一、细胞凋亡与缺氧缺血性脑损伤（论文文献综述）
李娜[1]（2021）在《黄芪甲苷调控MMP-9介导NLRP3/Caspase-1信号通路改善缺氧缺血性脑损伤的分子机制》文中指出目的:新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的发病机制可能与NOD样受体家族含吡咯结构域-3（NLRP3）及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的激活有关。炎症对神经系统发育的影响高度依赖于治疗时机,早期评估HIE的炎症严重程度对于调整干预措施非常重要。本研究旨在观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤早期MMP-9、NLRP3炎症小体及其下游效应因子Caspase-1和白细胞介素-1β（IL-1β）的时程变化规律,阐明MMP-9介导NLRP3/Caspase-1信号通路在HIE进程中的作用;同时通过体内和体外细胞实验研究黄芪甲苷（AS-IV）对HIE的防治作用及机制,为缺氧缺血脑损伤后治疗时机的选择提供实验依据,为黄芪甲苷治疗新生儿脑损伤的临床应用提供依据。材料与方法:选取体质量10～14g的7日龄大鼠随机分为缺氧缺血组（HI组,n=40）和假手术组（sham组,n=40）。分别于术后0 h、4 h、8 h、12 h、24 h采集标本（每个时间点随机选取8只）。HI组大鼠双重结扎右侧颈总动脉,然后低氧（8%O2和92%N2）暴露2 h。Sham组仅切开皮肤并钝性分离乳鼠右侧颈总动脉,不结扎直接进行皮肤缝合。手术前后使用头颅超声测量双侧大脑中动脉（MCA）近端最大收缩末期血流速度（ESV）、舒张末期血流速度（EDV）和阻力指数（RI）。用声辐射力脉冲成像（ARFI）评价脑损伤程度。采用HE染色观察24 h内不同时间点大脑海马组织病理变化、免疫组织化学方法检测24 h内不同时间点脑组织中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表达,检测24 h内不同时间点脑组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β、MMP-9 m RNA和蛋白的表达。构建HT22细胞氧糖剥夺（OGD）模型,将HT22细胞分为4组:对照组、OGD组、OGD+MMP-9抑制剂组、OGD+MMP-9激活剂组。应用CCK-8法测定HT22细胞缺氧后48 h内不同时间点细胞活力,观察其细胞形态变化;应用RT-q PCR和Western blot检测24 h内不同时间点OGD对HT22细胞MMP-9、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）、NLRP3、Caspase-1、Gasdermin蛋白（GSDMD）及IL-1β的m RNA和蛋白表达的影响;免疫荧光法检测24 h内不同时间点NLRP3和MMP-9在氧糖剥夺HT22细胞中的表达的变化;免疫荧光法观察激活或阻断MMP-9对NLRP3表达的影响;RT-q PCR和Western blot法检测激活或阻断MMP-9对NLRP3及其下游效应因子Caspase-1、IL-1β、GSDMD m RNA和蛋白表达的影响。选取体质量10～14g的7日龄大鼠24只按随机数字表法分为假手术组、HI组和HI+AS-IV组,每组均8只。造模方法同前。HI+AS-IV组在HI造模后,立即将AS-IV（10 mg/kg）溶于DMSO液中（10m L/kg）,根据仔鼠体重进行灌胃,每8 h 1次,共记3次,24 h后异氟醚麻醉后脑部组织取样。HE染色观察AS-IV对HIE新生大鼠海马区脑组织的影响;采用Caspase-1和TUNEL双免疫荧光染色法检测AS-IV对HIE新生大鼠海马CA1区神经元焦亡发生的影响;Western blot检测AS-IV对新生大鼠焦亡相关蛋白MMP-9、NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表达水平的影响。构建HT22细胞OGD模型,随机分为对照组、OGD组、OGD+AS-IV组。设置AS-IV浓度梯度（50～400μmol/L）,采用CCK8检测不同浓度AS-IV对氧糖剥夺HT22细胞活力及细胞形态的影响;Western blot法检测不同浓度AS-IV对MMP-9、NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表达的影响;免疫荧光法检测OGD 8 h应用不同浓度AS-IV对NLRP3和MMP-9的影响;采用Caspase-1和TUNEL双免疫荧光染色法观察AS-IV对氧糖剥夺后HT22细胞焦亡的影响。结果:1.颅脑超声结果显示HI组右侧椎基底动脉4 h血流速度加快,24 h脑实质回声增强,3只仔鼠在24 h出现椎基底动脉盗血现象;与左侧MCA比较,HI组右侧MCA术后4、24 h ESV明显降低,24 h时EDV明显降低,4 h、12 h、24 h时RI明显增高（P<0.05）。与Sham组比较,HI组右侧MCA在24 h时ESV明显降低,RI明显升高（P<0.05）,左侧MCA的EDV呈进行性升高。HI后4 h,右侧海马锥体细胞层出现细胞密度降低,细胞核固缩和碎裂,可见少量神经细胞嗜酸性变性;8 h可见较多空泡细胞,细胞排列松散、层次紊乱;12 h神经细胞嗜酸性变性明显增多;24 h神经元体积和数量减少,嗜酸性改变有所减轻。免疫组化结果显示,与0 h相比,NLRP3和IL-1β在4 h、8 h、12 h和24 h的表达均显着升高（P<0.01）,Caspase-1的表达在8 h和12 h显着增强（P<0.01）。与sham组相比,HI组NLRP3 m RNA和蛋白地表达在4 h、8 h、24 h显着升高（P<0.05）,Caspase-1表达在12 h显着升高（P<0.001）,IL-1β表达在8 h时明显升高（P<0.01）。MMP-9变化趋势同NLRP3。2.HT22细胞在OGD环境下暴露8 h后体积开始缩小,并被碎屑包围,细胞核呈碎裂状。随着OGD时间的延长,细胞失去原有形态,细胞数量明显减少。CCK-8法检测HT22细胞活力,与0 h相比,8 h细胞活力明显下降（P<0.001）,48 h细胞存活率降至9.9±1.1%。与0 h比较,MMP-9、NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD及IL-1βm RNA和蛋白在OGD后4 h、8 h、12 h、24 h表达均升高（P<0.01）,8 h和12 h上升最明显,24 h轻度下降。上述指标在8 h和12 h间比较,均无统计学意义（P>0.05）。NLRP3和MMP-9在OGD 24 h内各时间点变化趋势一致,TIMP-1变化则与NLRP3和MMP-9相反。免疫荧光法显示,与对照组比较,HT22细胞氧糖剥夺后NLRP3和MMP-9共定位在8 h和12 h明显上升,24 h轻度下降,两者在各时间点的Pearson相关系数（PCC）均大于0.8,各时间点PCC间比较均无统计学意义（P>0.05）。以上研究均证实OGD后8 h MMP-9、NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β的表达增加最明显,因此后续实验选择氧糖剥夺8 h的诱导条件进行。应用MMP-9抑制剂后,NLRP3的表达迅速下降。与OGD组比较,两者共定位明显下降（P<0.001）。应用MMP-9激动剂后,与OGD组比较,两者共定位无明显升高,差异无统计学意义（P>0.05）。激活或阻断MMP-9后,NLRP3和MMP9在各时间点PCC均大于0.8,各时间点PCC比较无统计学意义（P>0.05）。应用MMP-9抑制剂后,与OGD组比较,NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD及IL-1βm RNA和蛋白表达均显着降低（P<0.001）;与对照组比较,上述抗体蛋白和m RNA表达无明显变化（P>0.05）。应用MMP-9激动剂后,与对照组比较,NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD及IL-1βm RNA和蛋白表达显着升高（P<0.01）;与OGD组比较,pro-Caspase-1及cleaved-Caspase-1m RNA和蛋白表达升高（P<0.01）。3.HE染色显示,HI组海马区锥体细胞层细胞密度降低、排列松散、层次紊乱,部分细胞可见空泡变性和典型红色神经元;AS-IV组海马神经元细胞变性程度减轻,急性缺血性改变明显减少。采用Caspase-1和TUNEL标记焦亡细胞,与假手术组比较,HI组海马区可见较多焦亡细胞。与HI组比较,AS-IV治疗后焦亡细胞明显下降（P<0.01）。与假手术组比较,HI组脑组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β表达水平明显升高（P<0.05）;与HI组比较,AS-IV治疗组脑组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD表达水平显着降低（P<0.05）。4.HT22细胞氧糖剥夺8 h时,应用不同浓度AS-IV进行干预。CCK-8实验结果显示,与OGD组比较,应用100～400μmol/LAS-IV干预后,HT22细胞活力均升高（P<0.05）;AS-IV药物浓度在200μmol/L时能明显减轻OGD损害,与对照组比较,细胞活力升高最明显;氧糖剥夺不同时间点应用AS-IV 200μmol/L干预HT22细胞结果显示,OGD 8 h应用黄芪甲苷治疗效果最佳。与对照组比较,OGD组MMP-9、NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达明显升高（P<0.001）;应用AS-IV100～400μmol/L三个浓度干预后MMP-9、NLRP3、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达明显下降（P<0.01）。200μmol/LL和400μmol/L两个浓度为最佳浓度,两浓度间比较差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光显示,与对照组比较,NLRP3与MMP-9共定位明显增加（P<0.001）。与OGD组比较,AS-IV在应用100～400μmol/L三个浓度干预后NLRP3和MMP-9双阳细胞均明显下降（P<0.01）。200μmol/L和400μmol/L两个浓度间比较差异无统计学意义（P>0.05）。采用Caspase-1和TUNEL标记焦亡细胞,与对照组比较,OGD组可见较多焦亡细胞,AS-IV治疗后焦亡细胞比率明显下降（P<0.01）。结论:1.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后4～8 h,NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA和蛋白表达均升高,提示NLRP3炎症体可能参与了新生儿缺氧缺血性脑损伤的发病且其开始上调时间可能早于4小时。NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路可能成为治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤新的治疗靶点。2.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤发生发展过程中,MMP-9表达与NLRP3有一定相关性,抑制MMP-9可显着降低NLRP3及其相关炎症介质Caspase-1、GSDMD、IL-1β的表达。MMP-9可能是调控NLRP3/Caspase-1信号通路的重要介质。3.黄芪甲苷治疗可以减轻缺氧缺血诱导新生大鼠脑损伤,抑制新生大鼠缺氧缺血脑组织和HT22海马神经元细胞炎症反应,这种作用可能是通过调控MMP-9介导NLRP3/Caspase-1信号通路发挥作用的。
