一、PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用（论文文献综述）
郑建波[1]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中指出研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
韩旭[2]（2020）在《新型端粒酶抑制剂：2-苯基-4H-色酮衍生物的设计、合成、体外抗癌活性评价及构效关系研究》文中进行了进一步梳理在多数肿瘤细胞中端粒酶呈现出不同程度的高表达,而端粒酶的重新激活是细胞永生化即肿瘤发生的重要步骤。设计合成并筛选出具有高效抑制端粒酶活性的新型化合物用于癌症治疗一直以来是我们所感兴趣的。基于课题组的前期工作,我们设计合成了A和B两个系列,一共66个含有酰胺和1,3,4-恶二唑部分的2-苯基-4H-色酮衍生物作为潜在的端粒酶抑制剂。所有标题化合物均通过1H NMR,13C NMR,HRMS表征确证。其中,化合物A11和B8结构通过单晶X-ray衍射,得到再次的确证。使用TRAP-PCR-ELISA测定法检测所有标题化合物对端粒酶的抑制作用,结果显示绝大部分标题化合物对端粒酶具有较好的抑制活性,其中化合物A2,A5,A16,A20,A27,A33,B27和B33表现出显着的端粒酶抑制活性(IC50<1μM),IC50值分别为0.77,0.81,0.62,0.92,0.32,0.44,0.51和0.97μM,优于阳性对照药星形孢菌素(IC50=6.41μM),并且与阳性对照药BIBR1532活性(IC50=0.29μM)相当。此外,通过MTT实验检测了部分目标化合物在体外对A375人黑色素瘤细胞,MDA-MB-231人乳腺癌细胞,MGC-803人胃癌细胞,SMMC-7721人肝癌细胞和SGC-7901人胃癌细胞这五种癌细胞系的抗增殖活性。仔细观察发现具有高效端粒酶抑制活性的化合物A33对这五种癌细胞系均表现出有效的抗癌活性,其IC50值分别为11.21,9.89,8.76,9.67和10.01μM,并且对L-02人永生化正常肝细胞表现出明显的无毒作用,IC50为2.21 m M。进一步的流式细胞仪分析结果表明化合物A33呈剂量依赖性方式阻滞MGC-803细胞周期于G2/M期,并且促进细胞的凋亡。此外,蛋白免疫印迹实验结果表明化合物A33以浓度依赖性方式下调了端粒酶的核心组分Dyskerin-NOP10-NHP2三聚体蛋白的表达。根据标题化合物的端粒酶抑制活性数据总结出初步的构效关系,发现R1位甲氧基的取代有利于端粒酶抑制活性的提高,而R2位上苯环的对位取代普遍显示出更强的端粒酶抑制活性。当R2位上苯环的对位和邻位用卤素取代时,随着电负性的增加而增强了端粒酶活性的抑制作用（F>Cl>Br）。此外,用芳香族稠环、芳香族杂环以及其他取代基替代R2位上的苯环,对端粒酶抑制也有重要的影响。特别是,用苯乙烯基替代R2位上的苯基产生的化合物A33,显着提高了端粒酶的抑制活性。
姜明哲[3]（2020）在《冬凌草甲素（oridonin）靶向HK1抑制膀胱肿瘤细胞增殖的作用及机制研究》文中指出目的:膀胱癌肿瘤细胞的失控生长是膀胱癌高复发及高致死率的主要原因,研究导致膀胱发生癌变的分子机制,对能够有效干预恶性增殖的靶点进行鉴定,并发现有效治疗膀胱肿瘤的小分子药物,已成为膀胱肿瘤治疗方面的重要问题。冬凌草甲素（Oridonin,ORI）在体内以多靶点、多通路形式调节细胞的各项功能。为深入理解Oridonin的抗肿瘤分子机制,并为其在膀胱肿瘤治疗的有效应用上提供指引,本研究拟从系统层次上对冬凌草甲素的直接作用靶点进行搜寻,从而在根本上对Oridonin的抗肿瘤原理进行深层次的探索与理解。研究方法:1.通过人类蛋白质组芯片检测以及应用生物信息学分析,鉴定可能与药物Oridonin直接结合的潜在靶基因。2.通过小分子pull-down实验体内验证Oridonin与己糖激酶1（HK1）的结合。3.通过免疫印迹（Western Blotting）分别检测HK1在膀胱癌组织中的表达和在其他正常组织中的表达,并进行比对分析。采用HPA数据库评估HK1表达与肿瘤分级之间的关系,采用TCGA数据库结合基因集富集分析方法,对HK1在膀胱癌恶性发生发展过程中可能存在的癌生物学功能进行探索。4.在膀胱癌细胞系5637、UMUC3中结合HKL1基因敲减实验和CCK8、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷方法,检测HK1敲减对膀胱癌细胞的分裂、存活能力的影响。5.利用膀胱癌细胞系5637、UMUC3,结合HK1的基因敲减,通过基因敲减、CCK8、Western Blotting实验研究Oridonin对膀胱癌细胞存活能力及HK1表达的影响。6.利用Octet K2分子互作考察HK1与Oridonin之间的结合情况。结果:1.利用蛋白质组芯片技术,结合生物信息分析和结合验证,初步发现了包括HK1在内大量的Oridonin潜在直接结合蛋白。本研究发现一种蛋白质（HK1）,它在与冬凌草甲素相互作用的过程中不仅参与了糖酵解的过程,还与多种重要的细胞信号通路发生了反应。2.Oridonin与己糖激酶1（HK1）的体内结合被初步证实。3.HK1蛋白在膀胱癌变组织细胞中的表达,远远高于HK1蛋白在健康膀胱组织细胞中的表达水平;同时HK1蛋白在高级别膀胱癌变组织细胞中的表达水平也远远高于HK1蛋白在低级别膀胱癌组织细胞内的表达水平;以上事实说明在膀胱癌标本中,HK1蛋白的高表达影响着细胞代谢、细胞增值和细胞凋亡。4.在细胞内敲减HK1基因,即可有效降低膀胱癌细胞分裂增殖能力和存活能力,进而说明HK1在膀胱癌中具有癌基因作用。5.Oridonin对于膀胱癌细胞具有很强的细胞毒性,并且通过抑制HK1的表达,能够有效抑制膀胱癌细胞增殖。6.分子间相互作用的结果提示,HK1与不同浓度Oridonin间均具有结合和解离作用且结合呈浓度依赖性趋势。结论:抗癌小分子药物Oridonin可与HK1等涉及信号调节的功能蛋白直接结合。在人体膀胱癌变组织中,抑制HK1蛋白的表达能力可以有力遏制癌细胞的分裂增殖能力,并有效缩短癌细胞寿命,进而说明HK1在膀胱癌中具有癌基因作用。Oridonin直接结合HK1,达到遏制HK1蛋白表达的目的,从而在根本上控制癌细胞的分裂增值,降低其存活能力,最终使细胞毒性作用有效发挥。
柯瑞盛[4]（2019）在《miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究》文中进行了进一步梳理第一章 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床意义及分子功能机制研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）主要是以手术切除为主的综合治疗,但大多数患者预后未达到理想预期。因此,改善HCC的早期诊断和预测预后、探索更多有效的治疗方法,是目前临床上急需解决的难题。MicroRNAs（miRNA）在各种恶性肿瘤的进展中起关键作用。表达异常的miRNA具有显着的临床意义,能够调控肿瘤进展的相关过程,表现出改善肿瘤靶向治疗的巨大潜能。本研究从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中的HCC相关miRNAs差异表达谱,筛选到了在HCC中表达水平显着上调的miR-423,进一步预测了其潜在靶基因为转化生长因子β受体III（Transforming growth factor beta receptor III,TGFBR3）,并结合已有文献报道,本研究推测miR-423可能是通过调控TGFBR3来影响PI3K/AKT通路发挥其在肝癌中的功能。本项目的研究结果将丰富肝癌中功能miRNA的种类,为该疾病的提供一种新的生物标记物及潜在治疗靶点。目的:本研究通过临床研究、功能研究及分子机制研究,评估miR-423-5p和TGFBR3在肝细胞癌中的临床意义,以及肝细胞癌进展中的生物学功能和分子机制。方法:先从GEO数据库四个不同的数据集中筛选得到了在HCC中表达异常的miR-423,并用生物信息学预测其靶基因为TGFBR3,Kaplan Meier-plotter数据库分别分析miR-423和TGFBR3与肝癌患者的预后关系,FunRich软件分析miR-423-5p和TGFBR3可能涉及了PI3K/AKT信号通路。再用生物信息学分别分析了miR-423-5p和TGFBR3在GEO和TCGA数据库的HCC相关数据中的表达水平和临床意义,使用LinkedOmics数据库分别对miR-423-5p和TGFBR3在HCC中行表达关系分析和GSEA分析,用在线STRING数据库构建TGFBR3的蛋白-蛋白互作（PPI）网络,并分析TGFBR3基因在人体肿瘤中可能涉及的KEGG信号通路。再回顾性收集本中心132例肝癌患者的组织标本和临床预后信息,使用定量实时PCR（qRT-PCR）用于评估miR-423-5p和TGFBR3的表达。通过ROC曲线分析,Kaplan-Meier生存曲线分析和多因素Cox回归分析等统计方法分别评估miR-423-5p和TGFBR3的临床意义。体外细胞实验研究miR-423-5p和TGFBR3对HCC细胞中细胞生物行为的影响:MTT实验法检测HCC细胞增殖能力,Transwell法观察HCC细胞迁移及侵袭能力,流式细胞术测HCC细胞凋亡情况;体内实验通过构建裸鼠成瘤模型检测miR-423-5p和TGFBR3不同表达对肿瘤生长的影响。双荧光素酶报告基因实验和蛋白质免疫印迹实验（Western Blot,WB）验证HCC中miR-423-5p和TGFBR3之间的表达调控关系。WB实验评估分子机制研究中PI3K/AKT通路涉及的关键蛋白质水平,并用分别用MTT法,Transwell小室法,流式细胞术等检测在HCC细胞中miR-423-5p和TGFBR3是否通过PI3K/AKT通路影响细胞生物学行为。结果:通过对4个GEO数据集中分析筛选,我们寻找HCC中关键基因miR-423,miR-423在GEO数据库（GSE22058）/TCGA数据库总均为高表达。Kaplan Meier-plotter数据库分别结果表明miR-423高表达的HCC患者预后不良（P<0.05）,在GSE20594数据集中miR-423高表达与HCC患者BCLC分期,血管侵犯显着相关（P<0.05）。LinkedOmics数据库结果提示TCGA中miR-423表达与HCC患者的年龄、种群、病理分级、肿瘤T分期、肿瘤N分期、总体生存预后均显着相关（n=375例,P<0.05）。GSEA分析结果显示miR-423可能参与HCC发生发展的细胞周期,DNA复制,癌症相关miRNA,p53信号通路等肿瘤发展相关生物学活动。miR-423-5p在HCC组织和细胞系中的表达均显着上调。在132例HCC患者中,miR-423-5p可以用作诊断生物标志物来区分HCC组织和非癌组织。高表达的miR-423-5p与患者的淋巴结转移,TMN分期及生存预后较差等均显着相关。HCC细胞中表达上调的miR-423-5p在体外可促进HCC细胞增值,迁移侵袭和抑制细胞凋亡,并于体内可促进肝癌生长。GEPIA,Kaplan Meier-plotter和CCLE数据库结果显示TGFBR3在人类不同肿瘤中主要呈现低表达,与多种肿瘤的不良预后相关。