）犬干扰素α/RTB重组融合蛋白制备及抗病毒活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 1.1 犬细小病的研究现状 |
| 1.2 干扰素的研究现状 |
| 1.3 蓖麻毒素研究现状 |
| 第一章 犬干扰素α/RTB融合蛋白原核表达研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、菌株 |
| 1.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组pMD18T-CaIFNα/RTB克隆质粒的构建及鉴定 |
| 1.2.2 重组pET28a-CaIFNα/RTB载体的构建及鉴定 |
| 1.2.3 BL21(DE3)/pET28a-CaIFNα/RTB诱导表达 |
| 1.2.4 rCaIFNα/RTB目的蛋白的Western Blot鉴定 |
| 1.2.5 rCaIFNα/RTB包涵体的洗涤与变性 |
| 1.2.6 rCaIFNα/RTB纯化及复性工艺的确定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 重组pMD18T-CaIFNα/RTB克隆质粒的构建及鉴定 |
| 1.3.2 重组pET28a-CaIFNα/RTB载体的构建及鉴定 |
| 1.3.3 rCaIFNα/RTB诱导表达及Western Blot鉴定 |
| 1.3.4 rCaIFNα/RTB纯化及复性工艺的确定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 犬干扰素α/RTB融合表达蛋白体外抗病毒活性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 MDCK细胞培养 |
| 2.2.2 VSV扩增 |
| 2.2.3 VSV TCID_(50)的测定 |
| 2.2.4 MTT法检测rCaIFNα/RTB融合表达蛋白对MDCK细胞的毒性 |
| 2.2.5 MDCK-VSV检测rCaIFNα/RTB融合表达蛋白的抗病毒活性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 VSV TCID_(50)测定 |
| 2.3.2 rCaIFNα/RTB融合表达蛋白的细胞毒性 |
| 2.3.3 rCaIFNα/RTB融合表达蛋白的抗病毒活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 犬干扰素α/RTB犬体内药代动力学研究及抗犬细小病毒研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要仪器、试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 鲎试剂法检测rCaIFNα/RTB中残留内毒素 |
| 3.2.2 rCaIFNα/RTB药代动力学分析 |
| 3.2.3 犬细小病毒病的复制 |
| 3.2.4 rCaIFNα/RTB对犬细小病毒病的治疗 |
| 3.2.5 试验数据采集及数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rCaIFNα/RTB中内毒素含量检测结果 |
| 3.3.2 rCaIFNα/RTB药代动力学分析结果 |
| 3.3.3 犬细小病毒病模型试验结果 |
| 3.3.4 对犬细小病毒病的防治 |
| 3.3.5 防治前后对细小病毒病犬血常规指标影响 |
| 3.3.6 对犬细小病毒病防治各组犬防治情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 犬干扰素α/RTB纳米化剂型及其抗病毒活性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂与药品 |
| 4.1.2 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 rCaIFNα/RTB@PEI10000NPs的合成 |
| 4.2.2 透射电镜表征 |
| 4.2.3 粒径及Zeta电位测定 |
| 4.2.4 rCaIFNα/RTB@PEI10000 NPs稳定性的测定 |
| 4.2.5 FITC-rCaIFNα/RTB@PEI10000 NPs的合成 |
| 4.2.6 rCaIFNα/RTB@PEI10000 NPs对MDCK抗病毒活性的测定 |
| 4.2.7 pH值与温度对rCaIFNα/RTB@ PEI10000 NPs抗病毒活性影响 |
| 4.2.8 荧光倒置显微镜观察NPs的细胞摄取 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 rCaIFNα/RTB@PEI10000 NPs透射电镜表征结果 |
| 4.3.2 rCaIFNα/RTB@PEI10000粒径测定结果 |