周丹丹[2]（2020）在《TSPO在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:大量研究结果显示小胶质细胞的激活与新生儿缺氧缺血有关,受损脑组织内小胶质细胞存在经典激活（M1）和替代激活（M2）两种表型,分别发挥促炎和抗炎、修复功能。在缺氧的早期,小胶质细胞迅速激活,表现为M1型,约24小时后转为M2型。从分子水平分析HIE中小胶质细胞活化的相关机制,可为此类患儿的治疗提供新的靶点。研究显示TSPO在静息小胶质细胞中的表达很低,当小胶质细胞因神经系统受损而出现活化时,TSPO水平经检测呈现明显升高,表明小胶质的激活与TSPO的表达可能存在一定的联系。另有研究显示PPARγ通路的激活还可参与血肿的清除及神经功能的保护。因此本课题组通过体内、体外实验来探讨外周型苯二氮?受体转运蛋白（TSPO）是否介导PPARγ通路来调节小胶质细胞向M2型极化,从而为新生儿缺血、缺氧的治疗寻找新的靶点。方法:（1）体内实验:本次实验我们选择Rice-Vannucci法来建立新生Wistar大鼠缺血缺氧模型,将处理后的大鼠分成四组:（1）A组（假手术组,n=20）;（2）B组（模型组,n=20）;（3）C组（模型+PBS注射组,n=20）;（4）D组[模型+Atriol（TSPO抑制剂）注射组,n=20]。各组大鼠造模后第3天后分两批处死,分别进行灌注取脑（用于免疫荧光分析）和断头取脑（用于蛋白检测）。对各组大鼠脑组织行尼氏染色检查,并检测大鼠脑组织含水量、伊文思蓝（EB）含量。通过Western blot法来检测造模后第3天不同组中PPARγ通路蛋白和凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表达情况。选择免疫荧光染色法对脑组织中Iba-1+CD16/32、Neu N+caspase-3及Iba-1+CD206的共定位表达情况进行检测。（2）体外实验:分离BALB/c小鼠原代小胶质细胞,将上述培养处于对数生长期的原代小胶质细胞按照1×104的细胞数接种于48孔板内,并选择20ng/ml的r IL-4对小胶质细胞分别处理0,6,12,以及24小时。将细胞分成五组:（1）Control组:为正常培养的小胶质细胞;（2）IL-4组:为经过20ng/ml的r IL-4诱导小胶质细胞极化M2表型模型;（3）IL-4+Atriol组:为经过r IL-4诱导小胶质细胞极化M2表型模型加Atriol（50μM）处理;（4）IL-4+FGIN-1-27组:为经过r IL-4诱导小胶质细胞极化M2表型模型加FGIN-1-27（1μM）处理;（5）IL-4+HA-TSPO组:取转染处理后的小胶质细胞使用r IL-4进行诱导处理。将5组细胞置于37℃的细胞培养箱内继续培养12h。利用Western blot法检测各组TSPO、PPARγ蛋白的表达情况;通过实时定量PCR法检测各组TSPO、PPARγm RNA及M2极化型小胶质细胞标志物CD206、Arg-1、YM-1和FIZZ-1的表达情况;使用Elisa法检测各组中BDNF、CNTF-1、IGF-1和NGF-1细胞因子的表达水平。结果:1.体内实验:（1）造模后第3天B、C组大鼠的损伤侧可见明显的水肿,而D组大鼠的损伤侧水肿情况较B、C组大鼠显着减轻。经过统计分析,B、C及D组大鼠损伤侧脑含水量相较于A组大鼠显着升高;同时相较于B、C组大鼠,D组大鼠损伤侧脑含水量着降低（P<0.05）。同时B、C及D组大鼠损伤侧EB的含量相较于A组显着升高;而相较于B、C组大鼠,D组大鼠损伤侧的EB的含量显着降低（P<0.05）。Nissl染色结果则显示A组大鼠的海马区及大脑皮层的细胞整齐排列,具有正常的结构,而B、C、D组的上述细胞则可见结构出现紊乱,经统计分析3组细胞的丢失量显着高于A组大鼠（P<0.05）。然而D组大鼠右侧脑组织的细胞坏死及变性程度相较于B、C组大鼠显着减轻,且D组大鼠细胞的丢失量显着低于B、C组大鼠（P<0.05）。（2）相较于A组大鼠,B组、C组和D组大鼠脑组织中Neu N+Caspase-3荧光蛋白表达共定位的阳性细胞数表达水平显着增加,同时B组、C组大鼠脑组织中Neu N+Caspase-3荧光蛋白表达共定位的阳性细胞数表达水平显着高于D组大鼠（P<0.05）。A组大鼠的神经元基本未出现凋亡,而B组、C组和D组大鼠脑组织中Caspase-3、Bax蛋白的表达水平显着升高,Bcl-2蛋白的表达水平显着下降;同时B组、C组大鼠脑组织中caspase-3、Bax蛋白的表达水平相较于D组显着升高,Bcl-2蛋白的表达水平较于D组显着下降,差异均存在统计学意义（P<0.05）。（3）B组、C组新生Wistar大鼠脑组织在造模后的第3天,Iba-1+CD206及Iba-1+CD16/32荧光蛋白共定位阳性细胞的水平经对比无明显差异（P>0.05）;但B组、C组和D组新生Wistar大鼠脑组织Iba-1+CD206及Iba-1+CD16/32荧光蛋白共定位阳性细胞的水平显着高于A组（P<0.05）;同时B组、C组中荧光蛋白表达共位阳性细胞中Iba-1+CD16/32细胞的水平相较于Iba-1+CD206细胞显着升高;但在D组中,荧光蛋白表达共位阳性细胞中Iba-1+CD16/32细胞的水平相较于Iba-1+CD206细胞显着降低（P<0.05）。（4）B、C及D组大鼠脑组织中PPARγ蛋白的表达水平相较于A组均显着降低（P<0.05）,而TSPO蛋白的表达水平则显着升高（P<0.05）;同时D组大鼠脑组织中PPARγ蛋白的表达水平相较于B、C组显着升高（P<0.05）,而TSPO蛋白的表达水平则显着降低（P<0.05）。2.体外实验:（1）小胶质细胞在镜下主要呈现长梭形、圆形及阿米巴样,该细胞贴壁生长。为了对小胶质细胞的纯度进行检测,我们对其进行DAPI和Lectin荧光双标,检测结果显示我们获取的小胶质细胞纯度已超过96%。（2）将纯化后的小胶质细胞使用20ng/ml的r IL-4分别诱导0、6、12和24小时,检测TSPO和PPARγ蛋白及m RNA在小胶质细胞中的表达水平。Western blot结果表明,在r IL-4诱导6、12小时后,TSPO蛋白的表达逐渐降低,诱导24小时后略有恢复。r IL-4诱导后PPARγ蛋白表达水平显着升高,其最高表达水平在诱导12小时后。同时TSPO和PPARγ的m RNA表达水平变化与两者的蛋白表达水平一致。（3）为了进一步研究TSPO在极化为M2表型小胶质细胞中的功能,用不同TSPO配体处理小胶质细胞12小时,并测定PPARγ的表达水平。结果显示活化的PPARγ定位于细胞核并引起靶基因的激活或抑制。在免疫印迹实验前提取小胶质细胞的核蛋白和胞质蛋白,分析PPARγ蛋白在细胞质和细胞核中的表达水平。结果显示TSPO拮抗剂Atriol增强了极化为M2表型小胶质细胞中PPARγ蛋白的表达,而TSPO激动剂FGIN-1-27则抑制了PPARγ蛋白在细胞质和细胞核中的表达。TSPO在小胶质细胞中的过度表达可显着抑制r IL-4诱导后小胶质细胞细胞质和细胞核中PPARγ蛋白的表达。提示极化为M2表型小胶质细胞中PPARγ的表达和激活受到TSPO的调控。（4）为了确定r IL-4诱导的小胶质细胞M2极化是否受TSPO的调节,我们通过实时PCR方法检测TSPO干预后极化为M2表型小胶质细胞标志物的表达。与对照组相比,r IL-4明显增加小胶质细胞中CD206、Arg-1、YM-1和FIZZ-1基因的表达,表明小胶质细胞呈M2表型极化。同时TSPO拮抗剂Atriol增强了r IL-4诱导的小胶质细胞中CD206、Arg-1、YM-1和FIZZ-1基因的表达。与r IL-4诱导组相比,TSPO激动剂FGIN-1-27和TSPO过表组上述基因的表达显着降低。提示TSPO是参与小胶质细胞M2极化的重要调节因子。（5）我们使用TSPO配体对培养的小胶质细胞进行干预,检测培养液中脑源性神经营养因子（BDNF）、睫状神经营养因子1（CNTF-1）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）和神经生长因子1（NGF-1）的表达水平。与对照组相比,r IL-4可诱导小胶质细胞释放BDNF、CNTF-1、IGF-1和NGF-1;PK11195同样可增强BDNF、CNTF-1、IGF-1和NGF-1的表达水平,FGIN-1-27和TSPO过度表达组上述细胞因子的表达水平受到明显抑制。提示TSPO通路可能参与调控了小胶质细胞的促营养能力。结论:TSPO可能通过介导PPARγ通路调控新生大鼠缺氧、缺血后M2表型小胶质细胞的极化而对受损神经发挥保护作用。
蒋丽军[3]（2020）在《TLR4/NF-κB信号通路介导海马神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑病免疫炎症损伤中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是围产期各种因素引起脑组织部分或完全性缺氧,脑血流减少或暂停而导致的缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）,是新生儿死亡和继发智力障碍、脑瘫等伤残的主要原因之一。迄今为止,临床尚缺乏HIE特异性诊断标志物和有效治疗手段。因此,深入其机制研究,对于优化早期干预治疗方案和降低患儿死亡率及伤残率,具有重要临床价值和意义。免疫炎症反应在HIE的病理机制中扮演重要角色,但其具体机制仍不明确。TLR4是一种天然免疫模式识别受体,在免疫炎症反应的诱导和调节中起重要作用。自噬是细胞代谢保持稳态的重要调控机制。研究发现TLR4可以作为自噬的环境感受器,诱导细胞自噬激活。然而HIE后脑损伤过程是否存在TLR4/NF-KB信号通路介导的神经元细胞自噬过度激活和炎症细胞因子释放尚不明确。本研究通过动物模型和临床研究,探索TLR4/NF-KB信号通路介导的神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑病免疫炎症损伤中的作用及其分子机制。第一部分 TLR4/NF-KB信号通路及神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马免疫炎症损伤中的作用目的:观察HIBD新生大鼠海马免疫炎症损伤过程中TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬相关蛋白表达水平的时间变化规律,分析两者水平变化趋势在时间上是否具有一致性。方法:将7日龄健康清洁级新生Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组、HIBD组;采用Rice-vannucci方法结扎左侧颈总动脉后再缺氧2.5h建立新生大鼠HIBD模型,分别于缺氧缺血后观察以下指标:1.负趋地性实验（Negative geotaxis test）、翻正反射实验（Righting reflex test）和平衡木实验Feeney评分测试神经行为功能以评估新生大鼠近、远期神经行为功能损害程度:2.TTC染色测定新生大鼠脑梗死体积;3.肉眼观察脑组织大体形态学损伤;4.HE染色观察左侧海马组织病理形态学损害;5.免疫组化检测左侧海马CA1区TLR4信号通路以及自噬相关蛋白TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3阳性细胞表达;6.Western blot测定左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3蛋白表达水平时间变化趋势;7.ELISA检测左侧海马组织TLR4/NF-KB信号通路下游炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平时间变化趋势;8.分析TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬相关蛋白表达水平变化趋势在时间上的一致性。结果:1.近、远期神经行为功能测试:假手术组大鼠左右肢体活动正常,能迅速翻转身体,抓牢平衡木有力,通过平衡木迅速,无摔落现象,左右肢体运动协调能力完好。HIBD组大鼠右侧肢体明显无力,翻转身体时间明显延长,通过平衡木缓慢,不能抓牢平衡木,甚至有摔倒或跌落平衡木,测试成绩明显低于假手术组大鼠（P<0.05）,左右肢体运动协调、整合能力差。2.TTC染色:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球TTC染色后脑组织呈现均匀的红色,无明显梗死灶;HIBD组新生大鼠左侧脑组织发生大面积苍白色梗死灶（P<0.05）。3.脑组织大体形态学观察:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球对称,形态规整,脑组织透明清澈,无水肿、浑浊及液化坏死现象。HIBD组新生大鼠两侧大脑半球不对称,左侧大脑半球明显饱满,并可见不同程度的脑组织水肿、浑浊及液化坏死现象。