TGFBR3蛋白的PPI网络分析也富集得到TGFBR3蛋白参与多种癌症发生和进展相关的KEGG通路。生物信息学分析提示HCC中TGFBR3可能是miR-423-5p靶基因,在LinkedOmics数据库中低表达的TGFBR3与miR-423-5p表达呈负相关。TGFBR3在HCC组织和细胞系中的表达显着降低。我们通过双荧光素酶报告实验和蛋白质免疫印迹实验证明了miR-423-5p在HCC中靶向负调控TGFBR3,miR-423-5p过表达可抑制TGFBR3的表达。低表达的TGFBR3与132例HCC患者的TMN分期,淋巴结转移和生存预后较差均具有显着相关。肝癌细胞中TGFBR3过表达在体外具有抑制HCC细胞增值,迁移侵袭和促进凋亡作用,并且在体内可以抑制肿瘤生长。miR-423-5p上调表达可激活PI3K/AKT信号通路影响HCC细胞的生物学活动。表达上调的TGFBR3能够拮抗逆转miR-423-5p过表达的生物学功能及其对PI3K/AKT信号通路的激活作用。结论:miR-423-5p和TGFBR3的表达异常均可作为HCC患者两种候选诊断和预后的生物标志物。在HCC中,高表达的miR-423-5p可能通过靶向负调控抑制TGFBR3表达,从而激活了PI3K/AKT信号通路活性来促进HCC增殖,转移侵袭等恶性进展。抑制miR-423-5p表达或增强TGFBR3表达的治疗策略可能有助于改善HCC预后并且可作为肝癌潜在的治疗靶标。第二章 HNRNPA1在HBV相关肝细胞癌中的临床价值及分子机制研究背景:由于乙型肝炎病毒（HVB）感染率较高,使得中国每年新发HCC患者占到全世界新发病例总数的55%。然而,根治性切除和肝移植等综合多种治疗的预后仍未达到满意预期。根据报道,约有30%HCC患者的AFP为阴性,发现其他敏感肿瘤生化标志并研究其分子机制,对于HCC患者尤为重要。大量研究表明,HNRNPA1在人类多种恶性癌症中表达异常且参与肿瘤的进展及预后。HNRNPA1在HBV阳性HCC中的功能作用研究相对较少,本研究结合生物信息学分析希望可以了解HNRNPA1与HBV阳性HCC（HBV-HCC）患者临床预后之间的关系,并探讨HNRNPA1在HBV-HCC中的分子机制,为HCC的早期及时干预和个性化治疗提供新防治思路和的治疗靶点。目的:探讨HNRNPA1表达在HBV阳性肝细胞癌（HCC）中的临床价值,并初步对HNRNPA1在HCC细胞中表达及潜在分子功能进行研究。方法:本研究先利用GEPIA、TCGA、GEO等数据库对HNRNPA1基因在肝细胞癌和正常肝组织中表达进行生物信息学分析,并预测了HNRNPA1表达与肝细胞癌预后的关系。再用逆转录-定量聚合酶链反应法（RT-q PCR）和免疫组织化学法（IHC）验证HCC中HNRNPA1表达,进一步验证HNRNPA1表达与HCC患者预后的关系。再从Linked Omics和c Bio Portal数据库筛选与HNRNPA1共表达基因,DAVID 6.7数据库对HNRNPA1共表达基因进行GO和KEGG分析,用STRING数据库来构建HNRNPA1共表达蛋白-蛋白间的互作网络（PPI网络）,并用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化处理。最后在HBV相关的HCC细胞中,用双荧光素酶报告实验和蛋白质免疫印迹实验分析HNRNPA1分别与mi R-22和EGFR信号通路的关系。结果:通过综合分析了来自GEPIA,GEO和TCGA等数据库的数据,结果发现HNRNPA1表达在HBV阳性HCC样品中显着性增高,该结果通过本中心的RT-q PCR和IHC实验验证得到支持。在GSE14520数据集和151例HBV-HCC患者中的生存分析显示HNRNPA1高表达患者的总体存活率显着降低。在GSE14520数据集中高表达的HNRNPA1对HBV相关HCC患者具有一定的预后诊断应用意义。此外,GO和KEGG分析均证明HNRNPA1共表达基因参与翻译,核糖核蛋白复合物生物合成和组装,核糖体生物发生,RNA加工,RNA剪接等。可视化后的PPI网络显示了HNRNPA1与SNRPD1、SNRPD2、POLR2H和RBMX等共表达并存在直接作用。基因组富集分析（GSEA）显示了HNRNPA1可能通过细胞周期和WNT信号传导途径等影响HCC进展。生物信息学预测到了mi R-22基因可能是HNRNPA1上游调控mi RNA,Linked Omics数据库提示了mi R-22低表达与HNRNPA1高表达在HCC中表达关系为负相关,荧光素酶报告实验结果也提示HNRNPA1基因在HBV-HCC中是mi R-22的下游直接靶基因,在mi R-22过表达的HBV-HCC细胞中HNRNPA1表达降低。蛋白质免疫印迹实验结果表明HNRNPA1可能在HBV相关的HCC中通过EGFR信号通路起到癌基因的作用。结论:HCC组织中的HNRNPA1高表达作为癌基因起作用,与HCC术后复发率较高相关。HNRNPA1的表达上调与HBV相关HCC切除术患者的不良预后相关,可以作为HBV相关HCC患者预后的生物学标志物。SNRPD1,SNRPD2,POLR2H和RBMX等蛋白与HNRNPA1蛋白可能存在直接相互作用,并且表达均与HNRNPA1呈现正相关,可能影响HNRNPA1的功能。在HBV相关的HCC中,HNRNPA1是mi R-22的直接负调节靶标,并且HNRNPA1可以通过EGFR信号传导途径充当癌基因,可以作为HBV阳性HCC患者的潜在治疗靶点。
陈凯华[5]（2019）在《沉默hTERT通过抑制肿瘤干细胞样特性增强鼻咽癌细胞株CNE-2R放射敏感性的机制研究》文中研究指明背景鼻咽癌在中国是发病率仅次于甲状腺癌的头颈部恶性肿瘤,主要高发于中国华南以及东南亚等地区。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段及根治性治疗的重要组成部分。目前,鼻咽癌已取得较理想的生存预后,但临床上仍有超过五分之一的鼻咽癌患者经过规范治疗后出现复发或远处转移。放射抗拒被认为是鼻咽癌治疗后失败的主要原因,但目前放射抗拒的具体机制尚未十分明确。越来越多研究表明,肿瘤出现放射抗拒可能与肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）有关。CSCs是一组极少数的增殖性失控、能够自我更新、多向分化以及具有干细胞特性的肿瘤细胞,它们对放射治疗和其他肿瘤治疗方式存在抗拒性。以往有学者发现,通过分次照射的方法获得的放射抗拒食管癌细胞显示出CSC特性及高水平端粒酶活性。端粒酶是一种核糖核蛋白复合酶,参与了大约90%人类肿瘤的端粒维持机制。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）是维持端粒酶活性的必要催化亚基,表达水平与端粒酶活性相一致。hTERT与端粒酶对于维持CSCs的生物学特性至关重要,也被认为参与调控肿瘤放射敏感性。我们前期研究发现,自主构建的放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R高表达被认为是潜在干性标记物的CD166蛋白。综上所述,我们也有理由推测CNE-2R细胞可能也具CSC样特性并表达高水平的端粒酶活性及hTERT。迄今为止,国内外鲜有关于鼻咽癌放射抗拒细胞的CSC样特性及针对CSC特性改善其放射敏感性的研究报道。此外,鼻咽癌放射抗拒细胞是否具有高水平端粒酶活性以及高表达hTERT呢?若以hTERT作为干预靶点,能否调控CSC样特性从而改善放射抗拒性鼻咽癌的放射敏感性,其中是否还有更深层次的机制呢?综上所述,我们认为有必要进行深入探讨以验证提出的假说。目的本研究首先通过系列实验验证课题组前期构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R具有CSC样特性、高水平端粒酶活性及高表达hTERT;然后利用慢病毒介导的RNA干扰沉默CNE-2R细胞的hTERT表达,利用体外、体内试验观察CNE-2R细胞的CSC样特性及放射敏感性的变化;最后再进一步研究hTERT与CSC样特性之间可能存在的信号调节通路,明确hTERT如何调控CSC特性并最终影响CNE-2R细胞的放射敏感性。本研究的最终结果可能为寻找靶向杀伤CSCs的鼻咽癌放射增敏疗法寻找一些新思路。方法1.采用qPCR检测鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R与亲代放射敏感细胞株CNE-2的干细胞相关基因、β-catenin及hTERT基因的mRNA相对表达量;Western-Blot实验检测CNE-2R与CNE-2细胞的干细胞相关蛋白、β-catenin及hTERT蛋白表达情况;免疫细胞化学检测CNE-2R细胞与CNE-2细胞中的标记滞留细胞比例;PCR-ELISA法检测各组细胞端粒酶活性。流式细胞术检测CNE-2R细胞和CNE-2细胞的CD133表达率;免疫磁珠分选获得CNE-2R-CD133+细胞与CNE-2R-CD133-细胞,采用CCK8法、细胞成球实验以及裸鼠体内成瘤实验证实CNE-2R-CD133+细胞具有CSC特性。2.设计并包装hTERT基因的RNA干扰慢病毒载体,再将hTERT干扰慢病毒转染CNE-2R细胞获得hTERT-shRNA细胞,空载病毒感染CNE-2R细胞获得NC-shRNA细胞,然后通过流式细胞术检测感染率,利用荧光定量PCR及Western-blot实验检测细胞转染后hTERT mRNA及蛋白的表达情况以验证沉默效果,最终构建稳定沉默hTERT的细胞株。3.利用PCR-ELISA检测CNE-2R细胞hTERT沉默前后的端粒酶活性。采用克隆形成实验、CCK-8实验及流式细胞术检测体外放射敏感性;接着构建裸鼠移植瘤模型,观察沉默hTERT对移植瘤放射敏感性的影响;采用Western-blot实验、免疫组织化学检测体外或体内的hTERT蛋白、干细胞相关蛋白及β-catenin蛋白的表达水平;利用TUNEL法检测移植瘤内的细胞凋亡指数。4.利用hTERT过表达慢病毒转染CNE-2R细胞,采用荧光定量PCR及Western-blot实验检测细胞转染后hTERT mRNA及蛋白的表达情况以验证过表达效果。用含有Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂XAV-939和激动剂SKL2001 的培养基培养细胞。Western-blot 实验检测 hTERT、β-catenin及干细胞相关蛋白以了解hTERT与Wnt/β-catenin信号通路的关系以及对干细胞相关蛋白表达的影响。细胞免疫荧光检测hTERT沉默或过表达后β-catenin蛋白在细胞核和细胞质的分布情况。免疫共沉淀实验检测hTERT与β-catenin蛋白是否存在直接相互作用。利用PCR-ELISA法检测各组细胞的端粒酶活性,CCK-8实验检测各组细胞的放射敏感性。结果1.CNE-2R细胞的干细胞相关基因及hTERT基因mRNA相对表达量均高于CNE-2细胞（P<0.05）;同样,CNE-2R细胞的干细胞相关蛋白、β-catenin及hTERT蛋白表达量明显高于CNE-2细胞。CNE-2R细胞与CNE-2细胞的标记滞留细胞比例分别为（3.10±0.63%）vs（0.40±0.35%）,P<0.001。CNE-2R细胞的端粒酶活性（1.618±0.022）显着高于CNE-2细胞（1.344±0.006）,P<0.05。