| 4.3.3 rCaIFNα/RTB@PEI10000 Zeta电位测定结果 |
| 4.3.4 rCaIFNα/RTB@PEI10000NPs稳定性的测定结果 |
| 4.3.5 荧光倒置显微镜观察NPs的细胞摄取结果 |
| 4.3.6 rCaIFNα/RTB@PEI10000NPs对MDCK抗病毒活性的测定 |
| 4.3.7 pH值与温度对rCaIFNα/RTB@PEI10000 NPs抗病毒活性影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（3）猪α干扰素高效突变体的筛选及体内外抗病毒作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 干扰素的研究进展 |
| 2 猪α干扰素的研究进展 |
| 引言 |
| 试验一 猪α干扰素突变体的构建、表达、纯化及结构测定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪α干扰素的序列比对 |
| 2.2 猪α干扰素三级预测及分析 |
| 2.3 猪α干扰素突变体基因的克隆与鉴定 |
| 2.4 重组质粒的表达及鉴定 |
| 2.5 重组质粒诱导条件的优化 |
| 2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.7 PoIFN-α-156s和PoIFN-α的二级结构测定 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪α干扰素及突变体体外生物活性测定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PoIFN-α-156s和PoIFN-α在不同细胞系上安全浓度的测定 |
| 3.2 PoIFN-α-156s和PoIFN-α在不同细胞系上抑制VSV和PRV活性的测定 |
| 3.3 荧光PCR和TCID_(50)测定PoIFN-α-156s和PoIFN-α对VSV和PRV的抑制作用 |
| 3.4 PoIFN-α-156s能显着上调干扰素通路相关基因的表达 |
| 4 讨论 |
| 试验三 PoIFN-α-156s抑制小鼠体内VSV复制作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪α干扰素在小鼠体内代谢的研究 |
| 3.2 试验处理组小鼠体重的变化 |
| 3.3 荧光PCR检测小鼠脏器的VSV病毒含量 |
| 4 讨论 |
| 试验四 猪α干扰素与IgG-Fc融合蛋白的构建、表达、纯化及抗病毒活性的测定 |
| 1. 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪源IgG-Fc基因的克隆 |
| 3.2 猪α干扰素与IgG-Fc融合蛋白基因的克隆与鉴定 |
| 3.3 融合蛋白重组质粒的表达及可溶性分析 |
| 3.4 融合蛋白的二级结构的测定 |
| 3.5 PoIFN-α-2GS-Fc和PoIFN-α在不同细胞系上安全浓度的测定 |
| 3.6 PoIFN-α-2GS-Fc和PoIFN-α在不同细胞系上抑制VSV活性的测定 |
| 3.7 荧光PCR和TCID50测定PoIFN-α-2GS-Fc和PoIFN-α对VSV和PRV的抑制作用 |
| 3.8 PoIFN-α-2GS-Fc和PoIFN-α在小鼠体内代谢的研究 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（4）犬干扰素α2的克隆表达与抗病毒活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 绪论 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 干扰素的研究进展与应用 |
| 1 干扰素的起源与生物进化 |
| 2 干扰素的分类与分布 |
| 3 干扰素的诱导产生及机理 |
| 3.1 干扰素诱导剂及诱导产生 |
| 3.2 干扰素的产生机理 |
| 4 干扰素作用的信号转导通路 |
| 5 犬干扰素研究进展 |
| 5.1 犬干扰素分类与特点 |
| 5.2 重组犬干扰素研究现状 |
| 6 干扰素在犬病治疗中的应用 |
| 6.1 干扰素的抗肿瘤作用 |
| 6.2 干扰素的抗病毒作用 |
| 6.3 干扰素的免疫调节作用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 犬干扰素α2在大肠杆菌的表达与抗病毒活性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 菌株、载体、病毒及细胞 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 成熟CaIFN-α2基因的设计与合成 |
| 2.2 成熟CaIFN-α2基因的扩增 |
| 2.3 重组表达质粒pET-28a-CaIFN-α2的构建 |