4.海马组织病理形态学变化:假手术组新生大鼠左侧海马组织结构清晰,神经元细胞排列整齐紧密,细胞形态正常。HIBD组新生大鼠在缺氧缺血后24h出现左侧大脑海马组织结构紊乱,神经元细胞排列疏松不齐,细胞水肿,少量细胞核固缩、碎裂及神经细胞坏死现象;48h后损害进一步加重,并出现明显细胞核固缩、碎裂,细胞间隙扩大,血管扩张以及神经细胞大量坏死现象。5.免疫组化检测TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3阳性细胞表达:TLR4以胞浆、胞膜着色为主,p-NF-κB以胞核着色为主,Beclin-1、LC3均以胞质着色为主。假手术组新生大鼠左侧海马组织CA1区仅少量TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3阳性细胞表达;HIBD组新生大鼠左侧海马组织 TLR4、p-NF-κB、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达明显升高（P<0.05）。6.Western blot、ELISA测定TLR4/NF-KB信号通路和自噬相关蛋白水平时间表达趋势:假手术组新生大鼠左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、Beclin-1、LC3表达均处于低水平;HIBD组新生大鼠左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、Beclin-1、LC3表达水平在HIBD后逐渐增高,48h达高峰,72h逐渐下降（P<0.05）,水平变化趋势在时间上基本保持一致。结论:1.HIBD新生大鼠海马免疫炎症损伤过程存在TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬的激活2.HIBD新生大鼠海马免疫炎症损伤过程中TLR4/NF-κB信号通路和神经元细胞自噬相关蛋白表达水平变化趋势在时间上具有一致性,TLR4/NF-κB信号通路可能是神经元细胞自噬激活的关键启动因素。第二部分TAK-242通过TLR4/NF-κB信号通路调节HIBD新生大鼠海马神经元细胞自噬的作用研究目的:观察TLR4特异性拮抗剂TAK-242对HIBD新生大鼠海马神经元细胞自噬的影响,阐明TAK-242通过抑制TLR4/NF-KB信号通路介导的神经元细胞自噬调控HIBD后海马免疫炎症损伤的分子机制。方法:将7日龄健康清洁级新生SD大鼠随机分为假手术组、HIBD+溶媒组、HIBD+TAK-242（0.75mg/kg）组、HIBD+TAK-242（1.5mg/kg）组、HIBD+TAK-242（3mg/kg）组;采用 Rice-vannucci方法建立新生大鼠HIBD模型,分别于缺氧缺血后观察以下指标:1.神经功能缺损评分、转棒实验（Rotarod task）和平衡木实验（Beam walking test）测试神经行为功能以评估大鼠神经功能损害程度;2.TTC染色测定新生大鼠脑梗死体积;3.脑干湿比重法测定脑组织含水量以评估脑水肿程度;4.肉眼观察脑组织大体形态学损害;5.HE染色观察左侧海马组织病理形态学变化;6.免疫组化检测新生大鼠左侧海马组织CA1区TLR4信号通路及自噬相关蛋白TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达;7.Western blot测定新生大鼠左侧海马组织TLR4信号通路及自噬相关蛋白TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 表达水平;8.ELISA测定左侧海马组织炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平。结果:1.神经行为功能测试:假手术组大鼠左右肢体活动正常,运动整合、协调能力完好,奔跑迅速,无跌倒现象。HIBD+溶媒组大鼠右侧肢体明显无力,神经行为功能测试成绩明显低于假手术组,运动整合、协调能力差（P<0.05）。而与HIBD+溶媒组大鼠相比,HIBD+TAK-242组大鼠神经功能缺损明显改善,转轮时间明显增加,平衡木穿行时间明显减少,表现出更好的运动整合、协调能力,其中以高剂量组（3mg/kg）效果最明显（P<0.05）。2.TTC染色:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球TTC染色后脑组织呈现均匀的红色,无明显梗死灶;HIBD+溶媒组新生大鼠左侧脑组织发生大面积苍白色梗死灶（P<0.05）:与HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242组新生大鼠左侧脑组织脑梗死体积明显减少,其中以高剂量组（3mg/kg）减少最明显（P<0.05）。3.脑水肿程度测定:假手术组新生大鼠脑组织含水量恒定;HIBD+溶媒组新生大鼠脑组织含水量明显增加（P<0.05）;与HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242组新生大鼠脑水肿含量明显降低（P<0.05）。4.脑组织大体形态学改变:假手术组新生大鼠左右两侧大脑半球对称,脑组织透明清澈,无水肿、浑浊及液化坏死现象。HIBD+溶媒组新生大鼠两侧大脑半球不对称,左侧大脑半球明显饱满,并可见不同程度的脑组织水肿、浑浊及液化坏死现象;HIBD+TAK-242组新生大鼠左右两侧大脑半球基本对称,左侧脑组织呈轻度水肿、浑浊状态,且程度明显减轻、范围明显减少,无明显脑组织液化坏死现象出现。5.海马组织病理形态学变化:假手术组新生大鼠左侧海马组织结构清晰,神经元细胞排列整齐紧密,细胞形态正常。HIBD+溶媒组呈现海马组织结构紊乱,神经元细胞排列疏松不齐,细胞水肿,细胞核固缩、核碎裂以及神经细胞坏死现象。HIBD+TAK-242组海马组织损害较轻,神经元细胞排列较整齐、致密,仅少数神经细胞出现水肿、坏死现象,且程度明显轻于HIBD+溶媒组。6.免疫组化检测TLR4信号通路及自噬相关蛋白阳性细胞表达:Beclin-1、LC3以胞质着色为主,MyD88、TRIF以胞浆着色为主。假手术组新生大鼠左侧海马组织仅少量TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达;HIBD 后左侧海马组织 TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3阳性细胞表达明显升高（P<0.05）,而应用TAK-242干预后左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 阳性细胞表达明显减少（P<0.05）。7.Western blot测定TLR4信号通路及自噬相关蛋白水平:假手术组新生大鼠左侧海马组织TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3呈现低水平表达;HIBD+溶媒组新生大鼠左侧海马组织 TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 表达水平明显增高（P<0.05）;与 HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242 组新生大鼠 TLR4、p-NF-κB、MyD88、TRIF、Beclin-1、LC3 表达水平明显下降（P<0.05）。8.ELISA检测炎症细胞因子水平:假手术组新生大鼠左侧海马组织TNF-α、IL-1β处于低水平;HIBD+溶媒组新生大鼠左侧海马组织TNF-α、IL-1β水平明显升高（P<0.05）;与HIBD+溶媒组相比,HIBD+TAK-242组新生大鼠TNF-α、IL-1β水平明显降低（P<0.05）结论:1.新生大鼠HIBD后海马免疫炎症损伤过程存在TLR4信号通路介导的神经元细胞自噬过度激活;2.TAK-242可能通过阻断TLR4/NF-KB信号通路,抑制神经元细胞自噬和减少下游炎症细胞因子释放,减轻HIBD后海马免疫炎症损伤,发挥神经保护作用。第三部分 缺氧缺血性脑病新生儿外周血TLR4信号通路、自噬相关蛋白表达水平及意义目的:观察TLR4信号通路、自噬相关蛋白在缺氧缺血性脑病新生儿外周血中的表达,分析其与新生儿行为神经测定（NBNA评分）的相关性,探讨其与新生儿HIE严重程度和近期预后的关系,从而评价其临床病情判断和预后评估价值。方法:1.收集2018年7月-2019年7月扬州大学附属医院NICU收治的HIE新生儿21例,按HIE严重程度将患儿分别分为轻度HIE组、中度HIE组和重度HIE组,健康新生儿为对照组;2.采用Western blot检测外周血单核细胞TLR4、Beclin-1、LC3蛋白表达;3.利用ELISA测定外周血血清TNF-α和IL-1β水平;4.并行新生儿行为神经测定（NBNA评分）;5.分析TLR4、Beclin-1、LC3蛋白表达水平与NBNA评分相关性,评估TLR4、Beclin-1、LC3水平与HIE严重程度和近期预后的关系。结果:1.HIE各组患儿外周血TLR4、Beclin-1、LC3、TNF-α、IL-1β水平均明显高于对照组健康新生儿（P<0.05）,且随HIE严重程度而增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.HIE各组患儿NBNA评分明显低于对照组健康新生儿,且随HIE严重程度而降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.HIE患儿外周血单核细胞TLR4、Beclin-1、LC3蛋白表达水平与NBNA评分均呈明显负相关（P<0.05）。结论:1.TLR4、Beclin-1、LC3水平检测是新生儿HIE病情严重程度判断以及近期预后评估较敏感指标;2.TLR4信号通路及自噬参与新生儿HIE免疫炎症性脑损伤过程,其可能是HIE重要致病机制之一。
秦玮珣[4]（2020）在《基于自噬和炎症探讨“智三针”改善HIBD大鼠认知障碍分子机制》文中指出目的:本课题旨在研究“智三针”改善宫内窘迫缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）模型大鼠认知行为障碍的内在机制。探讨智三针对HIBD大鼠脑部海马区受损神经元病理变化的影响;从NLRP3炎症体活化机制切入,阐明智三针通过调控HIBD大鼠神经元自噬流的强度从而抑制NLRP3炎症体活化,改善神经元损伤的作用通路,为针刺治疗围产期缺氧缺血性脑病的机制研究提供理论依据。方法:采用延迟10分钟剖宫产方法复制宫内窘迫HIBD新生大鼠模型。在新生大鼠出生后第15天给予针刺干预（“智三针”包括神庭穴、双侧本神穴）,每天干预1次,每次留针10分钟,连续14天。本研究共分为四部分:（1）第一部分实验评价针刺对HIBD大鼠生长发育状况的影响,包括体重测定和mNSS神经功能缺损评分;（2）第二部分实验应用旷场试验、新物体识别实验和物体位置识别实验评价针刺对HIBD新生大鼠行为认知能力的影响;通过测定大脑湿重和冠状面、矢状面、水平面的直径评价HIBD大鼠脑部水肿与萎缩变化及针刺对其的影响;应用HE染色、Nissl染色观察针刺对HIBD大鼠海马形态和神经元结构的影响;应用TUNEL荧光染色观察针刺对HIBD大鼠海马神经元凋亡的影响;应用免疫组化观察针刺对HIBD大鼠神经元标志物NeuN和NF200的平均光密度值的影响,初步阐明针刺改善HIBD大鼠行为认知能力的病理学机制;（3）第三部分实验应用ELISA技术检测氧化应激相关指标ROS、MDA、SOD、GSH-px和炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表达,探讨针刺对HIBD大鼠血清氧化应激与炎症反应的影响;应用Western Blotting技术分别在PND1、PND3、PND7、PND14（针刺前）和PND28（针刺后）五个时间节点检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、P62、Lampl、Cathepsin D、Beclin 1 和 NLRP3 炎症体相关蛋白 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD的表达,探讨宫内窘迫HIBD大鼠脑部自噬与炎症反应随着缺血后再灌注的变化以及针刺对HIBD大鼠脑部自噬与NLRP3炎症体相关蛋白表达的影响;（4）第四部分实验添加了自噬激活剂RAPA（雷帕霉素）和抑制剂 CQ（氯喹）,应用时序记忆测试和情景记忆测试观察针刺对HIBD大鼠行为认知能力的影响;应用Western blotting技术检测针刺对HIBD大鼠海马自噬相关蛋白LC3Ⅱ、P62、Lamp1、mTOR、p-mTOR和NLRP3炎症体活化相关指标NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD的表达的影响;应用Real-time PCR技术检测针刺对HIBD大鼠相关基因Map1lc3a、Lampl、Khdrbs1、Nlrp3、Pycard、Gsdmd对应mRNA相对表达量的影响,进一步在分子基因层面阐明智三针通过调控自噬流的强度抑制NLRP3炎症体的活化从而减轻细胞死亡保护受损神经元的机制作用。