流式细胞术结果显示,CNE-2R细胞与CNE-2细胞的CD133阳性率分别为（2.49±0.56%）vs（0.76±0.25%）,P=0.008;CNE-2R-CD133+细胞的体外增殖能力、体内成瘤能力以及端粒酶活性均显着高于CNE-2R-CD133-细胞及CNE-2R细胞（P<0.05）。2.流式细胞术结果显示,hTERT-shRNA细胞和NC-shRNA细胞的慢病毒感染率均达到90%以上。荧光定量PCR结果显示,hTERT-shRNA细胞的hTERT mRNA 相对表达量（0.164±0.023）明显低于 NC-shRNA 细胞（1.207士0.054）及 CNE-2R 细胞（1.000±0.041）,P<0.001。Western-Blot 实验结果同样显示hTERT-shRNA细胞的hTERT蛋白表达明显下调。3.克隆形成实验结果显示,各照射剂量下hTERT-shRNA细胞的存活分数均低于CNE-2R及NC-shRNA细胞,hTERT-shRNA细胞相对于CNE-2R细胞的放射增敏比为1.23>1,提示hTERT-shRNA细胞对射线更为敏感。CCK-8结果同样提示hTERT-shRNA细胞相对于CNE-2R细胞对射线更加敏感。流式细胞术检测结果显示,OGy射线照射时,hTERT-shRNA细胞的凋亡率稍微增加,CNE-2R细胞、NC-shRNA细胞及hTERT-shRNA细胞的凋亡率分别为（4.82±0.73%）vs（4.85±0.35%）vs（6.25±0.38%）,P=0.023;4 Gy射线照射后,3组细胞的凋亡率分别为（12.10±1.14%）vs（12.71±0.74%）vs（19.03±0.43%）,P<0.001;CNE-2R 细胞、NC-shRNA 细胞照射前后的凋亡率差异均无统计学意义（P>0.05）。PCR-ELISA结果显示,hTERT-shRNA细胞的端粒酶活性为（1.263±0.024）,明显低于NC-shRNA细胞（1.629±0.007）及CNE-2R细胞（1.618±0.022）,P<0.001。裸鼠移植瘤模型结果显示,OGy射线照射时,hTERT-shRNA组移植瘤生长受到轻微抑制;8Gy射线照射后,3组移植瘤生长速度均受到抑制,但hTERT-shRNA组抑制程度更加明显。TUNEL法检测各组移植瘤的体内细胞凋亡指数,结果与体外细胞凋亡率基本一致。Western-blot实验及免疫组化结果均显示,沉默hTERT后,体外及体内的干细胞相关蛋白表达水平均明显下调;免疫组化结果还发现,hTERT-shRNA组移植瘤的β-catenin蛋白主要表达于细胞膜与细胞质,而CNE-2R及NC组移植瘤的部分细胞核内也可见表达。4.Western-blot实验结果显示,hTERT正调节干细胞相关蛋白的表达,但未能明显影响Wnt3a及总β-catenin蛋白的表达;进一步检测发现,沉默hTERT后核内β-catenin蛋白显着减少,过表达hTERT后核β-catenin蛋白显着增多;抑制或激活Wnt/β-catenin信号通路后可正调节hTERT及干细胞相关蛋白的表达。免疫共沉淀可检测到CNE-2R细胞中存在着β-catenin/hTERT蛋白复合物,表明β-catenin与hTERT蛋白存在直接相互作用。PCR-ELISA结果显示,沉默hTERT或抑制Wnt/β-catenin信号通路均能降低CNE-2R细胞的端粒酶活性;而当抑制Wnt/β-catenin信号通路后,可通过过表达hTERT逆转端粒酶活性。CCK8实验结果同样显示,沉默hTERT或抑制Wnt/β-catenin信号通路均能增加CNE-2R细胞的放射敏感性;而当抑制Wnt/β-catenin信号通路后,可通过过表达hTERT逆转细胞的放射抗拒性。结论本研究首先证实了课题组前期通过分割照射构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R表现出CSC样特性并表达高水平的端粒酶活性以及hTERT。然后通过慢病毒介导的RNA干扰技术成功构建了稳定沉默hTERT的CNE-2R细胞株,结果发现沉默hTERT后可在体外及体内增强CNE-2R细胞的放射敏感性,同时下调CNE-2R细胞的端粒酶活性并抑制其CSC样特性。我们进一步研究发现,在CNE-2R细胞中存在hTERT与Wnt/β-catenin信号通路的正反馈环并调控CNE-2R细胞的端粒酶活性及CSC样特性,从而对CNE-2R细胞的放射敏感性起到调节作用。因此,干扰hTERT表达和阻断Wnt/β-catenin信号转导可能是一种靶向杀伤具有CSC样特性的放射抗拒性鼻咽癌细胞的有前景策略,这将为研究放射抗拒鼻咽癌的放疗增敏疗法提供了新的思路。
杨慧[6]（2016）在《靶向泛素连接酶STUB1对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制研究》文中指出第一部分泛素连接STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌预后的关系目的：研究泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT胞浆或胞核蛋白在不同宫颈组织中的表达情况及其与宫颈癌临床病理特征及预后的关系,分别探讨其在宫颈癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组织化学SP法在组织芯片中分别检测STUB1、hTERT蛋白在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN）及宫颈癌组织中的表达差异；采用卡方检验分析hTERT蛋白不同亚细胞表达情况与宫颈癌患者不同临床病理特征间的关系；采用Kaplan-Meier法分别分析STUB1、hTERT蛋白表达对宫颈癌患者总生存率的影响；采用COX回归法分析影响宫颈癌预后的独立因素；采用Spearman法分析宫颈癌组织中STUB1与hTERT表达的相关性。结果：宫颈癌组织中STUB1蛋白表达显着低于正常宫颈和CIN组织（P<0.05）,而hTERT蛋白显着高表达（P<0.05）。在宫颈癌组织中,STUB1蛋白的低表达率在不同年龄、不同人流情况、不同绝经情况、不同肿瘤大小、不同组织类别、不同FIGO分期、不同淋巴结转移情况、不同阴道及宫旁浸润情况、不同放疗情况和不同局部复发情况的宫颈癌患者中无显着统计学差异（P>0.05）；而与肿瘤分化程度密切相关,即分化程度低的宫颈癌患者,STUB1蛋白的表达越低（P<0.05）。hTERT总蛋白的高表达率与肿瘤的FIGO分期、分化程度、局部复发密切相关,而与其它临床病理特征无相关性（P>0.05）：即FIGO分期高、分化程度低、局部复发的宫颈癌患者,hTERT总蛋白的表达越高（P<0.05）。STUB1蛋白或hTERT总蛋白高表达组和低表达组宫颈癌患者的5年生存率分别为（STUB1 51.8% vs 48.2%, P=0.016; hTERT 70.00% vs 63.50%, P=0.128）;除此之外,hTERT蛋白胞核而不是其胞浆高表达组的宫颈癌患者5年生存率显着高于低表达（胞浆68.6% s 71.7%,P=-0.070；胞核61.8% vs 67.2%,P=0.016）,但二者皆与宫颈癌其他临床病理因素均无相关性。多因素分析显示,hTERT蛋白总及胞核表达水平不是宫颈癌预后的独立影响因素；然而,STUB1及hTERT蛋白胞浆表达水平可作为宫颈癌预后的独立因素。Spearman相关分析显示,STUB1蛋白表达水平与hTERT胞浆或胞核蛋白表达情况皆无明显相关性。结论：STUB1及hTERT表达情况皆与宫颈癌发生过程密切相关。STUB1蛋白低表达水平与宫颈癌预后差密切相关；然而,hTERT总蛋白及胞核表达水平尚不能作为宫颈癌患者预后的预测指标,仅其蛋白胞浆表达水平有望成为宫颈癌患者预后判断的指标。因此,STUB1及hTERT蛋白胞浆表达情况有望成为预测宫颈癌预后的指标,并有可能成为宫颈癌治疗的新靶点。第二部分 泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌放射敏感性的关系目的：研究泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT胞浆或胞核蛋白在宫颈癌放射敏感/抗拒株模型中的表达情况,分析其与宫颈癌细胞内在放射敏感性的关系。方法：采取6MV的X射线在室温下分别对指数生长期的C33A和Hela细胞按照每周一次600cGy的剂量进行辐射,分别照射10次和12次；采用克隆形成实验对照射后达到稳定传代的细胞株进行放射生物学参数测定,将照射后验证具有放射抗拒性的细胞株分别命名为C33AR和HelaR;采用Western blotting方法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中STUB1及hTERT蛋白表达水平；采用TRAP和Real-time PCR法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中端粒酶活性及端粒长度的变化；采用流式细胞仪分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中细胞周期及细胞凋亡的变化；采用transwell法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中细胞侵袭的变化；采用免疫荧光技术分别检测C33A/C33AR细胞照射前后Y H2AX的变化；采用免疫共沉淀法（Co-IP）检测C33A/C33AR中hTERT总蛋白泛素化水平的变化。结果：克隆形成结果显示：C33A细胞株的D0=1.34±0.028,SF2=0.516±0.058;C33AR细胞株的D0=1.89±0.008, SF2=0.655±0.041;Hela细胞株的D0=2.59±0.007, SF2=0.625±0.041; HelaR细胞株的D0=2.76±0.012, SF2=0.751±0.041;表明经过6MV X线辐射后,C33AR及HelaR分别较C33A及Hela细胞的放射抗拒性显着增加（P<0.05）。Western blotting结果显示,两株放射抗拒株hTERT总蛋白表达水平较其亲本株显着升高（P<0.05）,而STUB1蛋白表达水平较其亲本株显着降低。TRAP和Real-time PCR结果显示,放射抗拒株端粒酶活性和端粒长度分别较其亲本株显着提高（P<0.05）。细胞周期显示放射抗拒株中放射诱导的G2/M期阻滞持续时间显着较其亲本长（P<0.05）。细胞凋亡检测显示,放射抗拒株自发性与放射诱导的凋亡水平皆较其亲本株显着减少（P<0.05）。Transwell显示,C33AR的细胞侵袭力较其亲本株显着增加（P＞0.05）。免疫荧光结果表明C33AR中自发性和辐射诱导的γH2AX皆较其亲本显着减少（P<0.05）。免疫共沉淀结果显示C33AR细胞中,hTERT总蛋白泛素化水平较其亲本降低；Western blotting检测C33A/C33AR中hTERT蛋白在胞浆或胞核的表达水平,结果显示放抗株中hTERT蛋白胞浆表达明显较高,hTERT蛋白胞核表达明显较低。结论：成功建立宫颈癌放射抗拒细胞株C33AR及HelaR,宫颈癌细胞内在放射敏感性降低可能与STUB1表达减少导致的hTERT蛋白胞浆降解减少,从而引起的端粒酶活性增加、端粒延长、射线诱导的G2/M期阻滞时间延长、自发性凋亡及射线诱导的凋亡率减少、自发性和辐射诱导的γH2AX减少有关。