一、清除乙型肝炎病毒的非细胞裂解机制（论文文献综述）
湛梦茹[1]（2021）在《激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究》文中指出背景与目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种慢性传染性疾病,全球疾病负担重,其中大部分慢性乙肝病毒携带者均在5岁之前被感染。目前没有能够彻底清除HBV的治疗方法。免疫治疗能够实现CHB患者的功能性治愈,是具有前景的乙肝治疗策略之一。慢性HBV感染时免疫系统往往是免疫耐受或衰竭状态。免疫检查点是表达在免疫细胞表面对免疫反应起活化或抑制作用的分子,通过对他们的调节能够打破这种耐受状态。共刺激分子OX40/OX40L、4-1BB是肿瘤坏死因子（受体）超家族（tumor necrosis factor（receptor）superfamily,TNF（R）SF）的成员,在免疫反应的活化尤其是T细胞的活化中起到了重要作用。而程序性死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）是免疫球蛋白受体CD28亚家族的成员,作为抑制性的信号分子与免疫系统的耐受或衰竭有关。然而目前为止,这些免疫检查点能否作为免疫调节的靶点治疗CHB尚不能明确。相对于婴幼儿,成人对HBV可以产生更强的更有效的免疫反应从而清除病毒,其中发挥年龄依赖性作用的免疫分子尚不清楚。本研究立足于慢性乙型肝炎感染的背景下,通过对OX40/OX40L、PD-1、4-1BB在CHB患者中的表达特点的研究,从而明确其临床意义,及其与年龄的关系。接着我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40,研究其对HBV复制的影响及相关机制,以期为以OX40为靶点治疗CHB的策略提供更多的理论依据。材料与方法:本研究首先收集人的样本用以检测免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。外周血样本来自我们从2018年9月到2019年6月在吉林大学白求恩第一医院纳入的64名慢性乙肝患者和另外招募的37名健康志愿者。其中慢性乙肝患者包括52名未进行抗病毒治疗的患者和12名应用恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗的患者,健康志愿者包括24名成人和13名儿童。从外周血中分离出血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。肝脏组织病理标本来自18名进行肝脏穿刺的患者和6名进行肝脏血管瘤手术的成人患者。其中18名慢性乙肝患者包括9名慢性乙型肝炎发作的患者和9名慢性乙型病毒感染未发作的患者。在收集的人的样本中我们先后检测了OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。为了研究OX40/OX40L在人群中的表达特点,我们应用流式细胞术检测PBMCs中膜形式的OX40和OX40L（membrane-bound OX40,m OX40;membrane-bound OX40L,m OX40L）的表达;应用酶联免疫吸附试验检测血浆中可溶性形式的OX40和OX40L（soluble OX40,s OX40;soluble OX40L,s OX40L）水平;应用免疫组化的方法对肝组织中OX40和OX40L的表达量进行检测。之后为了研究PD-1和4-1BB在CHB患者中表达特点,我们应用前期检测OX40/OX40L的人群样本外加从我院病理科另申请到的6名儿童的肝组织样本,对PD-1和4-1BB在CHB患者中的表达情况进行了检测。我们应用磁珠分选的方法将PBMCs中的CD4+和CD8+T细胞分选出来,应用q RT-PCR的方法检测了各个T细胞亚群PD-1和4-1BB mRNA的水平;应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中可溶性的PD-1和4-1BB（soluble PD-1,s PD-1;soluble 4-1BB,s4-1BB）的水平;应用免疫组化的方法检测了肝组织中关于PD-1和4-1BB的表达情况。最后我们将以上检测结果与CHB患者的疾病特点及临床指标进行相关性分析从而探究他们在慢性乙肝感染中的临床意义,及与年龄的关系。基于前期临床样本的结果,我们应用尾静脉注射腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）的方法构建了rAAV/1.3HBV小鼠模型,首次将OX40激动性的单抗应用于该模型以观察其产生的作用。为了明确激活免疫检查点OX40对HBV复制的作用,我们应用全自动电化学发光分析仪检测血清内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）的水平,用q RT-PCR法检测HBV DNA定量,用免疫组化法检测小鼠肝组织内HBs Ag和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBc Ag）的表达水平。为了明确激活OX40靶点对HBV复制的作用的同时产生的肝脏炎症变化,我们应用微孔板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平,应用HE染色的方法观察小鼠肝脏炎症病理变化。为了观察这个过程中伴随的免疫变化,我们分离了小鼠肝脏内浸润的淋巴细胞,应用流式细胞术对其中T细胞亚群的比例进行了检测,同时我们应用流式微球检测法（cytometric bead array,CBA）对该过程中小鼠血清中Th1、Th2、Th17相关的细胞因子进行了评估。期间我们还对小鼠脾脏的长度和重量进行了评估与检测。为了探究上述过程的机制,我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型的基础上将CD4+和CD8+T细胞进行分别剔除,构建了CD4+和CD8+T细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型,连同安慰剂组小鼠同时给予OX40激动剂。应用上述检测方法分别对模型中病毒学变化和血清转氨酶变化进行了检测。同时为了进一步从mRNA水平研究激活OX40靶点对HBV复制的作用过程中基因表达的变化,我们分离了小鼠肝内的淋巴细胞对其进行mRNA转录组测序（mRNA sequencing,mRNA-seq）。测序所得的差异表达的mRNAs（differentially expressed mRNAs,DEmRNAs）分别纳入火山图和聚类热图,并分别应用Go功能富集及KEGG、Reactome通路富集的方法对这些DEmRNAs所富集的功能和通路进行初步探索。研究结果:关于OX40/OX40L在人的样本中的表达结果显示在外周血PBMCs中表达OX40+T细胞的百分比在CHB患者中是减少的,其中在高病毒载量组和肝炎发作组中这种减少的趋势尤其明显,且OX40+T细胞的百分比与血清病毒学指标呈负相关。而OX40L+B细胞和单核细胞的百分比在CHB患者的PBMCs中是增多的,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作的组中也比较明显,且他们主要与肝脏炎症指标呈正相关。同时我们还发现慢性乙肝患者外周血中s OX40/OX40L表达明显升高,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组比较明显,且s OX40/OX40L的水平与病毒复制及肝脏炎症指标均呈正相关。另外ETV治疗前后血浆中s OX40水平没有明显变化。同时我们发现肝组织中OX40/OX40L的表达趋势与血浆中s OX40/OX40L表达趋势相似,即在CHB患者中是表达升高的,且在肝炎发作的患者中升高的趋势更明显。最后我们发现在健康人外周血中总T细胞中OX40+细胞的百分比,CD4+T细胞中的OX40+细胞的百分比,CD14+单核细胞中OX40L+细胞的百分比及血浆中s OX40的水平与年龄呈正相关,具有年龄依赖性。其次关于PD-1和4-1BB在人群中表达的相关研究结果显示在CHB患者中无论是PBMCs中CD4+T细胞还是CD8+T细胞中PD-1 mRNA的水平与健康组相比均是升高的,这与CHB患者肝脏组织中PD-1的表达趋势是一致的。在CHB患者血浆中s PD-1也是升高的,且这种升高的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组也比较明显,ETV治疗前后s PD-1水平没有明显变化。另外血浆中s PD-1的水平不仅与HBV的病毒学指标呈正相关还与肝脏炎症指标呈正相关。4-1BB在CHB患者中的表达特点大致与PD-1相似,简单来讲血浆中的s4-1BB的水平在CHB患者中也是异常升高的,且在高病毒载量组和肝炎发作组升高趋势比较明显,ETV治疗前后s4-1BB水平没有明显变化。血浆中s4-1BB水平主要与血清病毒学指标呈正相关。肝组织中4-1BB的表达趋势与血浆中s4-1BB的趋势相似,即与健康对照组相比,CHB患者的肝脏组织中4-1BB的表达水平更高。而在总PBMCs、CD4+T细胞以及CD8+T细胞中4-1BB mRNA的水平在CHB患者中均有升高的趋势但无统计学差异。最后我们观察到在健康人群中无论是PD-1还是4-1BB的表达在不同年龄组均无明显差异。通过对上述免疫检查点的表达特点及临床意义的分析,我们选择将OX40靶点激动剂应用于已经构建成功的rAAV8/1.3HBV小鼠模型中。我们发现小鼠血清中HBs Ag和肝内HBV DNA水平均有所下降,且血清中HBs Ag的水平在第8天达到最低值。同时我们观察到小鼠肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达与安慰剂组相比也有减少的趋势。但激活OX40靶点似乎对血清HBV DNA及HBe Ag水平没有影响。在HBV小鼠模型中激活OX40靶点HBV被抑制的同时还伴随着肝脏炎症的产生,表现为血清中ALT和AST不同程度的升高,肝脏组织内炎症细胞的浸润。