结果:1.第一部分实验结果延迟10分钟剖宫产方法复制宫内窘迫HIBD新生大鼠模型。分别在各组大鼠PND3、PND7、PND14、PND21和PND28比较各组大鼠体重,结果显示在PND3,HIBD造模导致的缺血缺氧使新生大鼠体重减轻;在PND7和PND14,随着生长时间的增加,HIBD大鼠生长速度明显弱于正常分娩的大鼠;在PND21,HIBD导致新生大鼠体重增长缓慢,针刺干预7天后无显着变化;在PND28,HIBD模型大鼠体重增长缓慢,生长受到限制,而针刺干预14d有利于HIBD大鼠体重增长。各组大鼠改良后的mNSS神经功能缺损评分结果显示HIBD造模的大鼠神经功能明显受损,模型制作成功;针刺能有效改善HIBD模型大鼠的受损神经功能。2.第二部分实验结果（1）旷场实验结果在针刺干预7d后,HIBD模型鼠的旷场探索能力无明显改善作用。在针刺干预14d后,结果显示针刺可以显着提高HIBD模型鼠的旷场水平运和中央区探索能力,但无法明显改善HIBD大鼠旷场垂直探索能力且对HIBD大鼠的情绪影响不明显。（2）新物体识别实验和物体位置识别实验结果各组大鼠均可以识别新旧物体和物体位置。针刺可显着提升HIBD大鼠的新物体辨别能力和对物体位置的识别能力。（3）各组大鼠大脑湿重及各切面直径HIBD造模并未对使大鼠大脑产生明显水肿或萎缩;针刺对HIBD模型鼠的大脑大小和重量无明显影响。（4）各组大鼠脑部海马区HE染色结果正常组大鼠海马锥体细胞结构清晰,呈多角形,排列紧密整齐,胞核饱满,核仁深染清晰可见;模型组大鼠海马的锥体细胞排列散乱,间隙变宽,细胞肿胀导致形态改变,边界不清,大部分神经元坏死形成空泡,核仁固缩;针刺组大鼠海马锥体细胞排列较整齐致密,少部分神经元肿胀坏死,部分核仁清晰可见,边界较清晰,提示针刺有助于改善HIBD受损神经元的形态与结构。（5）各组大鼠脑部海马区Nissl染色结果正常组大鼠海马区锥体细胞排列整齐规律,部分细胞质着色不全,有少量尼氏体在锥体层两侧,部分核仁有固缩现象;模型组大鼠海马锥体细胞排列散乱,间隙明显变宽,胞体肿胀形成空泡,着色不深,核仁明显固缩;针刺组大鼠海马锥体细胞排列较整齐致密,部分核仁清晰可见,边界较清晰。提示HIBD导致新生大鼠海马区神经元肿胀坏死,针刺可有效缓解HIBD大鼠海马区的病理形态。（6）各组大鼠脑部海马Tunnel荧光染色结果宫内窘迫缺氧缺血可引起新生大鼠海马区神经元凋亡从而引起脑损伤;针刺可明显改善HIBD大鼠的海马区神经元凋亡现象。（7）各组大鼠脑部海马区免疫组化结果缺氧缺血导致大鼠海马NeuN表达下降,神经元受损,模型组和假针刺组细胞着色较正常组浅,且细胞排列明显散乱,间距增大;针刺14d可以有效改善大鼠受损海马区NeuN的表达。缺氧缺血导致大鼠海马神经元受损或坏死,NF200表达量显着降低;针刺可以有效改善大鼠受损海马区NF200的表达。3.第三部分实验结果（1）各组大鼠血清氧化应激指标结果:HIBD造模导致大鼠机体释放大量活性氧引起氧化应激反应;针刺可以有效减少血清ROS和MDA浓度,降低氧化应激反应。HIBD造模导致大鼠机体SOD浓度下降;针刺可以有效升高血清SOD和GSH-Px浓度,促进清除氧化应激反应产生的氧离子自由基,减轻细胞损伤。HIBD造模导致大鼠机体释放大量细胞炎性因子使机体受损;针刺可以有效降低血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的浓度,减轻细胞受损程度。（2）HIBD大鼠海马神经元自噬流与焦亡相关蛋白表达结果在PND1,HIBD造模导致机体缺血缺氧,自噬作用被激活清楚受损细胞器,同时激活了大鼠海马区NLRP3炎症体的合成和焦亡作用。在PND3,HIBD导致的机体自噬流降解作用继续增强,同时NLRP3炎症体介导的焦亡作用在继续增强。在PND7,HIBD导致的机体自噬流降解作用继续增强,同时NLRP3炎症体持续活化。在PND14,HIBD大鼠海马自噬诱导持续增强,降解作用无明显改变,同时炎症反应继续增强,脑损伤加重。（3）智三针对HIBD大鼠海马神经元自噬与NLRP3炎症体活化的影响针刺干预后,模型组大鼠海马LC3Ⅱ表达明显升高、P62表达明显降低、LAMP1的表达升高;针刺组大鼠海马LC3Ⅱ、P62、LAMP1的表达明显升高,而假针刺组无明显变化,提示针刺干预抑制HIBD大鼠海马过量自噬流。此外,模型组大鼠海马NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、ASC、IL-1β、GSDMD 表达明显升高;针刺组大鼠海马NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、ASC、IL-1β、GSDMD 表达明显降低,提示针刺干预可有效抑制HIBD大鼠海马神经元焦亡反应,保护受损细胞。4.第四部分实验结果（1）行为学检测结果各组大鼠均可以识别物体出现的先后顺序以及是否与背景匹配。时序记忆测试结果显示:HIBD造模严重降低了大鼠对物体出现顺序的识别能力,抑制自噬流可以显着改善这一现象;经过RAPA干预后的HIBD模型鼠产生了过量的自噬流,而此时针刺已经无法使其下降,脑损伤在不断加重从而导致大鼠的记忆能力始终处于较低水平;CQ组抑制过量自噬流有缓解大鼠的记忆力低下的趋势。情景记忆测试结果显示:HIBD造模严重降低了大鼠识别物体是否与环境匹配的能力,抑制自噬流可以显着改善这一现象;RAPA干预后的HIBD模型鼠产生了过量的自噬流,针刺后自噬流受到抑制,脑损伤减轻从而使大鼠的记忆能力提升;CQ抑制了过量的自噬流可以有效提升大鼠的物体辨别及记忆能力。（2）各组大鼠自噬相关蛋白表达结果模型组大鼠海马LC3Ⅱ表达明显增高、P62表达降低、LAMP1表达升高、P-mTOR/totalmTOR值降低,提示HIBD造模导致的缺氧缺血激活大鼠神经元自噬作用;针刺组大鼠LC3Ⅱ表达升高、P62表达升高、LAMP1表达降低、P-mTOR/otal mTOR值升高,提示针刺抑制自噬流的降解;RAPA组大鼠的LC3IⅡ表达明显升高、P62表达降低、P-mTOR/total mTOR值降低,LAMP1呈升高趋势,提示自噬流被持续过量促进,而CQ组大鼠的LC3Ⅱ、P62、LAMP1、P-mTOR/total mTOR值均升高,提示自噬流降解被抑制;针刺+RAPA组LC3 Ⅱ、P62表达升高,针刺+CQ组LC3Ⅱ、P62表达降低,提示针刺抑制HIBD大鼠的过量自噬流作用。（3）各组大鼠NLRP3炎症体相关蛋白表达结果模型组大鼠海马 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β、GSDMD 表达升高,提示HIBD造模导致的缺氧缺血使大鼠神经元NLRP3炎症体活化,焦亡反应加重;针刺组大鼠海马 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β、GSDMD 表达降低,提示针刺抑制HIBD大鼠神经元NLRP3炎症体活化;RAPA组大鼠海马ASC、pro-caspase-1、IL-1ββ表达升高,提示自噬流增强促使炎症反应加重,CQ组大鼠海马NLRP3、ASC、pro-caspase-1、GSDMD表达降低,提示降低过量自噬流可抑制神经元炎症。针刺+RAPA组大鼠海马ASC、pro-caspase-1、IL-1β、GSDMD表达降低,提示针刺可适量降低HIBD大鼠神经元过量自噬流从而抑制细胞炎症。（4）各组大鼠Real-time PCR结果模型组大鼠海马LC3、P62、LAMP1 mRNA的相对表达量升高;针刺组大鼠LC3、LAMP1 mRNA的相对表达量升高,P62降低,提示针刺干预抑制HIBD大鼠产生的过量自噬流;RAPA组大鼠LC3、P62、LAMP1 mRNA的相对表达量升高,提示RAPA促进HIBD大鼠自噬流增强;CQ组大鼠P62mRNA的相对表达量降低,提示CQ通过抑制自噬底物的生成进而抑制自噬。针刺+RAPA组P62 mRNA的相对表达量降低,提示针刺通过抑制自噬底物的生成抑制过量自噬流。此外,模型组大鼠海马NLRP3、ASC、GSDMD mRNA的相对表达量升高,针刺组大鼠海马NLRP3、ASC、GSDMD mRNA的相对表达量降低,提示针刺干预抑制HIBD大鼠细胞焦亡;RAPA组大鼠海马NLRP3、GSDMD mRNA的相对表达量升高,提示自噬流增强加重HIBD大鼠细胞焦亡;CQ组大鼠海马NLRP3、ASC、GSDMD mRNA的相对表达量降低,提示阻断自噬降解可以有效降低HIBD大鼠的焦亡反应。针刺+RAPA组NLRP3 mRNA相对表达量降低,针刺+CQ组NLRP3 mRNA相对表达量升高,提示针刺抑制NLRP3的生成进而抑制NLRP3炎症体活性,减弱HIBD大鼠的神经元焦亡反应。结论:本研究证实“智三针”改善宫内窘迫HIBD新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的可能机制是:通过调控大鼠海马区因缺氧缺血产生的自噬流,进而抑制神经元中NLRP3炎症体的活化,减少细胞死亡,保护受损神经元。
谭兰兰[5]（2020）在《TIGAR在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及其机制研究》文中研究说明目的:观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时TIAGR表达情况;TIGAR在缺氧缺血性脑损伤中的作用以及其焦亡机制的初步研究。方法:采用新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemia brain damage,HIBD）模型和体外培养大鼠小胶质细胞系（HAPI）氧糖剥夺再灌注（Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型。运用Western blot方法检测HIBD后脑皮层组织中和OGD/R后大鼠小胶质细胞系中TP53诱导糖酵解和细胞凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）以及焦亡相关蛋白 GSDND-N、caspase-1、IL-1β的表达情况。用构建的干扰TIGAR的慢病毒转染大鼠小胶质细胞系后,免疫荧光和Western blot方法检测TIGAR感染率和蛋白表达,使用CCK-8和LDH试剂盒检测TIGAR对OGD/R后的大鼠小胶质细胞系活性和毒性的影响。由慢病毒构建的干扰TIGAR（LV-shTIGAR）通过左侧纹状体和左侧侧脑室注射大鼠脑内,运用免疫荧光法、小动物荧光活体成像技术和Western blot检测TIGAR感染率和蛋白表达,采用脑梗死体积评价TIGAR对缺氧缺血性脑损伤的影响。用构建的干扰TIGAR的慢病毒转染大鼠小胶质细胞系后,使用Western blot方法检测LV-shTIGAR对OGD/R后24 h大鼠小胶质细胞系中焦亡相关蛋白的含量变化的影响。在LV-shTIGAR大鼠小胶质细胞系中,应用NADPH后,DHE染色检测NADPH对OGD/R诱导细胞内ROS水平的影响,运用NADPH/NADP+和GSH/GSSG试剂盒检测 NADPH对OGD/R诱导细胞内NADPH以及GSH/GSSG水平的影响,Western blot方法检测NADPH对OGD/R后24h细胞中焦亡相关蛋白的含量变化的影响,CCK-8、LDH试剂盒检测NADPH对OGD/R后的细胞活性和毒性的影响。同时,在LV-shTIGAR新生大鼠中,应用NADPH后,通过TTC染色法、HE染色法、电镜法以及免疫组化染色法检测NADPH对缺氧缺血性脑损伤的影响。结果:HIBD后脑皮层组织内TIGAR、GSDMD-N、caspase-1、IL-1β的表达量增加,并且在24 h这个时间点达到高峰;OGD/R后大鼠小胶质细胞系内TIGAR、GSDMD-N、caspase-1、IL-1β的表达量增加,并且在24 h这个时间点达到高峰。在大鼠小胶质细胞系中慢病毒构建干扰TIGAR有效地降低TIGAR的表达。干扰TIGAR加重OGD/R诱导的大鼠小胶质细胞系损伤。慢病毒构建的干扰TIGAR能够有效地侵染脑组织,可干扰TIGAR的表达,LV-shTIGAR可增加HIBD后大鼠脑梗死体积。干扰TIGAR可增加OGD/R后24 h大鼠小胶质细胞系内GSDMD-N、caspase-1、IL-1β蛋白水平。在LV-shTIGAR大鼠小胶质细胞系中,应用NADPH后:NADPH显着地抑制了干扰TIGAR诱导的大鼠小胶质细胞系死亡;干扰TIGAR显着地促进了OGD/R诱导的细胞内NADPH、GSH/GSSG水平的降低以及ROS水平的增强,而NADPH阻断了干扰TIGAR的作用;干扰TIGAR则降低OGD/R后24 h大鼠小胶质细胞系内GSDMD-N、IL-1β蛋白水平。同时,在LV-shTIGAR新生大鼠中,应用NADPH后:干扰TIGAR则减少HIBD后大鼠脑梗死体积,减轻脑皮层组织病理损伤和脑皮层细胞损伤,降低脑皮层组织中GSDMD-N的表达。结论:TIGAR对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有保护作用,其机制可能与增加内源性抗氧化剂NADPH降低细胞内ROS水平,抑制细胞焦亡的激活有关。