因此,深入研究STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制,明确hTERT蛋白胞浆降解增多对放射敏感性的效应,有助于为研究潜在放射增敏靶点提供新的方向。第三部分过表达泛素连接STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制目的：本课题组前期研究发现hTERT蛋白胞浆表达水平可能与宫颈癌放射敏感性相关,且泛素连接酶STUB1在放抗株中低表达,与hTERT总蛋白及胞浆表达水平负相关,可调控放射敏感性。然而,STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制尚不明。因此,本课题主要目的是研究STUB1作为人宫颈癌细胞放射增敏靶点的潜在机制。方法：采用Lipo2000脂质体转染联合嘌呤霉素筛选法构建STUB1过表达的稳定转染细胞株C33AR-STUB1、HelaR-STUB1及其对应的空白对照稳定细胞株C33AR-NC、HelaR-NC;采用Western blotting法验证并检测蛋白表达水平变化；采用克隆形成实验检测STUB1过表达后细胞放射敏感性的变化;采用TRAP和eal-time PCR法分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中端粒酶活性和端粒长度的变化；采用流式细胞仪法分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中照射前后细胞周期和凋亡的变化：采用免疫荧光分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1细胞照射前后DNA损伤灶点变化；采用免疫共沉淀法（Co-IP）检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中hTERT蛋白在胞浆中的泛素化修饰的变化。结果：成功构建过表达STUB1的C33AR-STUB1和HelaR-STUB1细胞株及其空白对照C33AR-NC和HelaR-NC.克隆形成结果显：C33AR-NC细胞株的D0=2.44, SF2=0.603;C33AR-STUB1细胞株的D0=1.70, SF2=0.441; HelaR-NC细胞株的D0=2.44, SF2=0.751; HelaR-STUB1细胞株的D0=2.33,SF2=0.533;表明过表达STUB1的细胞C33AR-STUB1和HelaR-STUB1获得了显着的放射增敏效应。TRAP和Real-time PCR结果显示,C33AR-STUB1细胞端粒酶活性和端粒长度皆较C33AR-NC细胞显着降低（P<0.05）；Western blotting结果显示,过表达STUB1后,细胞中hTERT蛋白总及胞浆表达水平降低,但对胞核表达无影响,PI3K、AKT及p-AKT表达降低,端粒结合蛋白TRF1及RAP1表达增加,TRF2、PTOP1、POT1及TIN2表达减少；Co-IP结果显示hTERT蛋白胞浆的泛素化修饰增加。细胞周期检测显示STUB1过表达后,细胞G2/M期分布增加；联合射线后细胞周期结果显示STUB1过表达显着缩短射线诱导的G2/M期阻滞持续时间；Western blotting结果显示过表达STUB1,显着降低ATM、 ATR、Chk1、Chk2、p-Chk1及p-Chk2表达水平,而p-ATM、p-ATR及CDC25C表达水平增加。细胞凋亡检测结果显示STUB1过表达后,细胞自发性和射线诱导的早期凋亡皆增加；Western blotting结果显示过表达STUB1,促凋亡蛋白Bax与抑制凋亡蛋白Bcl-2表达的比例提高。免疫荧光检测提示STUB1过表达,显着增加自发性及射线诱导的DNA损伤灶。结论：过表达泛素连接酶STUB1可导致放射增敏,其调控细胞放射敏感性的可能机制如下：通过促进hTERT蛋白胞浆泛素化修饰使hTERT蛋白胞浆储备减少,并通过下调P13K及AKT,使PI3K/AKT介导的hTERT磷酸化激活减少,从而导致进入胞核的有活性的hTERT减少,从而降低端粒酶活性,进而端粒缩短,下调大部分端粒相关蛋白,使端粒相对欠稳定,从而使ATM/ATR-Chkl/Chk2-CDC25C介导的细胞周期G2/M期阻滞缩短、Bax/Bcl2比例提高而致细胞凋亡增加,进而增加细胞DNA损伤灶,最终导致放射增敏。因此,STUB1有望成为放射增敏的靶点,其通过影响hTERT蛋白胞浆表达水平从而调控放射敏感性的现象,为研究端粒稳态相关因素调控放射敏感性的机制提供了可供参考的思路。
李芳[7]（2016）在《端粒酶及VEGF-A与宫颈癌浸润的分子机制研究》文中研究说明子宫颈癌（Cervical cancer）是女性生殖系统最常见恶性肿瘤之一,全世界每年新发病例约为50万,80%以上在发展中国家,已成为发展中国家女性的主要致死性疾病。临床上尚无子宫颈癌高效特异、预后良好的治疗手段。特别是子宫颈癌组织浸润、远处转移等问题严重阻碍了患者的手术治疗,也是后期患者肿瘤复发、预后差的主要原因,严重地降低了患者的存活率。因此,深入研究子宫颈癌浸润、转移的高危因素,探索宫颈癌细胞侵润的分子机制,将有助于子宫颈癌特效治疗手段的研发。现有研究已发现,部分生物学因素与子宫颈癌的发生发展有关。HPV感染与宫颈癌的发病率存在很强的关联性,但不是所有病毒感染人群都会进展为宫颈癌,提示其他因素也能影响宫颈病变的发展进程。人端粒酶是现阶段临床实验室检测肿瘤常用的肿瘤标志物;其由三个部分组成,分别是人端粒酶逆转录酶（h TERT）、人端粒酶RNA组分（h TERC）和端粒酶协同蛋白（h Tpl）;已经发现端粒酶h TERT m RNA的激活与宫颈癌病变的严重程度有明显相关性。同时,HPV持续感染引起人体组织的慢性炎症,分泌种类繁多、作用各异的炎症因子,包括但不限于COX-2、PGE2、IL-1、MMPs、VEGF,这些炎症因子会促使正常细胞的变性,最终可能导致肿瘤的发生。但这些生物学因素与宫颈癌浸润、转移是否有关尚未明确。基于此,本研究首先从子宫颈癌关系密切的临床高危因素出发,使用相关性分析探索与细胞浸润密切相关的生物学因素,包括HPV病毒、端粒酶以及炎症因子等,试图从大体上明确影响宫颈癌浸润的高危因素;然后,进一步使用分子生物学手段确定这些相关因素与宫颈癌浸润之间的相互作用关系;最终明确导致宫颈癌浸润、转移的生物学因素,加深对宫颈癌发生发展机制的理解,为子宫颈癌特效治疗手段的研发奠定基础。具体研究分为下列三个部分:第一部分子宫颈癌浸润与HPV感染、端粒酶、炎症因子等相关高风险因素的相关性分析目的:探索与子宫颈癌浸润密切相关的生物学因素。方法:收集正常宫颈组织（NCE）20例,宫颈上皮内瘤样病变II以上（CIN II或III）20例及宫颈鳞癌组织（SCC）20例。PCR法检测上述各种组织中HPV的感染情况;TRAP-PCR法检测组织中端粒酶活性水平;ELISA法检测宫颈鳞癌和正常宫颈组织中炎症因子（VEGF-A、IL-6、MMP-9、TNF-α、BCL-2及IL-1β）的表达情况。实验结果及其他临床高危因素分别与宫颈癌发展浸润程度进行相关性分析。结果:CIN和SCC组织均为高危HPV（HPV-16和18）阳性,部分正常组织也为高危HPV阳性。端粒酶活性及h TERT m RNA在宫颈癌、CINⅡ以上病变中明显异常扩增,但是在正常宫颈组织中几乎不出现异常扩增;且h TERT m RNA异常表达水平与宫颈病变的严重程度呈显着正相关（p<0.0001）。在六个代表性的炎症因子中,VEGF-A及其m RNA表达水平与宫颈病变程度正相关（p<0.001）。而且VEGF-A与端粒酶水平见存在正相关。结论:癌症组织端粒酶及炎症因子VEGF-A分别与宫颈癌浸润程度高度正相关。第二部分VEGF对子宫颈癌Hela细胞株的细胞动力学的影响目的:研究VEGF-A对子宫颈癌Hela细胞株的细胞动力学的影响。方法:选取体外培养宫颈癌Hela细胞株,依据RNAi原理,获得针对VEGF-A基因的si RNA,并转染体外培养的Hela细胞。观察其能否特异、高效的抑制细胞中VEGF-A基因及蛋白的表达,及其对Hela细胞增殖能力的影响。结果:利用si RNA技术成功的抑制了Hela细胞株中VEGF-A基因及蛋白的表达,同时Hela细胞在生长、增殖能力有明显的抑制。结论:VEGF-A参与了宫颈癌Hela细胞株的生长增殖。第三部分端粒酶对宫颈癌hela细胞VEGF-A分泌的影响及其机制研究目的:本实验通过体外实验研究端粒酶h TERT与VEGF在人乳头状瘤病毒阳性宫颈癌细胞的关联性,了解宫颈癌侵润发展的潜在分子机制。方法:分别采用q RT-PCR、ELISA和TRAP-ELISA检测多种宫颈癌细胞系端粒酶和端粒酶h TERT（端粒酶的限速基因）,VEGF m RNA和其蛋白的表达水平。为了探寻端粒酶对宫颈癌细胞VEGF-A分泌的作用,分别构建h TERT sh RNA质粒和过表达质粒用于He La细胞端粒酶的抑制和过表达实验。同时研究HPV E6和E7在端粒酶影响VEGF表达中的作用。结果:Hela细胞的端粒酶和VEGF表达水平都很高,且两者间存在正相关,可用于后续实验。抑制h TERT表达下调Hela细胞VEGF的表达,而h TERT的过表达则上调HPV-18阳性细胞VEGF的表达。此外,HPV E7癌基因蛋白在端粒酶上调VEGF过程是一个必要条件。结论:端粒酶不直接影响宫颈癌细胞的浸润和转移;但它可通过HPV E7蛋白影响VEGF的表达,间接促进宫颈癌细胞浸润。本研究探索了宫颈癌浸润与转移的发生机制,进一步明确了宫颈癌的发病机制,同时为宫颈癌的干预治疗奠定了理论基础。