除此之外,小鼠肝脏内T细胞亚群比例及血清中免疫细胞因子也发生了变化,表现为CD8+T细胞比例的升高及Th1、Th2及Th17相关的细胞因子升高,且相关细胞因子的水平均表现为先升高再下降的趋势,与病毒清除的过程一致。另外我们发现使用OX40激动剂能够引起小鼠脾脏的增大。同时我们还发现在该模型中应用OX40激动剂的效应呈剂量依赖性,主要表现在血清HBs Ag、肝内HBV DNA的下降水平,CD8+T细胞比例升高的水平以及脾脏增大的程度上。在应用OX40激动剂抑制HBV过程相关机制的探索中,我们发现CD4+/CD8+T细胞缺陷和免疫正常的rAAV8/1.3HBV小鼠同时给予OX40激动剂后,在给药第8天和第12天CD4+T和CD8+T细胞缺陷的小鼠血清中HBs Ag水平与免疫正常组HBV小鼠相比均是升高的,其中以CD8+T细胞缺陷的小鼠升高趋势更明显。与免疫正常组的小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝内HBV DNA水平没有明显变化,而CD8+T细胞缺陷小鼠则有轻度升高趋势。对于小鼠血清ALT水平,免疫正常的和CD4+T细胞缺陷的HBV小鼠给予OX40激动剂后转氨酶均有所升高,而CD8+T细胞缺陷的HBV小鼠则没有明显升高。关于应用OX40激动剂和安慰剂的HBV小鼠肝内淋巴细胞基于mRNA水平的转录组学测序结果显示,经过OX40激动剂处理后小鼠肝内淋巴细胞表达上调的mRNAs有3008个,下调的有2269个,并可聚类成簇。经Go功能富集分析后,我们发现在生物进程方面这些DEmRNAs主要富集到了白细胞的分化,染色质及组蛋白的修饰调节等过程;在细胞成分方面他们主要富集到了核内的染色质、异染色质及中心体等细胞组成成分上;而在分子功能方面他们主要富集在转录、翻译及小分子GTP酶的结合、Ras GPT酶结合等功能上。经KEGG通路富集分析我们发现这些GEmRNAs主要富集在HBV、人类嗜T淋巴细胞白血病病毒（human T-cell leukemia virus,HTLV）、EB病毒感染相关通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、趋化因子及NF-kapa B等信号通路。而经Reactome分析这些GEmRNAs主要富集在中性粒细胞脱颗粒,细胞因子,白细胞介素,转录调控等相关信号通路。研究结论:免疫检查点OX40/OX40L、PD-1及4-1BB在人的样本中的表达特点向我们提示这几个免疫检查点可能均与慢性HBV感染相关。但其中只有OX40的表达与HBV病毒学指标呈负相关,考虑其与病毒清除密切相关,且只有OX40/OX40L表达呈年龄依赖性。因此我们将OX40激动剂首次应用于rAAV8/1.3HBV小鼠模型,发现激活OX40靶点对HBV复制具有抑制作用,是一个具有前景的治疗CHB的免疫检查点,但激活OX40靶点不能完全清除HBV因此未来可能还需要联合其它治疗方式。对于激活OX40靶点抑制HBV复制的机制显示该过程相对依赖CD4+T细胞似乎更依赖于CD8+T细胞,CD4+T细胞的重要性不可否认,但未来对于HBV的免疫治疗我们也许应该将更多的关注点放在CD8+T细胞上。
姜淑玲[2]（2021）在《慢性酒精消耗抑制CD8+ T细胞抗乙肝病毒免疫应答》文中研究指明目的本研究选用尾部静脉高压注射p AAV/HBV1.2质粒创建HBV携带小鼠模型,以Lieber-De Carli酒精或对照流质饲料建立小鼠慢性酒精肝模型,探究长期酒精喂食对乙肝病毒（HBV）复制以及CD8+T细胞抗HBV免疫应答的影响,进一步探讨NK细胞对CD8+T细胞的免疫调节作用,为乙肝的发病机理和免疫靶向治疗提供理论依据。方法选取6周龄的野生型C57BL/6J小鼠,小鼠造模分为注射6μg p AAV/HBV1.2质粒的HBV慢性感染模型和注射20μg p AAV/HBV1.2质粒的HBV急性感染小鼠模型,两组模型区别于质粒注射的量不同,其他处理方式一致。小鼠适应喂养3天后,随机分组分为对照组（HBV小鼠）,小鼠尾部静脉注射HBV1.2质粒,喂食对照流质饲料;实验组（1）（HBV+5%Et OH小鼠）,小鼠注射HBV1.2质粒,喂食含5%（v/v）酒精的酒精流质饲料;以及实验组（2）（HBV+5%Et OH+anti-As GM1小鼠）,小鼠注射HBV质粒1.2,喂食5%酒精,同时腹腔注射50μg anti-As GM1抗体靶向清除小鼠体内NK细胞,用于探究NK细胞在小鼠抗HBV的免疫反应中的作用。共造模十天,每日记录小鼠体重及流质饲料消耗量,对照组小鼠按照酒精组小鼠消耗等热量的饲料进行喂养,以保证所有组别中小鼠在模型建立期间摄入相同的热量。采用免疫放射分析法（IRMA）定量检测小鼠HBV表面抗原（HBs Ag）,Q-PCR用于检测HBV DNA和RNA的拷贝数,以及通过免疫组化检测肝组织中HBV核心抗原（HBc Ag）,从而全面了解小鼠体内HBV的状态变化;肝脏病理学方法用于评估小鼠喂食酒精后肝脂肪变性的严重程度。通过流式细胞术对小鼠肝脏单个核细胞（MNCs）进行表型和功能研究;此外,借助超高效液相串联色谱四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOFMS）检测小鼠肝组织中的代谢组学变化。结果小鼠喂食酒精后,血清甘油三酯（TG）含量明显增高,肝脏组织中充满大量的脂肪空泡。长期摄入酒精后促使HBV在小鼠体内存留时间更久,表现为肝脏中HBV基因组拷贝数显着高于对照组。在高压注射6μg HBV1.2质粒诱导的HBV耐受模型中,长期摄入酒精可诱导HBV小鼠肝脏中CD8+T细胞数量显着下降,并且CD8+T细胞表面表达的负调因子LAG-3表达明显上升,表现为免疫功能耗竭状态;进一步深入机制发现NK细胞对维持CD8+T细胞耗竭状态发挥重要的作用,清除NK细胞可以明显恢复部分CD8+T的功能。在高压注射20μg HBV1.2质粒诱导小鼠HBV急性感染的模型中,长期摄入酒精诱导HBV小鼠肝脏CD8+T细胞分泌干扰素gamma（IFN-gamma）能力减弱,效应CD8+T细胞（CD44+CD62L-）数量显着下降。为了进一步验证酒精对CD8+T细胞功能的影响,我们将两组小鼠相同数量的CD8+T细胞转输到免疫功能缺陷的HBV携带小鼠体内,观察供体免疫细胞的HBV清除能力,结果显示来源于长期喂食酒精的小鼠CD8+T细胞清除受体小鼠体内HBV能力显着减弱,表现为HBV相关基因组拷贝数更多,血清中HBs Ag含量更高。为了进一步研究NK细胞在机体对HBV免疫反应中的作用,我们清除HBV+5%Et OH急性感染小鼠体内NK细胞,同时发现小鼠肝脏HBV相关基因清除加快。同时,酒精使得肝脏特有NK（Lr NK）细胞占比上升,常规NK（c NK）占比下降。同时,利用超高效液相串联色谱四极杆飞行时间质谱的方法检测到两组小鼠肝脏组织的多组差异代谢物,结果显示HBV小鼠长期摄入酒精后,小鼠肝脏的葡萄糖酸内酯和核糖储备显着降低,同时有助于合成谷胱甘肽（GSH）的半胱氨酸显着降低,这可能加剧了大多数细胞的氧化应激和活性氧（ROS）水平。结论小鼠长期摄入酒精后诱导CD8+T细胞功能衰减,抑制CD8+T细胞的抗HBV免疫应答,从而提高HBV在小鼠肝脏中的病毒载量。同时,通过抗体清除NK细胞后可以促进小鼠对肝脏HBV的清除能力,其机制可能与酒精诱导肝脏特有NK对CD8+T细胞的免疫负调作用有关。此外,能量代谢的下调和氧化应激的上调也可能参与CD8+T细胞功能的衰减。
张聪会[3]（2021）在《乙型肝炎病毒增加QPCT表达促进HBV复制》文中研究表明目的乙型肝炎病毒依然是最严重的病毒感染之一,其中很多感染者最终会发展为肝炎,肝硬化和肝癌,每年可导致大量人死亡。尽管目前有疫苗接种以及抗病毒药物,但是依旧没有找到能彻底治愈的方法。QPCT基因编码谷氨酰胺环化酶,是一种参与翻译后修饰的酶。我们通过基因芯片发现,与肝癌细胞HepG2细胞相比,它在HepG2.2.15（能稳定表达HBV病毒）细胞中表达量上升,因此我们主要研究QPCT在HBV感染中的作用,这将为我们今后对乙肝的进一步研究和治疗提供很好的方向,为乙肝的彻底治愈带来曙光。方法首先基于基因芯片结果发现:QPCT基因在HepG2.2.15细胞中表达量明显高于HepG2细胞,其差异高达18.55倍。之后我们在GEOdatebase数据库中对HBV患者和健康对照组中肝脏组织的QPCT表达差异进行了生物信息学分析。另外我们还收集了临床乙肝患者和健康人的血清样本,用ELISA法检测了QPCT的表达水平,验证基因芯片的结果。接下来采用了RT-PCR和Western blot方法在HepG2和HepG2.2.15细胞中再次验证基因芯片结果。同时在Huh7和HepG2细胞中梯度转染HBV1.3倍体质粒,在mRNA和蛋白水平再次去验证。之后在HepG2和Huh7细胞中过表达QPCT基因,与HBV1.3倍体质粒共转染,用RT-PCR和ELISA实验检测过表达QPCT基因后HBV的pgRNA表达水平,HBV-DNA拷贝数,以及对HBV HBeAg和HBsAg的影响。结果通过生物信息学分析,我们发现,与健康对照组相比,QPCT在HBV感染患者中mRNA表达水平显着上调。在临床水平,QPCT的表达量在HBV患者中也明显上升。在HepG2.2.15细胞中QPCT的mRNA及蛋白表达水平明显高于对照组HepG2细胞,并且在HepG2和Huh7细胞中,随着HBV1.3倍体质粒浓度梯度的上升,QPCT的mRNA及蛋白表达量也梯度上升。同时在过表达QPCT基因和共转染HBV1.3倍体的HepG2和Huh7细胞中,HBV的pgRNA,HBV-DNA拷贝数以及HBV的HBeAg和HBsAg水平也上升。结论HBV能促进QPCT基因的表达,而QPCT基因的表达上调促进了HBV的表达和复制。