兰小兵[6]（2020）在《基于Wnt/β-Catenin信号通路研究氧化苦参碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用》文中提出目的进一步系统观察氧化苦参碱（OMT）对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的保护作用,并探讨其保护作用与Wnt/β-Catenin信号通路的关系。方法1.观察OMT对新生大鼠HIBD的保护作用整体水平:构建七日龄新生大鼠HIBD模型,随机分为假手术组（Sham）、模型组（HI）、HI+OMT（120mg/kg）组。观察OMT对新生大鼠HIBD的保护作用:（1）激光散斑成像观察脑血流情况;（2）ELISA测定血清中S-100B蛋白含量。细胞水平:建立新生大鼠原代海马神经元氧糖剥夺（OGD）损伤模型,随机分为正常组（Control）、模型组（OGD）以及OGD+OMT（18.9μM）干预组。观察OMT对新生大鼠原代海马神经元OGD损伤的保护作用:（1）采用MTT法检测细胞存活率;（2）化学发光法检测线粒体膜电位（MMP）水平;（3）单细胞凝胶电泳实验评价原代海马神经元DNA损伤程度。2.探讨OMT对新生大鼠HIBD的保护作用与Wnt/β-Catenin信号通路的关系整体水平:复制新生大鼠HIBD动物模型,随机分为Sham组、HI组、HI+OMT（120 mg/kg）组及工具药组（XAV-939）,造模48h后观察以下指标,（1）TTC染色检测脑梗死体积;（2）HE染色观察脑组织形态学变化;（3）TUNEL染色观察脑组织神经元凋亡程度;（4）免疫荧光检测β-Catenin表达;（5）Western blot检测Wnt1、Dvl2、DKK1、Axin1、APC、GSK-3β/p-GSK-3β、β-Catenin蛋白的表达水平;（6）凝胶迁移实验检测β-Catenin蛋白与Tcf-4的结合活性。细胞水平:复制新生大鼠原代海马神经元OGD损伤模型,分别给予OMT和XAV-939干预24h后:（1）采用q-PCR检测Wnt1、β-Catenin的m RNA相对表达量;（2）Western blot检测c-β-Catenin、n-β-Catenin、Tcf-4、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表达水平。结果1.OMT对新生大鼠HIBD的保护作用与Sham组相比,HI组新生大鼠缺血侧大脑脑血流显着降低（P<0.01）,血清中S-100B蛋白含量明显增加（P<0.01）;与HI组相比,OMT（120 mg/kg）干预后新生大鼠缺血侧大脑脑血流明显增加（P<0.01）,血清中S-100B蛋白含量显着下降（P<0.01）。与Control组相比,OGD损伤模型组中海马神经元细胞存活率显着下降（P<0.01）,线粒体膜电位降低（P<0.01）,且细胞DNA损伤严重（P<0.01）;与OGD组相比,给予OMT（18.9μM）干预后细胞存活率及神经元线粒体膜电位明显增加（均P<0.01）,细胞DNA损伤程度明显减轻（P<0.01）。2.OMT对新生大鼠HIBD保护作用的相关作用机制与Sham组相比,HI组新生大鼠脑梗死体积显着增加（P<0.01）,脑组织病理损伤严重,TUNEL阳性细胞数明显增加（P<0.01）,DKK1、Axin1、APC及GSK-3β蛋白表达水平明显增加（P<0.01）,Wnt1、Dvl2、p-GSK-3β及β-Catenin表达量显着减少（P<0.01）,β-Catenin蛋白与Tcf-4结合活性降低;与HI模型组相比,OMT组新生大鼠脑梗死体积显着降低（P<0.01）,脑组织病理损伤明显改善,TUNEL阳性细胞减少（P<0.01）,DKK1、Axin1、APC及GSK-3β蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,Wnt1、Dvl2、p-GSK-3β及β-Catenin蛋白表达量显着增加（P<0.01）,且β-Catenin蛋白与Tcf-4结合活性增高。给予抑制剂XAV-939处理后,可削弱OMT对上述指标的调节作用。与Control组相比,OGD组原代海马神经元中Wnt1及β-Catenin m RNA水平明显降低（P<0.01）,且细胞核β-Catenin蛋白表达也显着减少（P<0.01）,神经元细胞中Tcf-4及Bcl-2蛋白显着下调（P<0.01）,促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3及cleaved-Caspase-9蛋白水平显着升高（P<0.01）;与OGD组相比,OMT（18.9μM）干预后Wnt1及β-Catenin m RNA水平明显增加（P<0.01）,细胞核β-Catenin蛋白水平升高（P<0.05）,Tcf-4及Bcl-2蛋白表达量增加（P<0.01）,且Bax、cleaved-Caspase-3及cleaved-Caspase-9蛋白表达明显下调（P<0.01）。抑制剂XAV-939干预后可部分抵消OMT的调节作用。结论1.进一步证实了氧化苦参碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有保护作用。2.氧化苦参碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用与激活海马神经元中Wnt/β-Catenin信号通路有关。
高艳[7]（2020）在《脑红蛋白在右美托咪定减轻大鼠缺氧复氧性脑损伤中的作用及机制》文中认为目的:新生儿缺氧缺血性（H/I）脑损伤是围产期窒息幸存者经常遇到的临床问题,可引起不同程度的神经损伤,从而导致认知障碍、癫痫、脑瘫、智力发育迟缓等。短暂性缺血缺氧可以引起严重的急性脑损伤,尤其是海马区对缺血缺氧极为敏感。然而,目前尚无新生儿缺氧缺血性脑损伤的有效治疗方法。右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）是一种选择性α2受体激动剂,在临床上可用于镇痛,镇静,抗焦虑。据报道,右美托咪定可通过α2受体来发挥神经保护作用。虽然右美托咪定的神经保护作用已被广泛证实,但是它的分子机制以及介导的信号通路仍需阐明。脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）是一种存在于脊椎动物的球蛋白,在神经元中有丰富的表达,它对氧具有较高的亲和力,从而增加了对脑组织的供氧。最近有研究表明,Ngb在H/I损伤模型中过表达,对神经细胞的凋亡具有保护作用,减轻神经元的H/I损伤。因此,我们推测右美托咪定的神经保护作用可能与Ngb存在潜在联系,右美托咪定可能通过诱导Ngb表达,在H/I损伤的神经保护作用中发挥积极作用。低氧诱导因子（HIF-1α）是缺氧反应的主要调节器,可以调节一系列基因的表达,这些基因有助于对低氧环境及细胞存活的适应。它是一个常氧状态下降解的螺旋-环-螺旋（bHLH）结构的转录因子。然而,在缺氧的条件下,羟基化修饰下降,进而稳定了HIF-1α的转录活动。近年来,相关研究表明HIF-1α信号通路与缺氧性脑病的发病机制密切相关,其活化被认为与抑制神经元凋亡相关。因此,本课题研究构建了7日龄SD大鼠缺氧/复氧（H/R）损伤模型,模拟新生儿H/I脑损伤,然后将H/R模型暴露于不同剂量的右美托咪定,通过调节Ngb表达来评价右美托咪定是否有助于减轻新生儿H/I脑损伤,并进一步研究该作用是否通过α2受体与激活HIF-1α/p53信号通路有关。研究方法:1、7日龄健康的Sprague Dawley（SD）大鼠140只,体重为12-16g。随机分为5组（n=48）:C组（对照组）,H/R组（缺氧/复氧组）,D1组（缺氧/复氧+25μg/kg右美托咪定组）,D2组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定组）,和D3组（缺氧/复氧+75μg/kg右美托咪定组）。除C组外,其它各组均进行缺氧/复氧处理,吸入8%O2+92%N2 2小时,然后给予50%O2 30min。复氧结束后除外H/R组,D1组,D2组,D3组腹腔分别注射25μg/kg,50μg/kg,75μg/kg右美托咪定。2小时、24小时、48小时、72小时后用Western blot法和免疫组化法检测Ngb的表达,用Nissl染色观察大鼠海马CA1区的损伤情况,用Western blot法检测凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3的表达,用TUNEL荧光检测海马细胞凋亡情况。2、将7日龄健康的SD大鼠48只,随机分成4组（n=12）:C组（对照组）,H/R组（缺氧/复氧组）,D组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定组）和DY组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定+0.5mg/kg育亨宾组）。在缺氧/复氧后,D组腹腔注射50μg/kg右美托咪定,DY组腹腔注射50μg/kg右美托咪定及0.5mg/kgα2受体拮抗剂育亨宾。24小时后,用Western blot法检测凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3的表达,用TUNEL荧光检测海马细胞凋亡情况,用Western blot,免疫组化和免疫荧光检测Ngb,HIF-1α的表达,用Western blot法检测p53的表达。3、将7日龄健康的SD大鼠48只,随机分成4组（n=12）:C组（对照组）,H/R组（缺氧/复氧组）,D组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定组）和DM组（缺氧/复氧+50μg/kg右美托咪定+16mg/kg2-甲氧基雌二醇组）。在缺氧/复氧后,D组腹腔注射50μg/kg右美托咪定,DM组腹腔注射50μg/kg右美托咪定及16mg/kg HIF-1α的抑制剂2-甲氧基雌二醇（2ME2）。24小时后,用Western blot法检测凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3的表达,用TUNEL荧光检测海马细胞凋亡情况。用Western blot,免疫组化及免疫荧光检测通路相关蛋白Ngb,HIF-1α的表达,用Western blot法检测p53的表达。4、五组大鼠,即C组,H/R组,D组,DY组和DM组,每组10只,于出生后28天用Morris水迷宫测试大鼠远期空间学习记忆能力。结果:1、Western blot分析显示,与C组相比,H/R组各时间点Ngb表达均上调（p<0.05）。与H/R组相比,中、高剂量的右美托咪定使Ngb表达显着上调（p<0.05）,而低剂量的右美托咪定对Ngb的表达没有明显影响（p>0.05）。在免疫组化分析中也发现了类似的结果。Nissl染色结果显示:在复氧后2h、24h,C组神经元含有丰富的Nissl体,H/R模型组Nissl体减少、解体甚至消失,神经元数量较C组减少,提示H/R模型建立后海马神经元受损。