慈新宇[8]（2016）在《端粒与端粒酶在硼替佐米和ARID1A抑制肿瘤进展中的功能学研究》文中研究指明研究背景端粒是位于真核染色体末端,由短的DNA重复序列TTAGGG和相关蛋白质组成的复合物。其主要作用是保护染色体,既可防止染色体被核酸酶降解,同时又能阻止相邻染色体间的融合。另外,端粒的长度反应细胞的可分裂次数,因此,被称为细胞的“生命钟”。正常情况下,端粒DNA会随着细胞的每次分裂而缩短50-200个碱基对,当其缩短到一定长度时,染色体则无法完成正常复制,细胞的有丝分裂也会随之停滞,转而进入衰老阶段。端粒酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶,由催化组分端粒酶逆转录酶（hTERT）、端粒酶模板RNA （hTER）以及端粒酶相关蛋白质组成,其主要作用是延长端粒的长度。在正常的成熟体细胞中,端粒酶几乎没有活性,但是,在病理状态下,如肿瘤细胞中,其活性异常增高,使端粒长度得以延长,从而保证了肿瘤细胞的无限分裂增殖。由此可见,端粒酶活性的异常升高所导致的端粒长度的维持,与肿瘤的发生发展密切相关。硼替佐米是已经应用于临床的用来治疗多发性骨髓瘤的一种药物,作为26S蛋白酶体的抑制剂,其已知的主要作用机制是通过抑制NF-κB信号途径,进而激活caspase3,同时抑制抗凋亡基因bcl-2的表达,来诱导肿瘤细胞的凋亡。虽然硼替佐米在多发性骨髓瘤的治疗中已经取得了良好疗效,但仍有部分耐药病例出现,因此,我们亟需寻找硼替佐米新型的作用机制以及靶点分子,以使其获得更加合理的临床应用。肿瘤抑制因子aridla是染色质重构复合体SWI/SNF的重要组成成分,可结合于DNA的特定区域,此复合体中的另一成员BRG1或BRM可水解ATP产生能量,利用这些能量,SWI/SNF重构复合体可使染色质中核小体的组蛋白核心发生移位甚至脱落,从而转移核小体的位置,改变染色质的构象,使下游基因的转录起始部位暴露或隐藏,由此来调控下游基因的转录。目前,众多的基因测序结果显示,在卵巢癌、胃癌、肾癌、胰腺癌等绝大多数肿瘤中都存在ARID1A基因的突变或缺失,这提示aridla可能作为一种抑癌基因来行使作用。但是,具体的抑癌机制目前研究尚少。研究目的1.探讨硼替佐米诱导肿瘤细胞凋亡的过程中,对端粒酶活性和端粒功能的影响,以发掘其新的作用机制,并对肿瘤细胞产生硼替佐米耐药过程中hTERT所发挥作用进行研究。2.探讨胃癌细胞中aridla对hTERT表达的调控及其相关机制,为aridla的抑癌作用提供证据支持。研究方法和结果1.硼替佐米降低端粒酶活性和端粒稳定性诱导肿瘤细胞凋亡（1）硼替佐米抑制肿瘤细胞端粒酶活性,同时降低其端粒稳定性。硼替佐米处理白血病细胞HEL和胃癌细胞BGC-823前后,分别用PCR-ELISA试剂盒检测端粒酶活性,qRT-PCR检测hTERT、hTER及端粒结合蛋白TRF1、TRF2、 POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表达,Western Blotting检测TRF1、TRF2、POT1的蛋白表达,流式-荧光原位杂交（Flow-FISH）和qPCR检测端粒长度,免疫-荧光原位杂交（Immuno-FISH）检测端粒DNA的损伤。结果表明,硼替佐米可下调hTERT、hTER的mRNA表达水平,降低端粒酶活性,使端粒结合蛋白的表达广泛失调,缩短端粒长度并导致端粒功能异常。（2）hTERT高表达可减弱由硼替佐米引起的端粒功能异常。硼替佐米处理稳定高表达hTERT基因的细胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT后,Flow-FISH和qPCR检测细胞端粒长度,Immuno-FISH检测端粒DNA损伤,qRT-PCR检测端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表达,Western Blotting检测TRF1、TRF2、POT1的蛋白表达。结果表明,硼替佐米处理后HEL-hTERT和BGC-823-hTERT细胞中端粒长度无明显改变,端粒DNA损伤和端粒结合蛋白的表达失调程度明显弱于相同浓度硼替佐米处理的HEL-control和BGC-823-control细胞。（3）hTERT高表达可抑制由硼替佐米所诱导的肿瘤细胞凋亡。硼替佐米处理稳定高表达hTERT基因的细胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT与对照细胞株HEL-control、BGC-823-control后,台盼蓝染色计数确定细胞的存活率,Annexin-V染色后流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果表明,硼替佐米处理后,HEL-hTERT和BGC-823-hTERT细胞的存活率明显高于HEL-control和BGC-823-control细胞,而HEL-hTERT和BGC-823-hTERT细胞的凋亡比例明显低于HEL-control和BGC-823-control细胞。（4）hTERT通过减弱DNA损伤和上调bcl-2表达抑制肿瘤细胞凋亡。硼替佐米处理稳定高表达hTERT基因的细胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT与对照细胞株HEL-control、BGC-823-control后,免疫荧光检测DNA损伤,即53BP1的凝集,Western Blotting检测bcl-2的表达。结果表明,HEL-hTERT与BGC-823-hTERT细胞中的DNA损伤明显少于HEL-control、BGC-823-control细胞,HEL-hTERT细胞内bcl-2表达明显高于HEL-control细胞,且在硼替佐米处理后HEL-hTERT细胞内仍存留较多量的bcl-2蛋白。2.染色质重构分子ARID1A负性调控hTERT抑制胃癌进展（1）arid1a负性调控hTERT表达。胃癌细胞系AGS和SGC中转染arid1a高表达或对照质粒PcDNA 6.0后,采用qRT-PCR和western blotting分别检测hTERT的mRNA及蛋白表达水平。结果表明,aridla高表达后,hTERT的mRNA及蛋白表达均下降。（2） arid1a抑制hTERT启动子活性。AGS和SGC细胞中转染aridla高表达或对照质粒PcDNA 6.0后,再转染hTERT启动子报告基因质粒,然后采用双荧光素酶报告基因系统检测hTERT启动子活性。结果表明,arid1a高表达后,hTERT启动子活性明显降低。（3）arid1a抑制c-myc在hTERT启动子区的结合,但不改变c-myc的表达量。AGS和SGC细胞中转染arid1a高表达或对照质粒PcDNA 6.0后,qRT-PCR检测c-myc的mRNA表达,结果显示arid1a未影响c-myc的mRNA水平。在转染了arid1a高表达或对照质粒PcDNA6.0的AGS和SGC细胞中,转染c-myc结合位点突变的hTERT启动子质粒,用双荧光素酶报告基因系统检测突变的hTERT启动子活性,结果显示,其活性未受arid1a高表达的影响。研究结论1.硼替佐米可以通过降低HEL和BGC-823细胞的端粒酶活性和端粒稳定性诱导细胞凋亡,而hTERT可减弱硼替佐米对端粒功能的影响,介导肿瘤细胞对硼替佐米的耐药。2. Aridla通过阻碍c-myc在hTERT启动子区的结合来抑制hTERT的表达,从而抑制胃癌进展。
刘丽[9]（2016）在《人端粒酶逆转录酶hTERT启动子在恶性肿瘤发生和诊断中的作用研究》文中研究说明端粒酶（telomerase）是能以自身RNA为模板合成端粒DNA的逆转录酶,其主要作用是维持染色体末端端粒（telomere）的长度以保持染色体的稳定性。人端粒酶主要由两个部分组成,人端粒酶RNA模板（human telomerase RNA, hTR）和人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）。研究证实,端粒酶与恶性肿瘤的发生发展关系密切,而在这个过程中,hTERT作为端粒酶的限速酶发挥了关键作用,但是其表达调控机制尚不完全明确。本论文主要从以下三个方面研究hTERT启动子在恶性肿瘤发生发展过程中的调控机制及其在肿瘤诊断中的潜在应用：（1）hTERT启动子DNA甲基化,（2）hTERT启动子突变,（3）hTERT的转录调控机制。第一部分hTERT启动子DNA甲基化在胃肠道恶性肿瘤诊断中的研究背景胃肠道恶性肿瘤（gastrointestinal cancer,GIC）,主要包括胃癌（gastric cancer, GC）和结直肠癌（colorectal cancer,CRC）,是最常见的恶性肿瘤之一。目前内镜活检是诊断GIC的主要手段,但是内镜检查是有创性检查且价格昂贵。基于粪便的无创性检查方法是更易于被接受的GIC筛查和术后复发监测的手段。越来越多的研究者致力于研究粪便中肿瘤标记物在GIC诊断中的应用。与易于降解的mRNA和蛋白相比,DNA甲基化更为稳定,是更为可靠的疾病检测标记物。DNA甲基化（DNA methylation）是人类基因表观遗传学（epigenetics）的主要修饰方式之一,以往的很多研究揭示了多种基因如CDH1、P16、hMLH1、MGMT、 RASSF2等异常甲基化与GC和CRC的关系。同时,也有研究报道在CRC患者血清和粪便标本中发现了多种基因启动子区域DNA的异常甲基化,例如SEPT9、 RASSF2、SFRP2等,都有可能做为CRC患者无创性诊断的分子标记物。多项研究表明,在包括GIC在内的90%以上的人类恶性肿瘤细胞中,存在hTERT mRNA的过表达和端粒酶的异常活化。作为端粒酶的催化亚基,hTERT的表达水平在很大程度上决定了端粒酶的活性。hTERT启动子富含CpG二核苷酸,即存在CpG岛（CpG islands）。研究发现,hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞之间呈现出不同的甲基化状态,这使得hTERT启动子DNA甲基化可能作为一种潜在的分子标记物用于疾病检测。已有研究报道,GC和CRC肿瘤组织中的hTERT启动子DNA甲基化水平高于癌旁正常组织,且甲基化水平与hTERT mRNA的表达水平密切相关。但尚未有研究报道粪便中hTERT启动子DNA甲基化的情况。目的阐明GIC患者肿瘤组织和粪便中hTERT启动子DNA甲基化的水平,探讨粪便中hTERT启动子DNA甲基化水平是否可以作为GIC诊断和监测的指标。方法本研究收集了34例GC和CRC患者的肿瘤组织和癌旁正常组织标本,69例GC和CRC患者的粪便标本,以及62例非肿瘤患者的粪便标本。肿瘤患者的粪便标本均在接受治疗前获取,并即刻于-80℃C冻存。分别提取组织和粪便中的基因组DNA,然后进行重亚硫酸盐转化（bisulfite conversion）并纯化,采用焦磷酸测序（pyrosequencing）技术定量检测组织和粪便中hTERT启动子2个CpG位点的甲基化水平。统计分析GC和CRC患者粪便中CpG位点甲基化水平与患者年龄、性别、肿瘤分化、肿瘤大小、临床分期、肿瘤侵袭性等临床病理资料之间的相关性,分析该方法对GC和CRC诊断的敏感性和特异性。结果GIC肿瘤组织和癌旁正常组织中hTERT启动子的2个被检测CpG位点Site1和Site2的甲基化水平均具有显着性差异（P=0.008和P=0.004）。GIC患者粪便中Sitel和Site2的甲基化水平显着高于非肿瘤患者（P<0.05）。将Site1和Site2的甲基化水平取平均值Avg,受试者工作特征曲线（ROC）分析显示,对所有的GIC患者,Site1、Site2、Avg的曲线下面积（AUC）依次为0.769、0.777、0.799。GC和CRC患者粪便中Site1和Site2的甲基化水平没有显着性差异,且甲基化水平与年龄、性别无关。在CRC中,Duke C/D期患者Sitel位点的甲基化水平显着高于Duke A/B期患者（P<0.05）。而在GC中,组织学低分化和临床晚期肿瘤患者Site2位点的甲基化水平更高（P<0.05）。GC患者粪便潜血试验（OBT）的AUC为0.537,CRC患者粪便OBT的AUC为0.834。将粪便hTERT启动子的甲基化水平与OBT综合起来进行多参数回归ROC分析,GC和CRC的AUC可分别达到0.806和0.920。结论在所检测的2个hTERT启动子区域的CpG位点Site1和Site2中,GIC肿瘤组织的甲基化水平明显高于癌旁正常组织,GIC患者粪便中hTERT启动子DNA甲基化水平明显高于非肿瘤患者。GIC患者粪便hTERT启动子特定位点的甲基化水平与肿瘤的分化程度、临床分期、以及侵袭性有关。粪便hTERT启动子的甲基化水平与OBT综合分析可以提高CRC患者诊断的敏感性和特异性。