张莉[4]（2020）在《不同PD-1及CXCR5表达的T淋巴细胞在乙型肝炎病毒感染中的功能研究》文中研究说明背景:乙型肝炎病毒（HBV）感染后病毒清除需要一个复杂的免疫网络的参与,免疫应答介导的宿主与病毒之间的相互作用影响着HBV感染后肝脏疾病的复杂性及转归。体液免疫应答在抑制和清除HBV中起着至关重要的作用。B细胞活化状态对控制HBV的复制具有重要的作用,自发或经治疗获得乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）/乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）血清学转换后,可以持久控制病毒复制或者彻底清除病毒,阻止或延缓肝硬化和肝细胞肝癌的发生,有效控制疾病的进展。然而慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者外周B细胞数量及分泌特异性抗体IgG的能力均有一定程度的下降,经自发或治疗获得的HBeAg/HBsAg血清转换率仍较低。因此,探索CHB患者HBeAg/HBsAg清除的体液免疫机制非常重要。滤泡辅助性T细胞（Tfh细胞）作为CD4+辅助性T淋巴细胞的一个亚群,在辅助体液免疫应答中起重要作用。已有研究证实循环中的PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞可介导慢性血吸虫病和自身免疫性甲状腺疾病患者的体液免疫反应,但PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞在慢性HBV感染患者中的作用仍然未知。有趣的是,近期有研究发现一种新的CD4+T细胞亚群,这群细胞缺乏CXCR5的表达但高表达PD-1,被称为外周辅助性T细胞（Tph细胞）。有研究证实PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞显示出类似Tfh细胞的辅助体液免疫应答的功能。然而,目前同样缺乏PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞在CHB患者中的研究。因此,PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞和PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞是否可以通过调节体液免疫反应来降低CHB患者的HBsAg水平或清除HBV DNA?细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的免疫反应在乙型肝炎免疫应答中同样占有举足轻重的地位。循环中HBV特异性CD8+T淋巴细胞能够直接识别病毒抗原并杀灭被HBV感染的肝细胞。同时,HBV特异性CD8+T细胞还能够分泌干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,以非细胞溶解机制抑制其他肝细胞内HBV基因表达和复制。然而,在CHB患者中,HBV并不能被完全有效的清除,导致HBV病毒持续感染的主要原因是HBV特异性CD8+T细胞数量及功能的缺陷。耗竭的HBV特异性CD8+T细胞高表达负性抑制分子,使CD8+T细胞呈现较低的效应功能并丧失记忆能力。近期有研究发现,在慢性病毒感染和炎症性疾病中存在一群独特的表达CXCR5的CD8+T细胞,即滤泡细胞毒性T细胞（Tfc细胞）,其功能耗竭的程度明显低于CXCR5-的CD8+T细胞,呈现出较高的病毒抑制功能,同时这群细胞与Tfh细胞的部分特征相同并能够促进B细胞分泌IgG抗体。目前尚缺乏HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞在HBV感染方面的研究报道,HBV感染时,CXCR5+CD8+Tfc细胞是否也能发挥抑制病毒复制并促进体液免疫应答的作用?第一部分PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞和PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞对经PEG-IFN-α治疗的CHB患者HBsAg下降和HBV DNA清除的影响目的:通过检测经聚乙二醇干扰素-α（PEG-IFN-α）治疗的CHB患者外周血中的PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞和PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞的频数和绝对数及其变化,探讨这两种细胞对HBsAg下降和HBV DNA清除的影响。方法:用流式细胞术检测20例健康对照者（HCs）及18例接受了48周PEG-IFN-α治疗的CHB患者治疗前和治疗48周结束时的外周血中PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞和PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞的频数。并结合血图分析结果计算CHB患者接受PEG-IFN-α治疗前后外周血中两种细胞的绝对数。用重复测量方差分析方法分析经PEG-IFN-α治疗48周后外周血中PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞和PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞的频数和绝对数的变化对HBsAg下降及HBV DNA清除的影响。结果:1)与HCs相比,CHB患者循环中PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞和PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞的频数均显着增高。2)经PEG-IFN-α治疗48周后,CHB患者循环中两种细胞的频数和绝对数整体上较治疗前没有明显变化。3)治疗后循环中PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞频数升高的CHB患者较下降者在治疗过程中的HBsAg水平随着时间变化下降更显着,而HBV DNA水平未发现明显差异。4)治疗后PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞频数的升高对CHB患者的HBsAg水平下降到≤2 Log10 IU/mL和≤3 Log10 IU/mL两个层次具有明显的促进作用。5)无论治疗后CHB患者循环中PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞的频数和两种细胞的绝对数升高与否,其HBsAg和HBV DNA水平在治疗过程中随时间变化没有显着差异。结论:循环中的PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞和PD-1hiCXCR5-CD4+Tph细胞可能参与了慢性HBV感染患者的免疫应答,且接受PEG-IFN-α治疗的CHB患者循环中PD-1hiCXCR5+CD4+Tfh细胞的频数增加与HBsAg水平降低有关。第二部分HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞在HBV感染中的作用研究目的:通过检测急、慢性HBV转染小鼠脾脏及CHB患者外周血中HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞的频数和表型及经HBV相关抗原肽段刺激后细胞因子的分泌,探讨HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞在HBV感染中的免疫功能。方法:运用高压水动力法分别将pCDNA3.1-HBV1.3质粒和pAAV-HBV1.2质粒通过尾静脉注射到C57BL/6J（B6）小鼠中以建立急、慢性HBV转染小鼠模型,并纳入38例不同HBeAg状态、不同丙氨酸转氨酶（ALT）水平的CHB患者,用流式细胞术检测急、慢性HBV转染小鼠脾脏及CHB患者外周血中HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞的频数及表面分子（PD-1、Tim-3、ICOS和CD40L）的表达,同时用流式细胞术检测急、慢性HBV转染小鼠脾脏CXCR5+CD8+Tfc细胞经HBc 93-100抗原肽刺激后IFN-γ、TNF-α和白介素-21（IL-21）的分泌水平。结果:1)急、慢性HBV转染小鼠脾脏及CHB患者外周血中均检测到HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞表达。2)与HBV特异性CXCR5-CD8+T细胞相比,急、慢性HBV转染小鼠脾脏中HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞表达的PD-1和Tim-3更高,但经HBc 93-100抗原肽刺激后分泌IFN-γ和TNF-α的能力更强。3)急、慢性HBV转染小鼠脾脏中HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞表面表达ICOS和CD40L,且经HBc 93-100抗原肽刺激后分泌IL-21。4)与CXCR5-CD8+T细胞相比,CHB患者外周血中CXCR5+CD8+Tfc细胞表达PD-1和Tim-3更高,同时,CHB患者外周血中CXCR5+CD8+Tfc细胞表面表达ICOS和CD40L,这一特征在HBeAg阳性、ALT水平较高的CHB患者中表现更为明显。结论:HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞虽然呈部分耗竭状态,但其具有更强的细胞毒性作用,且HBV特异性CXCR5+CD8+Tfc细胞可能参与了抗HBV的体液免疫应答。