| 2.4 重组CaIFN-α2的表达与鉴定 |
| 2.5 重组CaIFN-α2表达条件的优化 |
| 2.6 重组CaIFN-α2包涵体的变性、复性及纯化 |
| 2.7 重组CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 成熟CaIFN-α2的扩增 |
| 3.2 重组表达质粒(pET-28a-CaIFN-α2)的鉴定 |
| 3.3 重组CaIFN-α2的表达分析 |
| 3.4 重组CaIFN-α2的可溶性分析 |
| 3.5 重组CaIFN-α2的Western blot检测 |
| 3.6 诱导表达条件的优化 |
| 3.7 重组CaIFN-α2的纯化 |
| 3.8 重组CaIFN-α2的抗病毒活性分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 犬干扰素α2在昆虫细胞的表达与抗病毒活性测定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 菌株、载体、病毒及细胞 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 成熟CaIFN-α2基因的获得 |
| 2.2 重组转移质粒pFastBacHTA-CaIFN-α2的构建 |
| 2.3 重组转移质粒pFastBacHTA-CaIFN-α2的筛选与鉴定 |
| 2.4 重组穿梭质粒Bacmid-CaIFN-α2的构建与鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒rBac-CaIFN-α2的构建与鉴定 |
| 2.6 重组CaIFN-α2在Sf9昆虫细胞中的表达与检测 |
| 2.7 重组CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 转移载体pFastBacHTA-CaIFN-α2的构建 |
| 3.2 重组穿梭载体Bacmid-CaIFN-α2的构建 |
| 3.3 转染Sf9昆虫细胞后的病变情况 |
| 3.4 重组杆状病毒rBac-CaIFN-α2的获得与鉴定 |
| 3.5 重组CaIFN-α2在Sf9细胞中表达的SDS-PAGE分析 |
| 3.6 重组CaIFN-α2的Western blot鉴定 |
| 3.7 间接免疫荧光(IFA)检测重组CaIFN-α2的表达 |
| 3.8 重组CaIFN-a2的抗病毒活性测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 犬融合干扰素α2在昆虫细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 菌株、载体、病毒及细胞 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 融合基因HBM-Alb-CaIFN-α2的设计与获得 |
| 2.2 重组转移质粒pFastBacI-HBM-Alb-CaIFN-a2的筛选与鉴定 |
| 2.3 重组穿梭质粒Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-a2的构建与鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-a2的构建与鉴定 |
| 2.5 重组HBM-Alb-CaIFN-α2在Sf9昆虫细胞的表达与检测 |
| 2.6 重组HBM-Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 转移载体pFastBacI-HBM-Alb-CaIFN-α2的鉴定 |
| 3.2 重组穿梭载体Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-α2的构建 |
| 3.3 转染Sf9昆虫细胞后的病变情况 |
| 3.4 重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2的获得与鉴定 |
| 3.5 间接免疫荧光(IFA)检测重组融合CaIFN-α2的表达 |
| 3.6 SDS-PAGE分析 |
| 3.7 重组融合CaIFN-α2的Western blot鉴定 |
| 3.8 重组融合CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录: 常用试剂的配制 |
| 致谢 |
（5）重组干扰素α-2b合成研究进展（论文提纲范文）
| 1 以大肠杆菌为宿主菌表达干扰素α-2b进展 |
| 2 以酵母菌为宿主菌表达干扰素α-2b进展 |
| 3 干扰素α-2b长效化进展 |
| 4 展望 |
（6）重组人干扰素α2b的制备研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 IFNα2b DNA片段的合成 |