当右美托咪定低剂量作用于H/R模型时,Nissl体仍然减少并解体,神经元数量减少。中、高剂量右美托咪定处理H/R模型时,Nissl体重新出现并增加,神经元数目较H/R组增加,神经元呈颗粒状分布。在缺氧/复氧后2h、24h,与C组相比,H/R组Cyt-c、APAF-1、Caspase-3的表达明显增加（p<0.05）。右美托咪定低剂量暴露后,Cyt-c、APAF-1、Caspase-3表达无明显变化（p>0.05）。中、高剂量右美托咪定处理H/R模型时,与H/R组相比,Cyt-c、APAF-1、Caspase-3表达明显受到抑制（p<0.05）,在缺氧/复氧后48h,72h,各组之间Cyt-c、APAF-1、Caspase-3的表达无统计学意义（p>0.05）。TUNEL荧光染色结果显示:在缺氧/复氧后2h,24h,与C组相比,H/R组海马细胞凋亡率较C组增加（p<0.05）。虽然D1组对细胞凋亡无影响（p>0.05）,但D2、D3组能明显抑制细胞凋亡（p<0.05）。在缺氧/复氧后48h,72h,各组之间海马细胞凋亡率无统计学意义（p>0.05）。2、应用α2受体拮抗剂育亨宾后,与D组相比,DY组凋亡相关蛋白Cyt-c,APAF-1,Caspase-3表达增加,TUNEL结果显示,D组染色强度低于DY组,凋亡也低于DY组（p<0.05）。与H/R组相比,D组Ngb、HIF-1α和p53蛋白表达明显增高（p<0.05）。然而,育亨宾治疗后,与D组相比,DY组Ngb、HIF-1α和p53的蛋白表达明显降低（p<0.05）。Ngb,HIF-1α在免疫组化和免疫荧光分析中发现类似的结果。3、应用HIF-1α的抑制剂2-甲氧基雌二醇（2ME2）后,Western blot分析显示,与D组比较,DM组海马组织中Cyt-c,APAF-1,Caspase-3蛋白表达明显升高（p<0.05）。TUNEL结果显示,D组染色强度低于DM组,凋亡也低于DM组（p<0.05）。Western blot分析显示,加入2ME2后,Ngb,HIF-1α和p53蛋白表达显着降低（p<0.05）。Ngb,HIF-1α免疫组化及免疫荧光观察出现类似的变化。4、为探讨右美托咪定对H/R损伤大鼠长期学习记忆的影响,新生大鼠于28天进行水迷宫实验。结果发现,与H/R组比较,D组大鼠第5天的逃避潜伏期明显缩短,第6天的穿越平台次数明显增多（p<0.05）。而与D组相比,DY组和DM组第5天逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少（p<0.05）。结论:右美托咪定在大鼠H/R损伤中具有诱导Ngb表达的药理作用,且具有剂量依赖性。此外,右美托咪定介导的Ngb上调抑制了Cyt-c、APAF-1和Caspase-3表达,抑制细胞凋亡。通过α2受体拮抗剂育亨宾干预,Cyt-c、APAF-1和Caspase-3表达明显升高,Ngb表达下降。当HIF-1α信号通路被抑制,右美托咪定促进HIF-1α,p53,Ngb表达的作用消失。此外,应用育亨宾或2-甲氧基雌二醇,可逆转右美托咪定对H/R损伤大鼠空间学习和记忆功能的改善作用。由此可见,右美托咪定在治疗新生儿缺氧性脑病时可能通过α2受体激活HIF-1α/p53信号通路上调Ngb表达而发挥作用。
王黎[8]（2019）在《ULK1/FUNDC1对神经元细胞缺氧诱导的细胞自噬和细胞凋亡的影响》文中提出目的:脑血管疾病一直被认为是全世界最常见的死亡原因之一,也是导致残疾的主要原因。脑血管疾病的60%-80%是由缺血引起的缺血性脑梗死（ischemia cerebral infarction,ICI）,又称缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke）导致的。缺血性脑卒中以其持续攀升的发病率、病死率、致残率和复发率对人类的生命和健康产生严重的威胁。因此,研究缺血性脑卒中这个世界医药科学领域备受关注的重大疾病的发病机制,及时预防以及治疗其发病及并发症就显得尤为重要。此外,缺血性脑卒中也是围手术期非常严重的并发症。一旦术中发生脑灌注不足或者栓塞,都可能引起脑血流减少或中断发生缺血性脑卒中。不但严重影响患者的术后恢复,延长患者的住院及康复时间,加重患者的经济负担,还会增加医疗纠纷的潜在风险。因此,研究术中重要脏器功能保护,尤其是脑保护,对于保障患者术中生命安全,促进患者快速康复,改善预后,也具有重大意义。细胞自噬和细胞凋亡都是在缺氧诱导的缺血性脑卒中期间观察到的生物学现象。自噬在调节细胞存活状态中起着维持稳态的重要作用。许多证据表明,在缺血性卒中发生后,自噬在脑内各种细胞类型中被激活,例如神经元细胞、神经胶质细胞和脑微血管细胞等。但是,缺血性脑卒中相关的自噬过程的特定作用和分子机制尚未完全阐明。而且,自噬和凋亡之间相互转换的具体作用机制也尚不清楚。目前,关于自噬和凋亡之间的相互作用及相互调控的作用机制的研究,已经成为研究的热点问题之一,尤其是在脑缺血的发生发展和治疗中,仍需深入的研究。这将为脑缺血的防治提供新的思路,也将为临床麻醉及手术中重要器官功能的保护提供新的理论支持。UNC-51样自噬激活激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1）和含有Fun14结构域的蛋白1（FUN14 Domain-containing Protein 1,FUNDC1）都参与了细胞自噬的调节。本课题研究旨在探讨ULK1和FUNDC1对缺氧诱导的神经细胞的自噬和凋亡的调控作用及其机制,以寻找抑制或减少缺血性脑卒中后神经细胞发生凋亡的可能分子靶点。方法:选取大鼠PC-12细胞在含5%CO2和90%氮气以及氧气的气体混合物的低氧箱中制备缺氧模型。在37℃缺氧条件下将PC-12细胞培养0,3,6,24小时,分别检测PC-12细胞的存活率、凋亡率、自噬及凋亡相关蛋白的表达。通过将全长ULK1序列构建到pcDNA3.1质粒（GenePharma,Shanghai,China）中对细胞进行转染来上调ULK1的表达,并标记为pc-ULK1,使用空载体pcDNA3.1作为对照。通过将含有抑制剂siRNA ULK1与Lipofectamine 3000的混合液体转染于PC-12细胞来抑制ULK1的表达。分别检测ULK1 mRNA、FUNDC1及p-FUNDC1相关蛋白的表达;PC-12细胞的凋亡率、自噬及凋亡相关蛋白的表达。将3-甲基腺嘌呤（3-MA）用作我们实验研究中的自噬的抑制剂;雷帕霉素（rapamycin）作为自噬的激活剂;SP600125作为c-Jun N-末端激酶（JNK）抑制剂。检测在分别加入自噬抑制剂、JNK抑制剂及自噬激活剂后,JNK通路有关的关键分子的蛋白的表达。细胞存活率使用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）测定法来测定。细胞凋亡率使用膜联蛋白V-PE/7-ADD（AnnexinV-PE/7-ADD）染色测定法来测定。PC-12细胞中ULK1和FUNDC1的mRNA的表达水平使用逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）定量。使用蛋白印迹法（Western blotting）分析与细胞自噬,细胞凋亡和JNK通路有关的关键分子的蛋白表达水平。结果:通过采用CCK-8法和Annexin V-PE/7-ADD染色法来检测缺氧刺激后PC-12细胞存活率和细胞凋亡率的情况。6和24 h缺氧刺激能显着抑制PC-12细胞的活性（P<0.05和P<0.01）。缺氧处理24 h后细胞存活率降至46.29%。此外,缺氧刺激显着诱导PC-12细胞发生凋亡,并且随着缺氧时间的延长,细胞凋亡越来越严重（P<0.05或P<0.01）。在缺氧处理后3,6和24 h后细胞凋亡率分别为3.2%,7.81%和11.76%。蛋白印迹法结果显示对PC-12细胞进行缺氧处理24 h后Bax,c/p-caspase3和c/p-caspase 9的蛋白表达水平均明显增加,Bcl-2的蛋白表达水平降低（p<0.05,P<0.01或P<0.001）。这些结果表明缺氧显着诱导了PC-12细胞发生细胞凋亡。使用蛋白印迹法分析缺氧处理后低氧诱导的PC-12细胞的细胞自噬相关蛋白的蛋白表达。缺氧处理后,PC-12细胞内的LC3-II/I的蛋白表达比率和Beclin-1的蛋白表达水平上调（P<0.05;P<0.01或P<0.001）。此外,缺氧处理后p62的蛋白表达水平下调（P<0.05）。这些结果表明缺氧显着诱导PC-12细胞自噬。使用RT-qPCR定量检测缺氧诱导后PC-12细胞中ULK1和FUNDC1基因的mRNA的表达。缺氧处理明显上调PC-12细胞中ULK1基因的mRNA表达量（P<0.05或P<0.01）。缺氧诱导后PC-12细胞中FUNDC1基因的mRNA表达没有变化。然而,蛋白印迹法结果显示在缺氧刺激后PC-12细胞中ULK1基因的蛋白表达水平和p/t-FUNDC1的蛋白表达比值均增加（P<0.05或P<0.001）。这些结果表明缺氧促进了PC-12细胞中ULK1和FUNDC1基因的活化。通过将pc-ULK1和si-ULK1分别转染到PC-12细胞中以阐明ULK1基因对PC-12细胞中FUNDC1基因表达的影响。pc-ULK1转染后显着增加PC-12细胞中ULK1的mRNA表达水平（P<0.05）。用pc-ULK1转染后ULK1基因的蛋白表达水平和p/t-FUNDC1基因的蛋白表达比值均升高（P<0.01或P<0.001）。此外,siULK1转染显着降低PC-12细胞中ULK1基因的mRNA表达（P<0.01）。si-ULK1转染后显着下调PC-12细胞中ULK1基因的蛋白表达和p/t-FUNDC1基因的蛋白表达比值（P<0.01或P<0.001）。上述结果表明ULK1基因正向调节PC-12细胞中FUNDC1基因的表达。采用Annexin V-PE/7-ADD染色法和蛋白印迹法分别检测pc-ULK1（ULK1基因过表达）和si-ULK1（ULK1基因沉默）对缺氧诱导的PC-12细胞凋亡和细胞自噬的影响。在正常氧浓度条件下,pc-ULK1转染后过表达ULK1基因对PC-12细胞凋亡没有显着影响。但是,在缺氧处理后PC-12细胞的凋亡率却显着增加（P<0.01）,而pc-ULK1转染后同时给予缺氧刺激PC-12细胞的凋亡率明显下降（P<0.05）。蛋白印迹法结果显示,与缺氧细胞组相比,pc-ULK1转染后再给予缺氧刺激PC-12细胞中Bax,c/p-caspase 3和c/p-caspase 9的蛋白表达降低,而Bcl-2的蛋白表达增加（P<0.05,P<0.01或P<0.001）。相反,si-ULK1转染沉默ULK1基因后对正常条件下的PC-12细胞凋亡没有影响,明显加重了缺氧诱导的PC-12细胞的细胞凋亡（P<0.05）。同时蛋白印迹法的结果表明,与缺氧细胞组相比,PC-12细胞中Bax,c/p-caspase 3和c/p-caspase 9的蛋白表达增加,而Bcl-2的蛋白表达降低低氧刺激pc-ULK1转染（P<0.05或P<0.01）的。此外,pc-ULK1和si-ULK1转染对PC-12细胞的细胞自噬也没有显着的影响。与缺氧细胞组相比,缺氧+pc-ULK1组的PC-12细胞的细胞自噬增强（P<0.05或P<0.01）,并在低氧+si-ULK1组中细胞自噬减少（P<0.05,P<0.01或P<0.001）的。上述结果表明ULK1参与了PC-12细胞的细胞凋亡和细胞自噬的调控。过表达ULK1基因减少了PC-12细胞的细胞凋亡并增加了细胞自噬。相关处理后通过测定JNK信号通路中关键分子的蛋白表达来分析JNK通路对ULK1过表达诱导的细胞自噬增强和细胞凋亡减少的影响。单纯缺氧处理组PC-12细胞中p/t-JNK和p/t-c-Jun的表达率显着上调（P<0.01）,这表明缺氧激活了PC-12细胞中的JNK信号通路。此外,与缺氧细胞组相比,缺氧+pc-ULK1组内PC-12细胞中p/t-JNK和p/t-c-Jun的表达率增加（P<0.05）这表明pc-ULK1增强了PC-12细胞中的JNK信号通路的活化。而且,与缺氧+pc-ULK1组相比,缺氧+pc-ULK1+SP600125（JNK抑制剂）组和缺氧+pc-ULK1+3-MA（自噬抑制剂）组两组内PC-12细胞中p/t-JNK和p/t-c-Jun的表达率降低（P<0.01）的。与缺氧+pc-ULK1组相比,缺氧+pc-ULK1+SP600125组和缺氧+pc-ULK1+3-MA组两组PC-12细胞存活率降低（P<0.05）。与缺氧+pc-ULK1组相比,缺氧+pc-ULK1+SP600125组和缺氧+pc-ULK1+3-MA组两组内PC-12细胞的细胞凋亡增加（P<0.05）。这些结果表明JNK信号通路参与了ULK1基因过表达诱导的PC-12细胞凋亡的减少,而且ULK1/FUNDC1不是通过促进细胞自噬来保护细胞死亡的唯一因素。此外,与单纯缺氧细胞组相比,缺氧+雷帕霉素（自噬激活剂）组的PC-12细胞的细胞凋亡减少（P<0.05）。与缺氧+雷帕霉素+pcDNA3.1组相比,缺氧+雷帕霉素+pc-ULK1组的PC-12细胞凋亡减少（P<0.05）。这些结果进一步表明PC-12细胞缺氧后,细胞自噬适当的增强可以减少细胞凋亡。结论:ULK1/FUNDC1在缺氧诱导的神经细胞自噬和凋亡中发挥重要的调控作用,可促进细胞自噬,抑制缺氧条件下的细胞凋亡。ULK1的过表达通过促进细胞自噬可抑制神经细胞缺氧诱导的细胞凋亡。ULK1可能是缺血性脑卒中后调控细胞自噬、减少神经细胞凋亡的新的分子靶点。JNK信号通路参与了过表达ULK1基因引起的缺氧诱导的神经细胞凋亡的减少。