武喆[5]（2020）在《柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究》文中认为研究背景和目的乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重的全球公共卫生问题,目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例,其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡,对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷（酸）类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA,难以实现CHB的临床治愈,新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶（RR）抑制剂,可以抑制细胞内核糖核苷酸（DNA）的生成,从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用,但其体内代谢过程仍不明确,生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定,并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析,进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。方法1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）鉴定柳胺酚在Sprague Dawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物,使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力,筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验,使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷（酸）类似物的联合用药指数。3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、Western Blot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。结果1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本,在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物（M1-M6）;在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物（M1、M2）;在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物（M1、M3和M6）;在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物（M1、M7-M10）。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYP1A2与CYP2C9参与了柳胺酚的Ⅰ相代谢反应;UGTIA1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性,可以显着降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量IC50 分别为 173.4μM、366.7μM、222.3μM 与 191.8μM,在 150μM 浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应;LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显着降低。Western Blot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclin D1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及Western Blot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显着抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显着抑制RR活性。结论1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力,其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显着降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性,具有良好的安全性。此外,LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷（酸）类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclin D1的表达水平,改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱,以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平,同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合,从而大幅抑制RR活性,发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。
夏天[6]（2020）在《慢性HBV感染者NK细胞与Treg及细胞因子的关系研究》文中研究说明目的:探讨慢性HBV（Hepatitis B virus）感染者如慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）及其进展疾病乙肝肝硬化（Liver cirrhosis,LC）和肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）患者外周血自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK cell）分泌的IFN-γ与CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Regulatory T cell cells,Treg）及IL-10等细胞因子含量的关系研究。方法:收集146例慢性HBV感染肝病患者和健康者,其中CHB患者57例,LC患者40例,HCC患者22例。选择同期体检健康者（Healthy control,HC）27例。采用流式细胞仪检测外周血Treg、NK细胞以及IFN-γ+NK细胞的比例,CBA（Cytometric bead array）细胞因子（IL-10、IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF及IL-5）含量、全自动生化分析仪检测血清ALT、AST。统计学分析采用LSD检验、Mann-Whitney U检验及Spearman相关检验。结果:CHB、LC、HCC患者组外周血Treg细胞百分比和血清中IL-10水平均显着高于HC组,CHB、HCC患者外周血Treg绝对数值亦显着高于HC组（P<0.05）。且CHB、LC及HCC组患者,Treg与IL-10均呈正相关关系（P<0.01,r=0.564;P<0.05,r=0.426;P<0.05,r=0.476）。此外,NK细胞绝对数、IFN-γ+NK细胞百分比以及血清中IFN-γ含量在CHB、LC、HCC组中均显着低于HC组（P<0.01）。同时CHB患者组IFN-γ+NK细胞比例与Treg细胞比例、血清IL-10水平均呈负相关关系（P<0.05,r=-0.618;P<0.05,r=-0.635）,血清IFN-γ水平亦与Treg呈负相关关系（P<0.01,r=-0.342）;LC患者中,外周血中NK细胞绝对数值与Treg细胞比例呈负相关关系（P<0.05,r=-0.317）,IFN-γ+NK细胞比例与血清中IL-10水平呈负相关关系（P<0.05,r=-0.514）;HCC患者组IFN-γ+NK细胞比例与Treg细胞比例、血清IL-10水平均呈负相关关系（P<0.01,r=-0.676;P<0.01,r=-0.615）。结论:CHB患者及其进展疾病如LC和HCC外周血IFN-γ+NK细胞比例与Treg细胞的比例、血清IL-10水平呈负相关关系,提示Treg和IL-10参与抑制IFN-γ+NK细胞可能是慢性HBV感染及其进展的重要因素之一,因此逆转Treg及IL-10所致的免疫耐受,将会有力提高NK细胞抗HBV慢性感染及其恶性进展。
宁璐[7]（2019）在《HBV特异性T细胞应答在长效干扰素alpha-2a治疗儿童慢性乙型肝炎中作用的研究》文中研究指明研究背景慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染损伤宿主免疫应答,致使宿主不能完全清除病毒,肝脏炎症病理持续存在并最终发展为肝硬化和原发性肝癌。在慢性HBV感染中,由于持续暴露于高浓度的HBV抗原之下,HBV特异性的T细胞（HBV-specific T cells）数量减少并且功能耗竭,这是导致HBV感染慢性化的主要原因。目前治疗慢性乙型肝炎（CHB）的长效干扰素α（PegIFNα）可通过激活宿主免疫应答抑制病毒复制,提高HBV e抗原（HBeAg）血清学转换率,并且停药后复发率较低。既往在成人CHB研究中发现PegIFNα能激发HBV特异性T细胞的抗病毒作用,但在儿童CHB中尚未研究。研究目的本研究以PegIFNα治疗HBeAg 阳性儿童CHB为对象,探讨PegIFNα治疗过程中T/NK细胞表型频数及HBV特异性T细胞细胞因子分泌功能的动态变化,并分析其与治疗结局的关系。研究方法1.研究对象以2015-2017年20例PegIFNα治疗HBeAg儿童CHB为对象。收集0,12,24,36,48周肝素钠抗凝外周血,根据治疗结局分为完全应答组（complete response,CR）和不应答病例组（non-response,NR）。CR组定义为HBV DNA,HBsAg和HBeAg三者转阴;NR组定义为HBV DNA,HBsAg和HBeAg三者下降程度均小于 1 log10 IU/mL 或 1 log10 COI。2.HBV病毒定量和血清学检测COBAS TaqMan HBV检测血清病毒定量,雅培i2000检测HBeAg和HBsAg。