| 1.2.2 表达质粒p BV220-IFNα2b的构建 |
| 1.2.3 重组p BV220-rh IFNα2b的表达验证 |
| 1.2.4 基因工程菌p BV220-IFNα2b/DH5α的发酵培养 |
| 1.2.5 重组蛋白rh IFNα2b的分离纯化[10] |
| 1.2.6 蛋白含量测定 |
| 1.2.7 体外生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重叠延伸PCR法合成IFNα2b c DNA |
| 2.2 提取质粒后进行双酶切对阳性重组子的验证 |
| 2.3 对阳性克隆重组子的诱导表达验证 |
| 2.4 基因工程菌p BV220-IFNα2b/DH5α的发酵培养 |
| 2.5 重组蛋白rh IFNα2b的分离纯化 |
| 2.5.1 表达后菌液处理的电泳分析结果 |
| 2.5.2 Q Sepharose Fast Flow离子交换层析及电泳分析结果 |
| 2.5.3 Sephacryl S-100凝胶过滤层析及电泳分析结果 |
| 2.5.4 蛋白质收率 |
| 3 讨论 |
（7）重组人干扰素α2b生产中防止二聚体再发生的工艺验证研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 验证的由来及意义 |
| 1 验证的由来 |
| 2 验证的定义 |
| 3 验证的意义 |
| 第二节 验证的实施 |
| 1 验证的范围 |
| 2 验证的管理 |
| 3 验证的分类及适用条件 |
| 4 验证状态的维护 |
| 第三节 工艺验证 |
| 1 概述 |
| 2 工艺验证的定义 |
| 3 工艺验证的目的 |
| 4 工艺验证阶段性 |
| 5 工艺验证流程 |
| 6 工艺验证所需的文件 |
| 第二章 重组人干扰素α2b生产中防止二聚体再发生的工艺研究 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 重组人干扰素α2b生产中防止二聚体再发生的工艺验证 |
| 1 验证目的 |
| 2 验证小组成员及职责分工 |
| 3 验证前确认 |
| 4 验证范围 |
| 5 过程参数和质量数据汇总及分析 |
| 6 数据分析 |
| 7 重组人干扰素α2b原液稳定性考察 |
| 第四章 讨论及工艺验证的展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）干扰素α-2b蛋白的制备与纯化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干扰素的发现 |
| 1.2 干扰素的产生及机理 |
| 1.2.1 干扰素的产生 |
| 1.2.2 干扰素的作用机理 |
| 1.3 干扰素的分类 |
| 1.4 干扰素的功能 |
| 1.5 包涵体中提取干扰素α-2b |
| 1.5.1 包涵体产生及结构特点 |
| 1.5.2 干扰素-α2b 包涵体蛋白的变性以及复性 |
| 1.5.3 干扰素α-2b 蛋白的柱上纯化 |
| 1.6 总结 |
| 第二章 干扰素-α2b 蛋白的表达 |
| 2.1 启动子和诱导调控表达系统 |
| 2.1.1 本部分实验所用试剂 |
| 2.1.2 本实验所用仪器 |
| 2.1.3 操作步骤 |
| 2.2 干扰素α-2b 包涵体的收集 |
| 2.2.1 菌体的破碎与包涵体的洗涤 |
| 2.3 SDS-PAGE |
| 2.3.1 本部分实验所需材料及试剂配制 |
| 2.3.2 灌制分离胶和浓缩胶 |
| 2.3.3 电泳 |
| 2.3.4 染色与脱色 |
| 2.3.5 数据分析 |
| 第三章 包涵体蛋白变性与复性条件的改良 |
| 3.1 干扰素α-2b 包涵体蛋白的变性条件改良 |
| 3.1.1 本部分实验所用试剂 |
| 3.1.2 实验步骤 |
| 3.1.3 数据分析 |
| 3.2 干扰素α-2b 包涵体蛋白的复性条件改良 |
| 3.2.1 本部分实验所用试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.2.4 降低在复性过程中干扰素 -2b 蛋白质之间的相互作用 |
| 3.2.5 干扰素 -2b 蛋白复性方法的改良 |
| 3.3 蛋白浓度的测定 |
| 3.3.1 蛋白质浓度测定操作步骤 |
| 第四章 干扰素α-2b 蛋白的柱上纯化 |
| 4.1 干扰素α-2b 蛋白的阳离子柱纯化 |
| 4.1.1 本部分实验所用试剂耗材与仪器 |
| 4.1.2 实验步骤 |
| 4.1.3 数据分析 |
| 4.2 干扰素 2b 疏水相互作用层析 |
| 4.2.1 本部分实验所用材料试剂及主要仪器 |
| 4.2.2 实验步骤 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 Native 凝胶电泳 |
| 4.3.1 本部分实验所需试剂配方 |