第二部分hTERT启动子突变在肾细胞癌中的研究背景肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,RCC包括不同类型的肿瘤,主要有透明细胞癌（clear cell RCC,ccRCC）,肾乳头状癌（papillary RCC,pRCC）和肾嫌色细胞癌（chromophobe RCC,chRCC）。在RCC中,端粒酶活性异常升高,但是端粒酶活化的机制尚不明确。近来研究者在黑色素瘤中发现了hTERT启动子有2个高频突变：C228T和C250T,突变产成了新的ETS1结合序列,从而显着提高了hTERT启动子的转录活性以及hTERT mRNA的表达水平,并将端粒酶活性提高了2-4倍。因此,这种突变可能是造成hTERT表达和端粒酶活性在肿瘤中异常升高的原因之一。另外,hTERT启动子突变也和患者的临床病理特征或疾病的预后有关。研究显示,在黑色素瘤中,hTERT启动子突变与患者年龄、肿瘤的厚度、是否形成溃疡以及患者的预后等有关。在泌尿系统恶性肿瘤中,hTERT启动子突变在膀胱癌组织中的发生率较高,并且被认为是膀胱癌中目前已知的发生频率最高的基因改变。关于hTERT启动子突变是否存在于RCC中,现有的研究还不能明确这一点,并且也不清楚突变是否与患者的临床病理特征有关。目的分析RCC患者肿瘤组织中hTERT启动子突变的情况,明确以上突变与患者临床病理特征的关系,为进一步明确端粒酶异常活化的机制提供理论依据。方法本研究收集了109例RCC患者的肿瘤组织和癌旁正常组织,提取组织的DNA,然后采用Sanger测序法,分别检测hTERT启动子上C228T突变、C250T突变以及VHL基因改变的发生情况。提取肿瘤组织的RNA,采用定量Real-timePCR技术检测hTERT mRNA的表达水平。统计分析肿瘤组织中hTERT启动子突变的发生与患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、肿瘤侵袭性以及VHL基因改变之间的相关性。结果在被检测的109例RCC肿瘤组织中,有10例存在hTERT启动子突变,其中9例是C228T突变,1例是C250T突变。在hTERT启动子突变阳性和突变阴性的肿瘤组织中,hTERT mRNA的表达水平明显不同,突变阳性的ccRCC中hTERT mRNA的表达水平明显升高。在96例ccRCC中,9例突变阳性的患者中处于临床Ⅲ/ⅣV期的有5例（5/9,55.6%）,87例突变阴性的患者中处于临床Ⅲ/Ⅳ期的有9例（9/87,10.3%）,呈现显着统计学差异（P=0.003）。hTERT启动子突变的发生率在患者年龄、性别、肿瘤大小等方面没有明显的组间差异。在9例检测出hTERT启动子突变的ccRCC患者中,有2例发生了远处转移,3例发生了肾被膜侵袭,而在未检测出突变的87例ccRCC患者中,4例发生了远处转移,3例发生了肾被膜侵袭。远处转移和肾被膜侵袭的发生率在突变阳性组和突变阴性组分别是5/9（55.6%）和7/87（8.0%）（P=0.001）。在所检测的77例ccRCC肿瘤组织VHL基因位点中,32例（41.6%）存在VHL位点的一个或多个改变,而在这些改变中,4例发生在hTERT启动子突变阳性的患者中,28例发生在hTERT启动子突变阴性的患者中,其差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论RCC肿瘤组织中存在着hTERT启动子突变。ccRCC中瘤组织中hTERT启动子突变与hTERT mRNA表达水平呈正相关,突变阳性组和突变阴性组在肿瘤的临床分期以及肿瘤的侵袭性方面存在明显差异,但是在患者的年龄、性别、肿瘤大小等方面无明显差异。ccRCC肿瘤组织中hTERT启动子突变阳性组和突变阴性组在VHL基因改变方面无统计学差异。第三部分精浆刺激宫颈癌端粒酶活化过程中hTERT的转录调控研究背景宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,宫颈癌的发生与多种因素有关,如人乳头瘤病毒（HPV）感染、频繁的性生活等,但其确切原因和发生机制尚不明确。研究证实,宫颈癌中hTERT的表达和端粒酶活性都异常升高。在宫颈组织由宫颈上皮内瘤变（CIN）向宫颈癌恶性转化的过程中端粒酶激活是非常重要的步骤,但是端粒酶活化的机制尚不明确。研究表明,hTERT的转录激活是端粒酶活化的关键步骤,但是目前hTERT的转录调控机制仍然不明确。hTERT转录活性的调控有很多因子的参与,包括转录活化因子和抑制因子。c-MYC、Sp1、雌激素等被证实是hTERT转录活化因子,能上调hTERT的表达；P53、转录激活蛋白1（AP-1）、Mad等被认为是抑制因子,抑制hTERT启动子的活性。精浆是精液的主要组成成分之一,含有前列腺素、雌激素、孕激素、血管生长因子、细胞因子、蛋白酶、蛋白激酶等多种物质。以往研究发现,精浆可以促进宫颈癌的发生和发展。精浆或前列腺素E2（PGE2）处理宫颈癌细胞系后,可以诱导PGE2受体EP1、EP4、表皮生长因子受体（EGFR）等表达上调,进而刺激肿瘤的发生发展。另有研究显示,精浆中的物质还可以刺激子宫内膜上皮细胞中白介素1-β（IL1-β）.白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、环氧化酶-2（COX-2）等多种细胞因子或酶的表达,进而影响子宫内膜上皮细胞的功能。目的探讨在精浆刺激宫颈细胞恶变的过程中,hTERT的作用及hTERT的转录调控机制。方法（1）hTERT mRNA表达水平检测：三株宫颈癌细胞系HeLa Caski、SiHa,以及从人正常宫颈组织中分离出原代的宫颈上皮细胞,培养至对数生长期后经血清饥饿处理48h,实验组分别加入不同量的精浆,对照组均不加入精浆,24h后收获细胞,提取细胞总RNA后采用定量Real-time PCR技术检测hTERT mRNA的表达水平。（2）端粒酶活性检测：经培养和处理的三株细胞系和宫颈上皮细胞（方法同上）,收获细胞后采用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒定量检测端粒酶活性。（3）Western Blotting:检测COX-2、Spl的蛋白表达水平。（4）hTERT启动子活性测定：采用hTERT启动子活性报告质粒和Progema荧光素酶活性双报告系统进行检测。（5）siRNA技术：采用COX-2特异性siRNA,抑制HeLa细胞中COX-2的表达。（6）染色质免疫共沉淀（ChIP）技术：实验组HeLa细胞（加入PGE2或精浆）和对照组HeLa细胞（不加入PGE2或精浆）,甲醛溶液使组蛋白或转录因子与DNA交联。收获细胞后将DNA超声碎裂成200-1 000bp的片段。用Spl抗体或乙酰化的组蛋白H3、H4抗体沉淀相应的DNA-蛋白质复合物,用蛋白A/G琼脂糖收集,然后洗脱、去交联。最后获取DNA,进行定量PCR扩增。（7）动物实验：雌性BALB/c裸鼠12只（出生6周）。血清饥饿的HeLa细胞,实验组加入精浆,对照组不加入精浆。悬浮后注射入裸鼠腋窝部皮下,3周后取出肿瘤组织分析。结果（1）在三株细胞系HeLa、Caski、SiHa中,实验组（精浆处理组）的hTERT mRNA的表达水平均明显高于对照组（P<0.01）,实验组HeLa和Caski中端粒酶活性也明显升高（P<0.05和P<0.01）。而在原代培养的正常宫颈上皮细胞中,对照组hTERT mRNA表达量很低或无法检出,但实验组加入精浆（终浓度为1：10）时,hTERT mRNA的表达水平明显升高（P<0.05）,端粒酶活性也明显升高（P<0.05）。（2）选用特异性COX-2 siRNA抑制HeLa细胞中COX-2的表达后,实验组（精浆处理组）的hTERT mRNA表达未见明显异常,而用非特异性siRNA处理HeLa细胞后,实验组hTERT mRNA表达水平明显高于对照组。（3）采用hTERT荧光素酶报告载体p181晰转染HeLa细胞,实验组HeLa细胞hTERT启动子活性明显高于对照组（P<0.05）。然后用COX-2特异性siRNA抑制COX-2表达后,实验组hTERT启动子活性与对照组相比,其差异不具有统计学意义。（4）采用Western Blotting的方法,实验组HeLa细胞分别加入精浆和PGE2,24小时后收集细胞进行检测,发现精浆处理组和PGE2处理组Spl蛋白的表达水平均明显升高,分别是之前的5.6倍和6.5倍。（5）染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现,HeLa细胞加入精浆或PGE2处理后,Spl抗体沉淀的DNA中hTERT启动子片段被明显募集,还同时伴有乙酰化的组蛋白H3和H4的增加。（6）动物实验结果显示,裸鼠体内精浆处理过的HeLa细胞所生长出的肿瘤组织比对照组HeLa细胞所生长出的肿瘤组织体积明显增大、重量明显增加。结论精浆能促进宫颈癌细胞系和原代培养的正常宫颈上皮细胞中hTERT mRNA表达水平及端粒酶活性上调。精浆诱导HeLa细胞中hTERT启动子活性升高,同时伴有Spl表达增加以及Spl与hTERT启动子结合的增强。COX-2介导了精浆促进hTERT转录激活和端粒酶活性上调的过程,即这一过程是通过COX-2-PGE2-Sp1轴实现的。
柯少波[10]（2015）在《高迁移族蛋白HMGB1对端粒稳态的调控及与放射敏感性的相关性研究》文中提出第一部分高迁移族蛋白HMGB1的表达与人乳腺癌细胞放射敏感性的关系研究目的：研究HMGB1的表达对人乳腺癌细胞放射敏感性的影响。方法：构建人乳腺癌MCF-7-sh-HMGB1及阴性对照模型MCF-7-NC稳转细胞模型。将shRNA进行合成克隆入pGPU6/GFP/Neo shRNA载体中,将合成之后的载体命名为pGPU6/GFP/Neo-HMGB 1和pGPU6/GFP/Neo-shNC。HMGB1低表达和阴性对照稳定转染细胞系采用600ug/ml G418筛选5周,挑选克隆扩增获得,获得的稳定转染细胞命名为MCF-7-shHMGB1和MCF-7-NC,采用RT-PCR和WB检测其HMGB1的干扰效率,克隆形成实验检测MCF-7-shHMGB1和MCF-7-NC细胞系的放射敏感性。结果：稳定转染细胞系的荧光纯度为99%,MCF-7-sh-HMGB1与阴性对照组MCF-7-NC和空白亲本组相比,mRNA相对表达量为（0.12975+0.0314）vS.（0.9625±0.0476） vs.（1）。.HMGB干扰后其mRNA表达为亲本的12.5%,亲本细胞与MCF-7-NC间无明显差异；蛋白表达方面HMGB1显着低于MCF-7-NC组,克隆形成显示HMGB1干扰组的放射敏感性显着提高,MCF-7-NC和MCF-7-shHMGB1的F2为（0.7756±0.0016） vs. （0.5732±0.0031） （p<0.01）; DO 为（2.7555±0.0810） vs. （2.4807±0.0331*） （p<0.05）; Dq为（3.1689±0.1431） vs. （0.7225±0.0210*） （p<0.05）。结论：成功构建了人乳腺癌MCF-7-sh-HMGB1及MCF-7-NC稳转细胞模型,MCF-7-shHMGB1稳定下调HMGB1的表达,MCF-7-NC无明显下调；干扰HMGB1的表达导致MCF-7细胞的放射敏感性显着增强。第二部分下调IMGB1的表达增强了人乳腺癌细胞放射敏感性的机制研究目的：探讨HMGB1调控人乳腺癌细胞放射敏感性的分子机制,为乳腺癌的防治提供新的有效靶点,从而为临床治疗提供理论依据。