3.T/NK细胞表型检测Ficoll密度梯度离心法分离得外周血单个核细胞（PBMCs）,流式细胞术检测 CR/NR 组 CD69+CD4+/CD8+T 细胞、TRAIL+CD4+/CD8+T 细胞和 TRAIL+CD56+NK细胞的频数。4.HBV特异性细胞应答检测以合成的HBV B基因型的core/envelope/X/CF肽库特异刺激PBMCs 10天,标记CD4+/CD8+T细胞表型后破膜胞内染色IFN-γ并以流式细胞术检测其频数。结果1.PegIFNα 显着降低患儿 HBV DNA、HBsAg、HBeAg 水平HBV DNA、HBsAg、HBeAg和ALT在未治疗患儿中均呈现较高水平（中位数分别为 HBV DNA 1.7E+08 IU/mL,HBsAg 23339.500 IU/mL,HBeAg 1260.690 COI,ALT 110.5 U/L）;经过 PegIFNα 治疗后,HBV DNA、HBsAg、HBeAg可见显着下降（中位数分别为HBV DNA 10 IU/mL,HBsAg 0.92 IU/mL,HBeAg 2.17COI,ALT 69 U/L）,均有显着差异（P<0.01）。2.CR组CD69+/TRAIL+T细胞频数明显高于NR组经过PegIFNα治疗后,CR组CD69+CD8+T细胞频数显着高于NR组（1.82%vs.0.61%,P=0.0003）;同样,TRAIL+CD4+T 和 TRAIL+CD8+T 细胞频数在CR 组也显着高于 NR 组（分别为 1.30%vs.0.19%,P=0.001,1.34%vs.0.34%,P=0.002）。3.CR组T/NK细胞表型随治疗的动态变化选取相邻时间log10 HBV DNA最大变化点（定义为MFC）作为纵向比较的时间点,MFC时间点的CD69+CD4+/CD8+T细胞频数显着高于基线（分别为1.19%vs.0.69%,P=0.01;2.45%vs.1.18%,P=0.003）;MFC时间点 TRAIL+CD4+/CD8+T细胞频数同样显着高于基线（分别为2.81%vs.1.92%,P=0.009;2.75%vs.1.89%,P=0.002）。此外,与基线相比,MFC 时间点的 TRAIL+CD56hi NK细胞的频数显着升高（2.00%vs.0.92%,P=0.003）。并且,基线时的TRAIL+CD56hi NK细胞频数与基线的ALT水平呈正相关（r=0.663,P=0.002）。4.CR组HBV T细胞特异性应答水平显着高于NR组HBV特异性T细胞应答在CR组和NR组可检测到阳性结果。在基线时间点,CR组的core/envelope肽库特异性刺激的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞频数显着高于NR组（均值0.68%vs.0.26%,P=0.001）;而在治疗结束时,两组HBV特异性T细胞应答水平的差异进一步增大。在CR组中,治疗结束时间点的core特异性的IFN-γ+CD4+/CD8+T细胞应答水平显着高于基线（0.67 vs.1.04,P=0.009;0.5 vs.0.91;P=0.041）;基线core/envelope特异性的IFN-γ+CD4+/CD8+T频数分别与log 10 HBV DNA从基线到12 周的下降程度呈正相关（r=0.639,P=0.002;r=0.680,P=0.001）。结论在PegIFNα治疗儿童CHB中,早期增强的HBV特异性T细胞应答水平与治疗结局相关,强效的HBV特异性T细胞应答预示更易发生HBsAg转阴,最终可达到临床治愈。
王文涛[8]（2019）在《自然杀伤细胞和乙肝病毒特异性T细胞与中断核苷（酸）类似物后的病毒学复发和肝脏损伤相关性的研究》文中指出背景与目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一个全球性的公共卫生问题,其疾病谱多样,可表现为无症状的携带者、肝炎活动、肝硬化或肝功能失代偿。核苷（酸）类似物（nucleos（t）ide analogue,NA）治疗能够有效地抑制HBV DNA的复制水平,使肝功能复常,延缓肝硬化的进展,降低肝脏失代偿或肝细胞癌的发生,从而改善部分患者的预后。然而,NA治疗对共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）却无直接抑制作用,难以彻底根治HBV感染,其中断治疗以后极易发生病毒学复发和肝脏损伤,甚至诱发重症肝炎导致患者的死亡。根据先前的临床观察,HBsAg携带者或已实现临床治愈的HBsAg阴性患者,在接受激素、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂等之后,发生HBV再激活的风险增加,表明了免疫因素即使在先前自发病毒控制的病人仍然在抑制病毒过程中发挥着极其重要的作用。目前尚不清楚慢性乙型肝炎中断NA治疗之后的病毒学复发是否与机体免疫状态存在着联系。自然杀伤（natural killer,NK）细胞和病毒特异性T细胞是两种最主要的效应细胞,在清除HBV过程中扮演着非常重要的角色。然而,慢性HBV感染阶段,特别在是高病毒血症的患者,NK细胞和HBV特异性T细胞表现为功能失调,抗病毒能力明显减弱。本研究着重从免疫学的角度出发,分析NK和病毒特异性T细胞反应在中断NA治疗之后的纵向变化,并分析其与病毒学复发和肝脏损伤之间的相关性。为了进一步阐明其在影响病毒学反应中的作用,中断NA治疗时的细胞免疫也与自发性病毒控制的非活动性携带者和失败的病毒控制的HBeAg阴性肝炎患者进行横断面比较。方法1.研究设计:我们共随访24例经NA治疗HBeAg阴性的患者,在取得完全病毒学缓解（HBV DNA<500 copies/mL）之后,巩固治疗时间至少超过两年,中断治疗时血清HBsAg水平>200 IU/mL,随访至少超过一年,根据一年以内是否出现HBV DNA>1×104 copies/mL,我们将其分为两组:病毒学复发组（virologic relapse,VR）和非复发组（no virologic relapse,NVR）;我们也随访了19例基线血清HBsAg水平>200 IU/mL的非活动性携带者;此外,28例HBeAg阴性的慢性肝炎患者作为对照组。2.门诊或住院部采集患者外周血样,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,并留取血浆,冻存。3.流式细胞术分别检测NK细胞及其亚型的频率、表型、分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α的能力和细胞毒活性。4.利用HBV核心抗原和S抗原的肽库分别刺激PBMCs,体外培养10天后,流式细胞术检测CD4+或CD8+T细胞产生细胞因子IFN-γ和IL-2的水平。5.体外IFN-γ的酶联免疫斑点实验（ELISpot）。结果研究队列的临床特点中断NA治疗后一年以内,14名患者发生病毒学复发（HBV DNA>1×104copies/mL）,其中9名患者发生临床复发（同时满足HBV DNA>1×104 copies/mL和ALT>80 U/L）,一年以内累积的病毒学复发和临床复发率分别为58.3%和37.5%。作为对比,IC组在一年的随访中仅有2名患者出现血清HBV DNA水平>1×104copies/mL,其中只有1名患者出现ALT异常（ALT>80 U/L）,均低于中断NA治疗组（P<0.05）。血清HBsAg水平与ENEG组相比,VR组和NVR组中断治疗时,以及IC组血清HBsAg水平明显较低（P<0.01）。然而,VR组、NVR组和IC组之间的血清HBsAg水平无统计学差异（P>0.05）。NVR组中断治疗后一年以内血清HBsAg水平维持相对稳定,而VR组病毒学反弹时的血清HBsAg水平明显高于中断NA治疗时的血清HBsAg水平（P<0.05）。NK细胞的频率VR组和NVR组NK细胞及CD56bright亚型的频率无明显差异（P>0.05）,且与ENEG组和IC组相比无明显差异（P>0.05）。与中断NA治疗时相比,无论是VR组还是NVR组,NK细胞及CD56bright亚型的频率在一年的随访中均无明显变化（P>0.05）。NK细胞的表型VR组和ENEG组NK细胞表达抑制性受体CD96的水平明显高于NVR组和IC组（P<0.05）。VR组NK细胞表达的抑制性受体NKG2A水平明显高于IC组（P<0.05）。同样,VR组在停药后第1、6月NK细胞表达CD96的水平,和第3月NK细胞表达NKG2A的水平均显着高于NVR组（P<0.05）。此外,与VR、NVR、IC组相比,ENEG期CD69+NK细胞频率明显增加（P<0.05）。纵向上来看,NVR组NK细胞表面受体的表达在一年的随访中相对稳定。与此对比,VR组NK细胞表达活化性受体NKp44、NKG2C和CD69的水平在第6个月和第12个月时相较中断治疗时明显增加。NK细胞功能与ENEG组相比,VR组的NK细胞在中断NA治疗时产生IFN-γ的能力部分恢复,但是无论是IL-12/IL-18还是PMA/离子霉素刺激,均明显弱于NVR组和IC组（P<0.05）。与IC组相比,VR组在中断NA治疗时NK细胞产生TNF-α的能力相对减弱（P<0.05）。NK细胞的杀伤活性是通过检测穿孔素、颗粒酶B的表达以及CD107a的脱颗粒来决定,以上四组的细胞毒活性并无明显差异。此外,VR组在中断NA治疗之后第1、3、6、12月NK细胞产生IFN-γ的能力均明显低于NVR组（P<0.05）。在纵向分析中,NVR组在中断NA治疗后一年以内NK细胞表达IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B和CD107a水平无明显改变（P<0.05）。相比之下,与中断NA治疗时相比,VR组停药后第6、12月NK细胞表达穿孔素和CD107a的水平均明显增加（P<0.05）。NK细胞功能与肝脏损伤的相关性与中断NA治疗时和HBV DNA<1×104 copies/mL时相比,VR组在HBV DNA>1×104 copies/mL时NK细胞表达穿孔素和CD107a的水平明显增加,而NK细胞表达IFN-γ的能力却没有相应改善,表明了NK细胞功能向细胞毒活性发生偏移。此外,增加的穿孔素或CD107a阳性的NK细胞频率与病毒学复发时的血清ALT水平呈正相关（P=0.003和P<0.001）。