| 4.3.2 实验步骤 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.4 羟基磷灰石层析 |
| 4.4.1 材料试剂 |
| 4.4.2 主要仪器 |
| 4.4.3 实验步骤 |
| 4.4.4 实验结果 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参与科研情况说明 |
| 致谢 |
（9）重组人干扰素-α2b分离纯化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干扰素的研究背景 |
| 1.1.1 干扰素的定义 |
| 1.1.2 干扰素的分类 |
| 1.1.3 干扰素的药理作用及机制 |
| 1.2 干扰素的临床应用 |
| 1.3 干扰素类上市产品 |
| 1.4 重组干扰素的表达 |
| 1.5 蛋白质的分离纯化 |
| 1.5.1 蛋白质分离纯化的原则 |
| 1.5.2 蛋白质分离纯化的一般步骤 |
| 1.5.3 蛋白质分离纯化技术 |
| 第二章 重组人干扰素-α2b 在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 常用试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 干扰素的表达 |
| 2.2.2 菌体的收集 |
| 2.2.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3 实验结果 |
| 第三章 重组人干扰素-α2b 的提取 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 常用试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌体的破碎 |
| 3.2.2 包涵体的洗涤 |
| 3.2.3 包涵体的变性和复性 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 菌体的破碎 |
| 3.3.2 包涵体的洗涤 |
| 3.3.3 包涵体的变性和复性 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 阳离子交换层析纯化重组人干扰素-α2b |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 常用试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 纯化基本操作方法 |
| 4.2.2 层析柱最大柱容量 |
| 4.2.3 BCA 法测定蛋白质浓度 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 阳离子交换层析纯化 |
| 4.3.2 层析柱最大柱容量 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 疏水相互作用层析纯化重组人干扰素-α2b |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 常用试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 溶液的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 盐浓度对疏水层析的影响 |
| 5.2.2 pH 值对疏水层析的影响 |
| 5.2.3 流速对疏水层析的影响 |
| 5.2.4 尿素对疏水层析的影响 |
| 5.2.5 Bradford 法测定蛋白浓度 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 盐浓度对疏水层析的影响 |
| 5.3.2 pH 值对疏水层析的影响 |
| 5.3.3 流速对疏水层析的影响 |
| 5.3.4 尿素对疏水层析的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 羟基磷灰石层析纯化重组人干扰素-α2b |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 常用试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 溶液的配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 第七章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（10）重组人干扰素-α2b位点特异性的PEG化修饰（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干扰素的研究背景 |
| 1.1.1 干扰素的发现与发展 |
| 1.1.2 干扰素的产生及其分类 |
| 1.1.3 干扰素的生物活性及其作用机制 |