方法：采用稳定干扰细胞模型MCF-7-sh-HMGB1及阴性对照模型MCF-7-NC进行机制研究,相对端粒长度采用realtime-PCR,目的蛋白表达采用Western blot,端粒酶活性采用PCR-ELISA。细胞增殖采用CCK-8检测。细胞周期与凋亡采用流式细胞术检测,DNA损伤灶点的表达采用免疫荧光-共聚焦检测。活性氧ROS采用活性氧检测试剂盒（荧光法）检测。结果：下调HMGB1的表达增加了MCF-7细胞的放射敏感性,减少了hTERT和cyclinD1的集聚。MCF-7、MCF-7-shHMGB1和MCF-7-NC的相对端粒长度分别为0.8574±0.0812、0.6763±0.0610和1,MCF-7-shHMGB1组与MCF-7-NC相比,相对端粒长度明显缩短（***p<0.001）；与MCF-7组相比结果也类似（*p<0.05）。MCF-7-NC与MCF-7-shHMGB1二者端粒酶活性分别为1.6155±0.1512和1.169±0.0924,干扰HMGB1后导致MCF-7端粒酶活性明显下降（*p<0.05）,而且显着抑制了细胞增殖。在未照射时,MCF-7-NC和MCF-7-shHMGB1细胞的S期的比例分别为（44.090±5.78）%和（29.080±4.234）%；在6Gy照射后6h,12h,24h进行检测,MCF-7-NC和MCF-7-shHMGB1细胞的G2/M分别为（29.790±3.291）%、（23.324±4.580）%、（28.592±2.673）%VS（34.293±4.231）%、（31.959±3.265）%、（35.653±5.297）%,两者差异具有显着性意义,而其余细胞周期间无明显差异。MCF-7-NC和MCF-7-shHMGB1的凋亡比例分别为（5.00±0.848）%和（25.500±1.272）%,下调HMGB1增加了凋亡水平（**p<0.01）。在早期阶段,HMGB1也参与了活性氧的调控。HMGB1通过改变端粒结合蛋白的水平来调控端粒稳态,如TPP1、TRF1、TRF2。HMGB1的下调同时抑制了ATM和ATR信号通路。结论：以上结果显示下调HMGB1的表达破坏了人乳腺癌的端粒稳态,增强了放射敏感性,抑制了DNA损伤修复,抑制了细胞生长、促进其凋亡,HMGB1可能是人乳腺癌放射治疗潜在的新靶点。第三部分人乳腺癌组织中HMGB 1的表达与临床病理特征相关性分析目的：比较HMGB1在乳腺浸润性导管癌患者的肿瘤组织与癌旁组织中的表达差异,并分析HMGB1蛋白表达水平与病理分级、淋巴结转移、总体预后等相关临床病理特征的关系,为乳腺癌的治疗寻找新的靶标。方法：收集武汉大学中南医院病理科存档的72例乳腺癌患者的组织标本切片,入组标准：我院肿瘤科2001-7至2011-8收治的存有完整蜡块组织的首诊乳腺癌患者；未行术前新辅助化疗,所有患者均行病理诊断确诊为浸润性导管癌；接受标准术后辅助治疗；无其他部位原发肿瘤；随访时间截止为2013-1。利用免疫组化法检测患者癌组织与癌旁组织中HMGB1的表达差异,并分析HMGB1蛋白的表达与乳腺癌患者的年龄、绝经状态、肿瘤大小、病理分级、激素受体水平、淋巴结转移、M分期、总体生存状态的相关性。Kaplan-Meier方法分析HMGB1蛋白的表达对累积生存率的影响。结果：HMGB1的阳性表达与年龄、绝经状态、病理分级、雌激素受体状态、HER-2受体状态、淋巴结转移分期及M分期无明显相关性,与肿瘤的增殖能力、孕激素受体状态正相关,与累积生存率负相关,具有统计学意义（P<0.05）。结论：HMGB1的表达与乳腺癌的增殖正相关,其高表达促进肿瘤生长,且与预后负相关,但需要进一步扩大样本量及延长部分样本的随访时间。
二、PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用（论文提纲范文）
（1）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（2）新型端粒酶抑制剂：2-苯基-4H-色酮衍生物的设计、合成、体外抗癌活性评价及构效关系研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 材料与试剂--化学合成 |
| 2.1.2 材料与试剂--端粒酶和抗肿瘤活性筛选及机制研究 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.2.1 仪器与设备--化学合成 |
| 2.2.2 仪器与设备--端粒酶和抗肿瘤活性筛选及机制研究 |
| 2.3 化学合成方法 |
| 2.3.1 中间体1和2的合成方法 |
| 2.3.2 中间体3的合成方法 |
| 2.3.3 中间体4的合成方法 |
| 2.3.4 目标化合物A1-A33和B1-B33的合成方法 |
| 2.4 TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 MTT法检测细胞增殖 |
| 2.7 细胞周期实验 |
| 2.8 细胞凋亡实验 |
| 2.9 免疫印迹法检测蛋白表达量 |
| 3.结果 |
| 3.1 化学合成部分 |
| 3.2 目标化合物A1-A33和B1-B33对端粒酶活性的抑制作用 |
| 3.3 部分目标化合物的细胞毒性 |
| 3.3.1 部分目标化合物的抗肿瘤活性 |
| 3.3.2 部分目标化合物对人正常肝细胞L-02的毒性 |
| 3.4 化合物A33对MGC-803细胞周期的影响 |
| 3.5 化合物A33诱导MGC-803细胞凋亡 |
| 3.6 化合物A33对Dyskerin-NOP10-NHP2 三聚体蛋白的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附图:(部分化合物核磁谱图) |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 小分子端粒酶抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）冬凌草甲素（oridonin）靶向HK1抑制膀胱肿瘤细胞增殖的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文略缩语 |
| 前言 |
| 第一部分 :基于蛋白质组芯片及结合验证初步鉴定Oridonin的潜在直接结合蛋白-HK1的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 人体蛋白质组芯片 |
| 2.2 细胞系 |
| 2.3 冬凌草甲素 |
| 2.4 实验仪器、试剂、耗材和所需溶液 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 芯片实验操作 |
| 3.1.1 封闭芯片 |
| 3.1.2 杂交芯片 |
| 3.1.3 扫描芯片 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.2 芯片数据分析 |
| 3.3 Pull down实验流程 |
| 3.4 Pull-down优化方案 |
| 3.5 Western Blot实验 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 芯片数据总览 |
| 4.2 数据分析并筛选与Oridonin相互作用的蛋白质 |
| 4.3 体内验证冬凌草甲素与HK1的结合 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 :己糖激酶1(HK1)在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞增殖影响的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 临床资料来源 |
| 2.2 实验药品,试剂,仪器 |
| 2.2.1 实验所需的癌细胞系 |
| 2.2.2 实验所用的仪器 |
| 2.2.3 实验所用的试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 常规细胞培养 |
| 2.3.2 转染脂质体 |
| 2.3.3 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.4 CCK-8检测细胞的增殖能力 |
| 2.3.5 细胞克隆形成实验 |
| 2.3.6 EdU检测细胞增殖能力 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.3.8 HK家族的富集分析 |
| 3.实验的结果分析 |
| 3.1 在膀胱癌及癌旁组织中HK1蛋白的表达 |
| 3.2 在不同分级膀胱癌组织中HK1蛋白的表达状况 |
| 3.3 HK1的功能富集分析 |
| 3.4 抑制HK1的表达能够减缓膀胱癌变细胞的增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :Oridonin靶向HK1 抑制膀胱癌细胞增殖的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验所用的细胞系 |
| 2.2 实验所用的仪器 |
| 2.3 实验所用的试剂 |
| 2.4 实验所用的方法 |
| 2.4.1 常规细胞培养 |
| 2.4.2 转染脂质体 |
| 2.4.3 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.4.4 CCK-8检测细胞的活性 |
| 2.4.5 利用Octet K2 分子互作仪考察HK1与oridonin之间的结合情况 |
| 2.4.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Oridonin能够抑制膀胱癌细胞内HK1 的表达 |
| 3.2 oridonin对膀胱癌细胞具有细胞毒性 |
| 3.3 oridonin可以通过抑制HK1 的表达来促进膀胱癌细胞的死亡 |
| 3.4 Oridonin与 HK1 体外结合的动力学 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床意义及分子功能机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 第一节 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床价值及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 miR-423-5p靶基因筛选及TGFBR3表达在肝癌中的临床价值及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 miR-423-5p在肝癌进展中分子作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第一章 全章结论 |
| 第一章 文献综述 MicroRNA-423在人类癌症中的调节机制和功能作用 |