病毒特异性T细胞反应HBV核心抗原（core）肽库刺激的T细胞反应,在中断治疗时及其后第3、6和12月CD4+T细胞产生IFN-γ,在第6月时CD8+T细胞产生IFN-γ,在第1、6月时CD4+T细胞产生IL-2的水平均明显低于NVR组（P<0.05）。与此同时,VR组和NVR组HBV S抗原肽库刺激的T细胞反应并无显着性差异。横断面分析显示,与ENEG组相比,NVR组core肽库刺激的CD4+T细胞产生的IFN-γ和IL-2的水平显着提高（P<0.05）。然而,与ENEG组相比,VR组core或S抗原肽库刺激的T细胞反应却无明显改善。与ENEG和VR组相比,IC组core抗原肽库刺激的T细胞反应均明显增强（P<0.05）。体外IFN-γELISpot分析显示NVR组中断治疗后第3、6月时core肽库刺激的SFC值明显高于VR组（P<0.05）。此外,在core肽库刺激的反应中,NVR组在中断治疗时SFC值高于ENEG组,VR组和ENEG组则明显低于IC组（P<0.05）。除NVR组停药后第6月时产生IFN-γ的S抗原特异性CD8+T细胞外,与中断治疗时相比,我们未观察到core或S特异性T细胞应答的实质性变化。结论低的NK细胞产生IFN-γ的能力和core特异性T细胞反应与中断NA治疗之后的病毒学复发有关。与非活动性携带者相比,经NA治疗的患者显示出更受损的NK和病毒特异性T细胞反应,这与后者停药后比较高的病毒学复发和临床复发率相一致。NK细胞在病毒学复发时呈现为活化性的表型,功能向细胞毒活性发生偏移,且这种增加的细胞毒活性与中断NA治疗之后的肝脏损伤有关。本研究的科学价值我们的本研究有助于理解中断NA治疗之后病毒学复发和临床复发背后的免疫学机制,并为安全停药提供指导。针对NK细胞和HBV特异性T细胞的免疫治疗可以逆转病毒与宿主免疫之间的失衡,从而有助于实现更持久的病毒控制,甚至到达临床治愈。此外,我们的研究也提供了一种有希望的策略:如果难以实现HBsAg血清学清除,在部分患者可通过治疗实现有效的免疫重建,将其诱导成类似于非活动性携带者的状态,进而实现安全的断药。
周积云[9]（2019）在《乙型肝炎患者不同感染阶段CD8+CD28+T淋巴细胞表达及其与HBsAg的关系》文中认为目的:通过对乙型肝炎患者不同感染阶段外周血及肝脏组织内CD8+CD28+T淋巴细胞含量进行检测,观察CD8+CD28+T淋巴细胞在不同感染阶段的表达差异;同时讨论CD8+CD28+T淋巴细胞与外周血HBsAg的关系,并探讨其临床意义。方法:选取2018年4月2019年1月于我院诊治的乙型肝炎患者80例,其中免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、再活动期患者各20例,另选择健康人20例。使用流式细胞术检测纳入人群外周血CD8+CD28+T淋巴细胞表达;免疫组织化学方法检测乙型肝炎患者肝脏组织内CD8+CD28+T淋巴细胞表达;以及电化学发光法定量检测乙型肝炎患者外周血HBsAg含量。收集实验数据并进行统计学分析。结果:（1）流式细胞术结果显示:健康人、免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、再活动期外周血CD8+CD28+T淋巴细胞百分比分别为（26.2±3.5）%、（26.6±3.5）%、（40.3±5.5）%、（20.0±4.4）%和（22.3±2.0）%,各组之间差异具有统计学意义（均有P<0.05）。免疫组织化学结果示:免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、再活动期肝脏组织CD8+CD28+T淋巴细胞表达分别为（13.1±3.5）个/HP、（31.1±5.3）个/HP、（6.2±2.4）个/HP和（8.7±1.9）个/HP,各组之间差异具有统计学意义（均有P<0.05）。（2）HBsAg低、中、高三组人群外周血CD8+CD28+T淋巴细胞百分比分别为（22.7±6.3）%、（27.0±8.1）%和（32.7±8.6）%,各组间差异有统计学意义（均有P<0.05）;肝脏组织CD8+CD28+T淋巴细胞表达分别为（9.4±7.8）个/HP、（14.3±9.8）个/HP和（21.2±10.4）个/HP,各组间差异有统计学意义（均有P<0.05）。结论:（1）乙型肝炎患者不同感染阶段外周血及肝脏组织CD8+CD28+T淋巴细胞表达均存在明显差异,可能与病毒长期刺激机体免疫系统,导致免疫系统功能失调有关。（2）HBsAg分子水平可间接反应肝脏免疫反应激活程度。
郑金伟[10]（2019）在《MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的慢性感染仍是危害人类健康的公共卫生问题之一,尽管预防性疫苗的普及显着减少了乙型肝炎病毒新发感染,但目前全球仍有超过2.57亿慢性HBV感染者需要及时有效的治疗。由于目前现有的治疗策略只能控制病毒的复制而难以完全治愈慢乙肝,因此开发更为有效的新型药物是迫切而必要的。新药的研发有赖于对HBV生物学和HBV与宿主相互作用的深入认识,这些研究的实施都需要能模拟HBV完整生命周期的体外细胞模型和体内动物模型的构建和发展。其中细胞模型是最常用且方便的用于体外研究HBV的感染和复制、HBV与宿主之间的相互作用、筛选和评价抗HBV药物的重要平台。本团队之前构建了两株细胞模型:HepG2-N10和HepG2-hNTCP（2B1）。其中HepG2-N10是在HepG2细胞中稳定整合了1.1倍体A基因型的HBV基因组,可以支持HBV复制和用于药物筛选和评价。另外HepG2-hNTCP（2B1）可以支持HBV感染和cccDNA形成,但是感染所需病毒剂量高且感染阳性率低,仅为20%～30%,同时感染时依赖PEG。本研究对MAPK抑制剂库进行筛选,旨在优化HepG2-hNTCP细胞感染模型,提高其感染效率和摆脱PEG的约束。同时寻找限制鼠肝细胞不能支持HBV感染的因子,进而构建支持HBV感染且免疫功能健全的小鼠模型。本研究同时在复制模型HepG2-N10和感染模型HepG2-hNTCP上对140种MAPK抑制剂进行筛选,结果发现两种模型得到的结果差异显着。同时进行抗原水平相关性分析没有发现两种模型得到的结果有明显相关性。感染模型可以支持HBV感染,其病毒以类似自然感染状态进行复制,更符合HBV的生理。因此,可以说明复制模型用于药物筛选和评价的结果需要进一步验证。本研究在2B1细胞模型中对140种MAPK抑制剂进行初步筛选,结果发现了30种MAPK抑制剂在感染后第六天加药处理能够增强HBV复制。进一步分析这30种MAPK抑制剂在感染前加入并持续添加对HBV感染的影响,结果显示有12种促进HBV感染效果显着。同时仅在感染前处理24小时,发现SCH772984,Trametinib,PD184352和Cobimetinib这四种MAPK抑制剂就能非常显着的提升HBV感染水平,其中HBeAg均提高了5倍以上,HBsAg均提高了10倍以上。此外,本研究对这些MAPK抑制剂促进HBV感染的机制进行了初步探索。根据是否上调NTCP表达可将这些MAPK抑制剂分为NTCP途径依赖型和非NTCP依赖型。B-Raf IN1为NTCP途径依赖型的MAPK抑制剂,可以增强HBV的感染,特别是对cccDNA。对B-Raf IN1处理后的2B1细胞进行转录组测序,结果显示B-Raf IN1可增强NTCP的表达,另外与HBV感染和复制相关的宿主基因也有不同程度提高。目前己对上调的JunB基因进行了验证,发现过表达JunB可增强HBV在2B1细胞中的感染以及敲低后抑制HBV的感染,因此可以推出B-Raf IN1促进HBV感染与增强JunB的表达有关。但是JunB本身是一种转录因子,并不能直接作用于HBV。因此仍需寻找与HBV感染更关键的因子。其他与HBV感染相关的宿主基因仍在验证当中。此外,针对非NTCP依赖型的MAPK抑制剂,我们首先猜想是否2B1细胞表面存在其他能与HBV结合的受体。因此,我们进行了 HBsAg结合实验,结果显示B-Raf IN-1d,Pimasertib,Selumetinib,PD0325901,SCH772984,Trametinib,TAK632和Cobimetinib能够明显增强HBsAg阳性率,说明这些MAPK抑制剂诱导了细胞表面某种能与HBsAg结合的蛋白,从而促进HBV的感染。进一步我们筛选了其中几个进行转录组测序,涉及HBV感染相关的宿主基因正在验证中。综述所述,本研究在HepG2-hNTCP细胞模型中筛选出了几种能显着促进HBV感染了MAPK抑制剂并对其作用机制进行了初步探索。为构建更优的体外细胞感染模型提供了可能。
二、清除乙型肝炎病毒的非细胞裂解机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、清除乙型肝炎病毒的非细胞裂解机制（论文提纲范文）
（1）激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性HBV感染的自然史 |
| 1.2 慢性HBV感染的免疫应答 |
| 1.2.1 慢性HBV感染中固有免疫反应 |
| 1.2.2 慢性HBV感染中适应性免疫反应 |
| 1.3 慢性乙型肝炎免疫治疗进展 |
| 1.3.1 靶向固有免疫的治疗策略 |
| 1.3.2 靶向适应性免疫的治疗策略 |
| 1.3.3 其它免疫治疗策略 |
| 1.4 免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB研究现状 |
| 1.4.1 OX40/OX40L相关研究进展 |
| 1.4.2 PD-1 相关研究进展 |
| 1.4.3 4-1BB相关研究进展 |
| 第2章 OX40/OX40L及其可溶性分子在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人的样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血采集及血浆分离与保存 |
| 2.2.2 外周血单个核细胞提取 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.4 免疫组化检测肝组织内OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆中sOX40/OX40L水平 |