王燕[9]（2019）在《新生儿缺氧缺血性脑病危险因素分析及血清S100β在脑损伤中的应用》文中研究指明第一部分新生儿缺氧缺血性脑病危险因素分析目的:本研究通过回顾性分析新生儿缺氧缺血性脑病发生的危险因素,为新生儿缺氧缺血性脑病提供早期诊断和预防的临床依据。方法:统计收集2013年5月至2018年5月,在青岛市市立医院产科分娩并收治新生儿监护室的新生儿,其中确诊为缺氧缺血性脑病患儿52例为HIE组;同时随机选取同期本院产科分娩收治新生儿监护室的在胎龄、体重、性别通过SPSS 19.0统计软件分析无统计学差异（P>0.05）的78例非新生儿缺氧缺血性脑病新生儿（除外其他脑部疾病）作为对照组。分别收集两组相关信息,其中包括患儿的一般情况（性别、胎龄、出生体重、Apgar评分）、羊水污染、妊娠期糖尿病、妊娠期高血压、子痫前期、宫内窘迫、胎膜早破。分析其对新生儿缺氧缺血性脑病发病率有无影响,是否为新生儿缺氧缺血性脑病的危险因素。结果:通过SPSS 19.0统计软件分析,与对照组比较,单因素分析HIE组中患儿母亲合并妊娠期糖尿病率、妊娠期高血压及子痫前期率、羊水污染率、宫内窘迫率、胎膜早破率、Apgar评分（生后1min、生后5min）异常率较高,各组间均存在差异,具有统计学意义（P<0.05）。多因素Logistic回归分析妊娠期糖尿病、妊娠期高血压或子痫前期、羊水污染、宫内窘迫、胎膜早破均为新生儿缺氧缺血性脑病的危险因素（P<0.05）,Apgar评分（生后1min）为新生儿缺氧缺血性脑病的保护因素。结论:患儿母亲合并妊娠期糖尿病、妊娠期高血压及子痫前期、羊水污染、宫内窘迫、胎膜早破均为新生儿缺氧缺血性脑病的危险因素,Apgar评分（生后1min）为新生儿缺氧缺血性脑病的保护因素,即评分越高患儿发生缺氧缺血性脑病的概率越低。第二部分血清S100β蛋白在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的应用目的:研究血清S100β蛋白在早期评估新生儿缺氧缺血性脑损伤中的应用价值。方法:统计收集2017年1月至2018年12月在青岛市市立医院产科分娩收治新生儿监护室的30例存在窒息缺氧等危险因素、根据临床和影像学、脑电图检查确诊的缺氧缺血性脑损伤患儿作为观察组。同时随机选取同期内本院产科分娩收治新生儿监护室的一般患儿（注:无窒息缺氧史、无宫内感染、无神经系统疾病）30例作为对照组,进行回顾性分析。两组患儿胎龄（周）、体重（g）、性别通过SPSS 19.0统计软件进行分析,计量资料用t检验,计数资料用χ2检验,统计学分析无差异（P>0.05）。在患儿生后72h内采集2ml股静脉血,采用免疫层析法对其进行检测,测得的血清S100β蛋白数值进行组间比较,分析观察组与对照组血清S100β蛋白数值是否存在差异。结果:通过SPSS 19.0统计软件分析,观察组在生后72h内的血清S100β蛋白水平明显高于对照组,存在差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:观察组血清S100β蛋白水平明显高于对照组,血清S100β蛋白对新生儿缺氧缺血性脑损伤具有早期评估价值。
刘结民[10]（2019）在《热敏灸对缺氧缺血性脑病新生小鼠脑组织细胞凋亡的影响》文中进行了进一步梳理目的:研究热敏灸大椎穴治疗新生儿小鼠缺氧缺血性脑病（NHIE）疗效并探讨其作用机制。方法:SPF级健康ICR小鼠（重约3～5g）按随机对照原则分成假手术组、缺氧缺血模型组、艾灸治疗组;艾灸治疗组依据小鼠尾温变化再次分为非热敏灸组（尾温未上升）和热敏灸组（尾温升高）。缺氧缺血模型组、艾灸治疗组按照Rice-Vannucci和Levine的方法制备NHIE模型;以生长发育的体重、神经行为学测试（翻正反射、悬崖躲避试验、趋地反射试验、抓力试验）、形态学观察、TTC、TUNEL、caspase-9为检测指标。结果:纳入统计的四组新生小鼠体重统计学上无差异（P>0.05）,在术后三天,与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组和热敏灸组的小鼠体重增长较快,统计学上有差异（P<0.05）。与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组和热敏灸组小鼠的翻正反射时间、悬崖躲避试验时间、趋地反射试验时间明显缩短,而抓力试验时间延长,统计学上有差异（P<0.05）。非热敏灸组和热敏灸组梗死面积较缺氧缺血模型组均减少（P<0.05）,且热敏灸组梗死面积明显减少（P<0.05）。缺氧缺血模型组小鼠左侧脑组织表面出现大面积苍白、液化现象,且脑组织萎缩,大面积梗死;与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组梗死面积较小,热敏灸组梗死面积最小。缺氧缺血模型组左侧脑组织细胞排列顺序杂乱无章,细胞大量丢失,缝隙变大;与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组仅少量细胞脱落,热敏灸组细胞脱落数量最少。非热敏灸组和热敏灸组表达的TUNEL阳性细胞总数较缺氧缺血模型组减少（P<0.05）;热敏灸组较非热敏灸组表达的TUNEL阳性细胞总数减少（P<0.05）。非热敏灸组和热敏灸组表达的caspase-9阳性细胞总数较缺氧缺血模型组减少（P<0.05）;热敏灸组较非热敏灸组表达的caspase-9阳性细胞总数减少（P<0.05）。结论:热敏灸大椎穴可以增加缺氧缺血性脑病新生小鼠的体重,提高其运动功能,减少脑梗死面积,抑制细胞脱落,其机理也许与降低脑组织中caspase-9的阳性表达和细胞凋亡的数量有关。
二、细胞凋亡与缺氧缺血性脑损伤（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞凋亡与缺氧缺血性脑损伤（论文提纲范文）
（1）黄芪甲苷调控MMP-9介导NLRP3/Caspase-1信号通路改善缺氧缺血性脑损伤的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 缺氧缺血性脑损伤早期MMP-9、NLRP3和Caspase-1 变化的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 MMP-9 介导NLRP3/Caspase-1 信号通路在氧糖剥夺海马神经元细胞中的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 黄芪甲苷调控MMP-9 介导NLRP3/Caspase-1 信号通路对缺氧缺血性脑损伤的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 黄芪甲苷调控MMP-9 介导NLRP3/Caspase-1 信号通路对氧糖剥夺海马神经元细胞作用的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 黄芪的生物活性及其对神经系统保护作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（2）TSPO在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TSPO抑制剂调控 PPARγ通路对缺血、缺氧新生大鼠的神经保护作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 TSPO通过PPARγ途径调控IL-4诱导的小胶质细胞/巨噬细胞M2极化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 小胶质细胞在中枢神经系统的功能及其靶向治疗药物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 致谢 |
（3）TLR4/NF-κB信号通路介导海马神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑病免疫炎症损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TLR4/NF-κB信号通路及神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马免疫炎症损伤中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TAK-242通过TLR4/NF-κB信号通路调节HIBD新生大鼠海马神经元细胞自噬的作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 缺氧缺血性脑病新生儿外周血TLR4信号通路、自噬相关蛋白表达水平及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 图表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 自噬与缺氧缺血性脑损伤研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文及成果 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（4）基于自噬和炎症探讨“智三针”改善HIBD大鼠认知障碍分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 围产期缺氧缺血性脑病的现代医学研究进展 |
| 一、HIE的流行病学现状、诊断和预后 |
| 二、HIE的病理学机制研究进展 |
| 三、HIE的现代医学治疗进展 |
| 第二节 自噬流与NLRP3炎症体介导的焦亡参与HIBD发生发展 |
| 一、自噬流参与调控HIBD神经元死亡 |
| 二、NLRP3炎症体介导的焦亡参与调控HIBD神经元死亡 |
| 三、自噬作用介导NLRP3炎症体活化的机制 |
| 第三节 针灸治疗HIE的研究进展 |
| 一、针灸治疗HIE的临床疗效研究进展 |
| 二、针刺治疗HIE的机制研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 智三针对HIBD新生大鼠一般生长发育状况的影响 |
| 一、实验用品 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 智三针对HIBD新生大鼠行为学和脑部病理形态的影响 |
| 一、实验用品 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 智三针修复HIBD新生大鼠海马区受损神经元的相关分子机制 |
| 一、实验用品 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第四节 智三针调控自噬流抑制HIBD新生大鼠NLRP3炎症体活化的机制 |
| 一、实验用品 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件1:统计学处理合格证明 |
（5）TIGAR在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 一、研究背景 |
| 1. HIE的发病机制 |
| 2. 细胞焦亡与缺氧缺血性脑损伤 |
| 3. TIGAR的研究现状 |
| 4. 本课题的主要研究内容 |
| 二、本课题的创新性 |