| 第二章 HNRNPA1在HBV阳性肝细胞癌中的临床价值及分子机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 第一节 HNRNPA1在HVB阳性肝癌肝切除患者中的预后价值研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节HNRNPA1在HBV阳性肝细胞癌中的初步分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 全章结论 |
| 第二章 文献综述 HNRNPA1蛋白在消化系统肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）沉默hTERT通过抑制肿瘤干细胞样特性增强鼻咽癌细胞株CNE-2R放射敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的肿瘤干细胞样特性及端粒酶活性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 慢病毒介导稳定沉默hTERT的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的构建及鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第三部分 沉默hTERT对鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的肿瘤干细胞样特性及放射敏感性的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第四部分 Wnt/β-catenin信号通路在hTERT调节CNE-2R细胞肿瘤干细胞样特性及放射敏感性中的作用及机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 主要英文缩写及中英文对照表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）靶向泛素连接酶STUB1对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstracts |
| 1 引言 |
| 第一部分：泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌预后的关系 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 STUB1、hTERT在不同宫颈病变中的表达情况 |
| 3.2 根据ROC曲线定义STUB1、hTERT总蛋白表达的cut off值 |
| 3.3 STUB1、hTERT总蛋白表达与宫颈癌临床病理特点的关系 |
| 3.4 根据ROC曲线定义hTERT胞浆、胞核蛋白表达的cut off值 |
| 3.5 hTERT胞浆、胞核蛋白表达与宫颈癌临床病理特点的关系 |
| 3.6 生存分析 |
| 3.7 STUB1和hTERT胞浆或胞核表达在宫颈癌组织中相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 第二部分：泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌放射敏感性的关系 |
| 5 材料与方法 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 6 研究结果 |
| 6.1 宫颈癌放射敏感/抗拒株模型的放射敏感性检测 |
| 6.2 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中hTERT总蛋白表达的检测 |
| 6.3 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中端粒酶活性的检测 |
| 6.4 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中端粒长度的检测 |
| 6.5 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中细胞周期的检测 |
| 6.6 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中细胞凋亡的检测 |
| 6.7 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中细胞侵袭性的检测 |
| 6.8 肿瘤放射敏感/抗拒株模型C33A/C33AR中rH2AX的检测 |
| 6.9 肿瘤放射敏感/抗拒株模型中C33A/C33ARhTERT蛋白泛素化水平的变化及hTERT亚细胞定位表达情况 |
| 7 讨论 |
| 第三部分：过表达泛素连接酶STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制 |
| 8 材料和方法 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 实验方法 |
| 9 研究结果 |
| 9.1 STUB1稳定过表达的C33AR-STUB1及HelaR-STUB1细胞株的成功建立 |
| 9.2 STUB1过表达对C33AR及HelaR细胞放射敏感性的影响 |
| 9.3 过表达STUB1对端粒酶活性的影响 |
| 9.4 过表达STUB1对端粒长度的影响 |
| 9.5 过表达STUB1对细胞周期的影响 |
| 9.6 过表达STUB1对细胞凋亡的影响 |
| 9.7 过表达STUB1对rH2AX的影响 |
| 9.8 过表达STUB1对hTERT亚细胞定位表达及hTERT胞浆蛋白泛素化水平的影响 |
| 9.9 过表达STUB1对PI3K/AKT、端粒相关蛋白、细胞周期、凋亡、DNA损伤修复表达的影响 |
| 10 讨论 |
| 11 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）端粒酶及VEGF-A与宫颈癌浸润的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 子宫颈癌浸润与HPV感染、端粒酶、炎症因子等相关高风险因素的相关性分析 |
| 1 实验材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学方法处理 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 VEGF炎症因子对子宫颈癌细胞Hela细胞动力学的影响 |
| 1 实验材料与标本 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 端粒酶对宫颈癌hela细胞VEGF表达的影响及其机制研究 |
| 1 实验材料与标本 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宫颈癌浸润转移与HPV、hTERTmRNA、VEGF-A的关联性 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（8）端粒与端粒酶在硼替佐米和ARID1A抑制肿瘤进展中的功能学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 硼替佐米降低端粒酶活性和端粒稳定性诱导肿瘤细胞凋亡的机制 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 图片 |
| 参考文献 |
| 第二部分 染色质重构分子ARID1A负性调控hTERT抑制胃癌进展的机制 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（9）人端粒酶逆转录酶hTERT启动子在恶性肿瘤发生和诊断中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 hTERT启动子DNA甲基化在胃肠道恶性肿瘤诊断中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 hTERT启动子突变在肾细胞癌中的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 精浆刺激宫颈癌端粒酶活化过程中hTERT的转录调控研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（10）高迁移族蛋白HMGB1对端粒稳态的调控及与放射敏感性的相关性研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 英汉对照缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分：HMGBl的表达与人乳腺癌细胞放射敏感性的关系 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：下调HMGB1的表达对人乳腺癌细胞放射敏感性的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：HMGB1在人乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征分析 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间主要科研成果 |
| 致谢 |
四、PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用（论文参考文献）
- [1]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [2]新型端粒酶抑制剂：2-苯基-4H-色酮衍生物的设计、合成、体外抗癌活性评价及构效关系研究[D]. 韩旭. 安徽医科大学, 2020(02)
- [3]冬凌草甲素（oridonin）靶向HK1抑制膀胱肿瘤细胞增殖的作用及机制研究[D]. 姜明哲. 中国医科大学, 2020(01)
- [4]miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究[D]. 柯瑞盛. 福建医科大学, 2019(07)
- [5]沉默hTERT通过抑制肿瘤干细胞样特性增强鼻咽癌细胞株CNE-2R放射敏感性的机制研究[D]. 陈凯华. 广西医科大学, 2019(08)
- [6]靶向泛素连接酶STUB1对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制研究[D]. 杨慧. 武汉大学, 2016(01)
- [7]端粒酶及VEGF-A与宫颈癌浸润的分子机制研究[D]. 李芳. 郑州大学, 2016(01)
- [8]端粒与端粒酶在硼替佐米和ARID1A抑制肿瘤进展中的功能学研究[D]. 慈新宇. 山东大学, 2016(11)
- [9]人端粒酶逆转录酶hTERT启动子在恶性肿瘤发生和诊断中的作用研究[D]. 刘丽. 山东大学, 2016(10)
- [10]高迁移族蛋白HMGB1对端粒稳态的调控及与放射敏感性的相关性研究[D]. 柯少波. 武汉大学, 2015(06)