| 2.2.6 统计处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 2.3.2 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的表达 |
| 2.3.3 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的水平与临床的相关性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 PD-1、4-1BB分子及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 人的样本来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 复苏外周血单个核细胞和准备血浆 |
| 3.2.2 磁珠分选人外周血T细胞亚群 |
| 3.2.3 PBMCs中总RNA的提取 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测PBMCs中PD-1和4-1BB mRNA水平 |
| 3.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆sPD-1和s4-1BB |
| 3.2.6 免疫组化检测肝脏内PD-1和4-1BB的表达 |
| 3.2.7 统计处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 3.3.2 慢性乙肝患者中PD-1及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.3.3 慢性乙肝患者中4-1BB及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建及在HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响的相关研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和r AAV8/1.3HBV病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 建立经尾静脉注射腺相关病毒的HBV模型 |
| 4.2.2 检测小鼠血清内HBsAg、HBe Ag水平 |
| 4.2.3 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝脏组织全基因组DNA提取 |
| 4.2.5 qRT-PCR法检测小鼠HBV DNA定量 |
| 4.2.6 流式细胞术检测小鼠肝内T细胞亚群比例 |
| 4.2.7 CBA法检测小鼠血清内细胞因子 |
| 4.2.8 检测小鼠血清ALT,AST水平 |
| 4.2.9 处理小鼠肝脏组织和制备切片 |
| 4.2.10 小鼠肝脏组织HE染色 |
| 4.2.11 免疫组化检测小鼠肝组织内HBsAg和HBcAg |
| 4.2.12 数据统计处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 rAAV8/1.3 HBV小鼠模型的构建 |
| 4.3.2 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制同时伴随着肝脏炎症的产生 |
| 4.3.3 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制的同时伴随着T细胞亚群比例及免疫细胞因子的变化 |
| 4.3.4 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制具有药物剂量依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制相关机制的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠体内CD4~+和CD8~+T细胞的剔除 |
| 5.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血的T细胞 |
| 5.2.3 小鼠血清HBsAg和肝脏组织内HBV DNA的检测 |
| 5.2.4 小鼠血清ALT水平检测 |
| 5.2.5 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 5.2.6 小鼠肝脏内淋巴细胞mRNA的提取及文库构建测序 |
| 5.2.7 数据统计处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CD4~+T和CD8~+T 细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建 |
| 5.3.2 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程相对于CD4~+ T细胞似乎更依赖于CD8~+ T细胞的作用 |
| 5.3.3 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程中基于mRNA测序的小鼠肝内浸润淋巴细胞的转录组学研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）慢性酒精消耗抑制CD8+ T细胞抗乙肝病毒免疫应答（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 酒精引起的肝损伤 |
| 4 参考文献 |
（3）乙型肝炎病毒增加QPCT表达促进HBV复制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎抗病毒治疗及乙肝研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间本人的科研成果 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（4）不同PD-1及CXCR5表达的T淋巴细胞在乙型肝炎病毒感染中的功能研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PD-1~(hi) CXCR5~+CD4~+Tfh细胞和PD-1~(hi) CXCR5-CD4~+Tph细胞对经PEG-IFN-α治疗的CHB患者HBsAg下降和HBV DNA清除的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HBV特异性CXCR5~+CD8~+Tfc细胞在HBV感染中的作用研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:慢性乙型病毒性肝炎治愈中的免疫重建 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（5）柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 柳胺酚代谢产物鉴定及代谢通路研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 配置柳胺酚溶液 |
| 3.2 动物实验方案 |
| 3.3 体内代谢产物样品的收集与处理 |
| 3.4 体外代谢产物的制备 |
| 3.5 色谱与质谱条件 |
| 3.6 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 柳胺酚母离子分析 |
| 4.2 柳胺酚代谢产物鉴定 |
| 4.3 柳胺酚肝脏药物代谢酶亚型鉴定 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第二部分 柳胺酚代谢产物抗HBV活性研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 RRM2活性位点与柳胺酚及其代谢产物分子对接 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞增殖毒性测定 |
| 3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.5 细胞水平抗乙肝病毒活性测定 |
| 3.6 柳胺酚羟基化代谢产物与核苷(酸)类似物联合效应测定 |
| 3.7 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 RRM2分子活性位点定义 |
| 4.2 柳胺酚及其代谢产物与RRM2分子对接结果 |
| 4.3 LAF-OH对细胞增殖毒性影响的研究 |
| 4.4 LAF-OH对细胞凋亡影响的研究 |
| 4.5 LAF-OH抗HBV活性研究 |
| 4.6 LAF-OH与核苷(酸)类似物联合用药研究 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第三部分 柳胺酚活性代谢物LAF-OH抗HBV机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株及载体 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 细胞内RRM2活性检测 |
| 3.4 LAF-OH处理后细胞内RRM1、RRM2、RRM2B在mRNA及蛋白水平的表达检测 |
| 3.5 iTRAQ标记定量蛋白组分析方法 |
| 3.6 细胞周期检测方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 LAF-OH对细胞周期及IL-17、PPAR等信号通路产生调控 |
| 4.2 LAF-OH通过降低Akt的磷酸化水平下调cyclin D1表达水平 |