| 1.2 蛋白质的聚乙二醇化学修饰 |
| 1.2.1 聚乙二醇的特性 |
| 1.2.2 PEG 修饰的方法 |
| 1.2.3 蛋白质 PEG 化的影响因素 |
| 1.3 PEG 修饰干扰素的研究进展 |
| 1.3.1 PEG-IFN-α |
| 1.3.2 PEG 修饰其他干扰素 |
| 1.4 本课题研究的主要内容与意义 |
| 第二章 重组人干扰素-Α2B 在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 IFN-Α2B 在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验步骤 |
| 2.2 菌体及包涵体的收集与洗涤 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验条件的优化对比 |
| 2.3 包涵体体外变性与复性 |
| 2.3.1 实验试剂 |
| 2.3.2 实验条件的优化对比 |
| 2.4 SDS-PAGE 检测目的蛋白 |
| 2.4.1 SDS-PAGE |
| 2.4.2 实验仪器 |
| 2.4.3 电泳用溶液的配制 |
| 2.4.4 分离胶和浓缩胶的制备 |
| 2.4.5 电泳操作方法 |
| 2.5 结果分析与讨论 |
| 2.5.1 菌体、包涵体的收集及洗涤 |
| 2.5.2 包涵体的变性与复性 |
| 第三章 重组人干扰素-Α2B 的纯化 |
| 3.1 实验原理 |
| 3.1.1 阳离子交换层析 |
| 3.1.2 疏水作用层析 |
| 3.1.3 羟基磷灰石层析 |
| 3.2 材料试剂与仪器 |
| 3.3 操作步骤 |
| 3.4 结果分析与讨论 |
| 3.4.1 IEC 结果分析讨论 |
| 3.4.2 HIC 结果分析讨论 |
| 3.4.3 HAC 结果分析讨论 |
| 第四章 重组人干扰素-Α2B 的位点特异性 PEG 化 |
| 4.1 蛋白质的定量 |
| 4.1.1 BCA 法测定蛋白质浓度的方法 |
| 4.2 SDS-PAGE 电泳的碘染色 |
| 4.2.1 染色用溶液的配制 |
| 4.2.2 碘染色的方法 |
| 4.3 IFN-Α2B 的位点特异性 PEG 化 |
| 4.3.1 实验试剂与仪器 |
| 4.3.2 实验操作 |
| 4.4 PEG 修饰 IFN-Α2B 的实验优化 |
| 4.4.1 IFN-α2b PEG 化影响因素 |
| 4.4.2 还原剂对修饰产物的影响 |
| 4.4.3 pH 对修饰产物的影响 |
| 4.4.4 反应温度对修饰产物的影响 |
| 4.4.5 蛋白浓度对修饰产物的影响 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 还原剂对修饰产物的影响 |
| 4.5.2 pH 对修饰产物的影响 |
| 4.5.3 反应温度对修饰产物的影响 |
| 4.5.4 蛋白浓度对修饰产物的影响 |
| 4.6 结果分析与讨论 |
| 第五章 PEG-IFN-Α2B 纯化的初步研究 |
| 5.1 材料试剂与仪器 |
| 5.2 实验步骤 |
| 5.3 实验条件的优化 |
| 5.3.1 pH 及甘油对分离效果的影响 |
| 5.3.2 缓冲体系对分离效果的影响 |
| 5.4 结果分析与讨论 |
| 5.4.1 pH 及甘油对分离效果的影响 |
| 5.4.2 缓冲体系对分离效果的影响 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和科研情况说明 |
| 致谢 |
四、重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究（论文参考文献）
- [1]犬干扰素α/RTB重组融合蛋白制备及抗病毒活性研究[D]. 孙成彪. 军事科学院, 2020
- [2]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [3]猪α干扰素高效突变体的筛选及体内外抗病毒作用研究[D]. 王朋涛. 河南农业大学, 2020(06)
- [4]犬干扰素α2的克隆表达与抗病毒活性分析[D]. 姚凌云. 南京农业大学, 2018(07)
- [5]重组干扰素α-2b合成研究进展[J]. 张德芳. 海峡药学, 2017(07)
- [6]重组人干扰素α2b的制备研究[J]. 梁果义,刘晓航. 生物技术进展, 2016(03)
- [7]重组人干扰素α2b生产中防止二聚体再发生的工艺验证研究[D]. 郭子聪. 上海交通大学, 2015(03)
- [8]干扰素α-2b蛋白的制备与纯化[D]. 李强. 天津大学, 2013(01)
- [9]重组人干扰素-α2b分离纯化的研究[D]. 韩霭辰. 天津大学, 2013(01)
- [10]重组人干扰素-α2b位点特异性的PEG化修饰[D]. 郑博. 天津大学, 2013(01)
标签：干扰素论文; 重组人干扰素α-2b凝胶论文; 重组蛋白论文; 包涵体论文; 基因合成论文;