| 4.3 LAF-OH在mRNA水平及蛋白质水平抑制RRM2的表达 |
| 4.4 LAF-OH对RR活性具有抑制作用 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒治疗药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）慢性HBV感染者NK细胞与Treg及细胞因子的关系研究（论文提纲范文）
| 英文缩略对照表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 1.1 自然杀伤细胞(nature killer cell,NK cell)细胞 |
| 1.2 NK细胞对病原体感染细胞的细胞毒作用 |
| 1.3 NK细胞在HBV感染中的作用 |
| 1.4 细胞因子 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 临床样本 |
| 2.2 主要实验设备 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 主要试剂配制方法 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 HBV感染患者外周血Treg比例及Treg计数在四组间的比较 |
| 3.2 HBV感染患者外周血细胞因子在四组间的比较 |
| 3.3 HBV感染患者组外周血Treg比例和IL-10、IFN-γ的相关性分析 |
| 3.4 HBV感染患者外周血淋巴细胞亚群在四组间的比较 |
| 3.5 外周血IFN-γ+NK细胞的百分比在四组间的比较 |
| 3.6 CHB、LC和HCC患者外周血IFN-γ+NK细胞比例/NK细胞计数与Treg细胞的比例、IL-10水平的相关性分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.面临的问题和前景 |
| 7.参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 NK细胞在HBV感染中的作用 |
| 参考文献 |
（7）HBV特异性T细胞应答在长效干扰素alpha-2a治疗儿童慢性乙型肝炎中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 慢性HBV感染的流行病学 |
| 1.2 HBV的自然感染史 |
| 1.3 儿童慢性乙型肝炎的治疗 |
| 1.3.1 儿童慢性乙型肝炎的治疗目标 |
| 1.3.2 核苷(酸)类 |
| 1.3.3 干扰素及其衍生物 |
| 1.4 慢性乙型肝炎适应性免疫应答特点 |
| 1.4.1 慢性HBV感染中的B细胞应答特点 |
| 1.4.2 慢性乙型肝炎中HBV特异性T细胞应答特点 |
| 1.4.3 T细胞清除病毒的作用机制 |
| 1.4.4 T细胞耗竭与功能重建 |
| 1.5 慢性HBV感染过程免疫应答与年龄关系 |
| 第二章 HBV特异性T细胞应答在PegIFNα治疗儿童CHB中作用的研究 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 研究队列建立 |
| 2.2.2 仪器和试剂 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PegIFNα显着降低患儿HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平 |
| 2.3.2 CR组CD69~+/TRAIL~+T细胞频数显着高于NR组 |
| 2.3.3 比较CR组T/NK细胞表型随治疗的动态变化 |
| 2.3.4 比较CR和NR组HBV T细胞特异性应答 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）自然杀伤细胞和乙肝病毒特异性T细胞与中断核苷（酸）类似物后的病毒学复发和肝脏损伤相关性的研究（论文提纲范文）
| 华中科技大学博士学位论文创新点概述 |
| 中英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 研究队列的临床特点 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 NK细胞与中断NA治疗后的病毒学复发及肝脏损伤相关性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBV特异性T细胞与中断NA治疗后的病毒学反应相关性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:固有和适应性免疫应答在HBV感染中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表论文 |
（9）乙型肝炎患者不同感染阶段CD8+CD28+T淋巴细胞表达及其与HBsAg的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 5、结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 A 缩略语表 |
| 附录 B 作者简介 |
| 附录 C 综述 |
| 参考文献 |
（10）MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章: 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒生物学特征 |
| 1.1 病毒分类 |
| 1.2 HBV的血清型和基因型 |
| 1.3 HBV的病毒结构 |
| 1.4 HBV基因组及其功能 |
| 1.5 HBV生命周期 |
| 2 乙型肝炎病毒感染 |
| 2.1 HBV感染的全球地理分布情况 |
| 2.2 HBV的传播途径 |
| 2.3 乙型肝炎病毒感染的自然史 |
| 2.4 HBV感染的预防 |
| 2.5 HBV抗病毒治疗 |
| 3 乙型肝炎病毒研究模型 |
| 3.1 细胞培养模型 |
| 3.2 动物模型 |
| 4 MAPK通路与HBV的相关研究 |
| 5 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章: 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 菌株、质粒、cDNA和细胞株 |
| 1.4 常用试剂 |
| 1.5 实验室常规溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规细胞生物学实验 |
| 2.2 HBV感染实验 |
| 2.3 MAPK抑制剂筛选 |
| 2.4 HBV的DNA的提取与检测 |
| 2.5 HBV HBeAg、 HBsAg和HBcAg的检测 |
| 2.6 PreS1结合实验 |
| 2.7 HBsAg结合实验 |
| 2.8 细胞内蛋白水平的检测-Western Blot |
| 2.9 CCK-8细胞毒性检测 |
| 2.10 过表达和敲低宿主基因的慢病毒的构建及感染 |
| 2.11 转录组测序及分析 |
| 2.12 数据处理与统计学分析 |
| 第三章: 结果与分析 |
| 1 MAPK抑制剂的筛选 |
| 1.1 MAPK抑制剂在复制模型HepG2-N10细胞上的初步筛选 |
| 1.2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染水平的初步探索 |
| 1.3 MAPK抑制剂增强HBV的复制与表达 |
| 1.4 MAPK抑制剂增强HBV的感染与进入 |
| 2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染的机制探索 |
| 2.1 MAPK抑制剂促进HBsAg与肝细胞表面某宿主蛋白的结合 |
| 2.2 B-Raf IN1可通过上调JunB来增强HBV的复制 |
| 第四章: 讨论 |
| 1 HBV复制模型筛选和评价药物结果的可靠性需进一步验证 |
| 2 MAPK抑制剂不依赖NTCP途径促进HBV感染 |
| 3 B-Raf IN1促进cccDNA形成 |
| 第五章: 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、清除乙型肝炎病毒的非细胞裂解机制（论文参考文献）
- [1]激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究[D]. 湛梦茹. 吉林大学, 2021(01)
- [2]慢性酒精消耗抑制CD8+ T细胞抗乙肝病毒免疫应答[D]. 姜淑玲. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]乙型肝炎病毒增加QPCT表达促进HBV复制[D]. 张聪会. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [4]不同PD-1及CXCR5表达的T淋巴细胞在乙型肝炎病毒感染中的功能研究[D]. 张莉. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究[D]. 武喆. 浙江大学, 2020(01)
- [6]慢性HBV感染者NK细胞与Treg及细胞因子的关系研究[D]. 夏天. 安徽医科大学, 2020(02)
- [7]HBV特异性T细胞应答在长效干扰素alpha-2a治疗儿童慢性乙型肝炎中作用的研究[D]. 宁璐. 南方医科大学, 2019(02)
- [8]自然杀伤细胞和乙肝病毒特异性T细胞与中断核苷（酸）类似物后的病毒学复发和肝脏损伤相关性的研究[D]. 王文涛. 华中科技大学, 2019(03)
- [9]乙型肝炎患者不同感染阶段CD8+CD28+T淋巴细胞表达及其与HBsAg的关系[D]. 周积云. 蚌埠医学院, 2019(01)
- [10]MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索[D]. 郑金伟. 厦门大学, 2019(09)