| 三、本课题的研究意义 |
| 第一部分 TIGAR对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 |
| 第一节 TIGAR在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后的大鼠小胶细胞系内激活 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第二节 TIGAR对大鼠小胶质细胞系OGD/R诱导的细胞损伤的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第三节 TIGAR对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第二部分 TIGAR保护缺氧缺血性脑损伤的分子机制 |
| 第一节 细胞焦亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第二节 TIGAR对大鼠小胶质细胞系OGD/R诱导的细胞焦亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第三节 TIGAR抑制大鼠小胶质细胞系OGD/R诱导的细胞焦亡通过降低细胞内ROS水平 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 第四节 TIGAR通过NADPH减轻缺氧缺血性脑损伤 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 实验不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞焦亡在新生儿缺氧缺血性脑损伤的研究 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 攻读学位期间科研情况 |
| 攻读学位期间获奖情况 |
| 致谢 |
（6）基于Wnt/β-Catenin信号通路研究氧化苦参碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 图片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 攻读学位期间参与的基金项目 |
| 个人简历 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（7）脑红蛋白在右美托咪定减轻大鼠缺氧复氧性脑损伤中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :不同剂量右美托咪定对缺氧/复氧引起的大鼠海马区脑红蛋白及细胞凋亡的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物模型 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 动物合笼 |
| 2.2.3 实验分组 |
| 2.2.4 缺氧/复氧模型+右美托咪定处理 |
| 2.3 标本的采集与处理 |
| 2.3.1 WB样本采集 |
| 2.3.2 免疫组化、TUNEL、尼氏染色标本采集 |
| 2.4 Western blot蛋白分析 |
| 2.4.1 蛋白提取 |
| 2.4.2 BCA法测定蛋白浓度及蛋白变性 |
| 2.4.3 配胶及电泳 |
| 2.4.4 转膜、封闭及一抗孵育 |
| 2.4.5 二抗孵育及显影 |
| 2.5 免疫组化 |
| 2.5.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.5.2 免疫组化 |
| 2.6 TUNEL荧光 |
| 2.6.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.6.2 TUNEL荧光 |
| 2.7 Nissl染色 |
| 2.7.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.7.2 Nissl染色 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 右美托咪定剂量依赖地介导H/R损伤时Ngb表达上调 |
| 3.2 右美托咪定剂量依赖地减轻海马神经元损伤 |
| 3.3 右美托咪定剂量依赖地抑制H/R损伤大鼠海马神经元细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :右美托咪定的α_2作用对缺氧/复氧引起的大鼠海马细胞凋亡及Ngb、HIF-1α、p53的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物模型 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 动物合笼 |
| 2.2.3 实验分组 |
| 2.2.4 缺氧/复氧模型+右美托咪定及育亨宾处理 |
| 2.3 标本的采集与处理 |
| 2.3.1 WB样本采集 |
| 2.3.2 免疫组化、TUNEL、免疫荧光样本采集 |
| 2.4 Western blot蛋白分析 |
| 2.4.1 蛋白提取 |
| 2.4.2 BCA法测定蛋白浓度及蛋白变性 |
| 2.4.3 配胶及电泳 |
| 2.4.4 转膜、封闭及一抗孵育 |
| 2.4.5 二抗孵育及显影 |
| 2.5 免疫组化 |
| 2.5.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.5.2 免疫组化 |
| 2.6 TUNEL荧光 |
| 2.6.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.6.2 TUNEL荧光 |
| 2.7 免疫荧光 |
| 2.7.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.7.2 免疫荧光 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 右美托咪定通过α_2受体减轻H/R损伤引起的细胞凋亡 |
| 3.2 右美托咪定在H/R脑损伤中通过α_2受体调控Ngb,影响HIF-1α、p53 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :右美托咪定通过HIF-1α/p53信号通路在缺氧/复氧引起的大鼠脑损伤中发挥神经保护作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物模型 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 动物合笼 |
| 2.2.3 实验分组 |
| 2.2.4 缺氧/复氧模型+右美托咪定及2-甲氧基雌二醇处理 |
| 2.3 标本的采集与处理 |
| 2.3.1 WB样本采集 |
| 2.3.2 免疫组化、TUNEL、免疫荧光标本采集 |
| 2.4 Western blot蛋白分析 |
| 2.4.1 蛋白提取 |
| 2.4.2 BCA法测定蛋白浓度及蛋白变性 |
| 2.4.3 配胶及电泳 |
| 2.4.4 转膜、封闭及一抗孵育 |
| 2.4.5 二抗孵育及显影 |
| 2.5 免疫组化 |
| 2.5.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.5.2 免疫组化 |
| 2.6 TUNEL荧光 |
| 2.6.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.6.2 TUNEL荧光 |
| 2.7 免疫荧光 |
| 2.7.1 组织固定、包埋及切片 |
| 2.7.2 免疫荧光 |
| 2.8 水迷宫 |
| 2.8.1 水迷宫组成 |
| 2.8.2 定位航行测试 |
| 2.8.3 空间探索测试 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 右美托咪定引起的细胞凋亡减轻可被2-甲氧基雌二醇拮抗 |
| 3.2 右美托咪定通过 HIF-1α/p53 信号通路上调 Ngb,改善大鼠 H/R脑损伤 |
| 3.3 右美托咪定改善发育期大鼠H/R损伤后远期学习记忆能力 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）ULK1/FUNDC1对神经元细胞缺氧诱导的细胞自噬和细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 主要实验仪器和试剂 |
| 2 细胞株 |
| 3 PC-12 细胞培养和处理 |
| 4 PC-12 细胞缺氧模型 |
| 5 细胞存活率测定 |
| 6 Annexin V-PE/7-ADD染色分析 |
| 7 定量反转录PCR(RT-qPCR) |
| 8 PC-12 细胞过表达转染 |
| 9 PC-12 细胞siRNA细胞干扰转染 |
| 10 蛋白免疫印迹(Western Blotting) |
| 11 统计分析 |
| 结果 |
| 1 缺氧诱导PC-12 细胞凋亡 |
| 2 缺氧诱导PC-12 细胞自噬 |
| 3 缺氧促进ULK1和FUNDC1 基因的激活 |
| 4 ULK1 正向调节PC-12 细胞中FUNDC1 基因的表达 |
| 5 ULK1 参与PC-12 细胞凋亡和细胞自噬 |
| 6 JNK信号通路参与过表达ULK1 基因诱导的PC-12 细胞凋亡的减少 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表(附录) |
| 致谢 |
（9）新生儿缺氧缺血性脑病危险因素分析及血清S100β在脑损伤中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 新生儿缺氧缺血性脑病危险因素分析 |
| 引言 |
| 第1章 资料与方法 |
| 1.1 一般资料分析 |
| 1.2 新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 第2章 结果 |
| 2.1 单因素分析对新生儿缺氧缺血性脑病的影响 |
| 2.2 多因素分析对新生儿缺氧缺血性脑病的影响 |
| 第3章 讨论 |
| 3.1 新生儿缺氧缺血性脑病发病机制 |
| 3.2 危险因素分析 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 血清S100β蛋白在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的应用 |
| 引言 |
| 第1章 资料与方法 |
| 1.1 一般资料分析 |
| 1.2 样本采集及检测方法 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 第2章 结果 |
| 第3章 讨论 |
| 3.1 新生儿缺氧缺血性脑损伤的发生机制 |
| 3.2 S100β蛋白与新生儿缺氧缺血性脑损伤 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 宫内感染与新生儿脑损伤研究进展 |
| 1.宫内感染致脑损伤病原学及感染途径 |
| 2.宫内感染临床表现 |
| 3.宫内感染与脑损伤的发病机制 |
| 4.新生儿脑损伤的早期评价 |
| 5.新生儿脑损伤的治疗与干预 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 1.参加学术会议 |
| 2.攻读学位期间发表文章 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（10）热敏灸对缺氧缺血性脑病新生小鼠脑组织细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 西医对NHIE的研究 |
| 2 中医对NHIE的研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方案 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 热敏灸对HI模型小鼠尾温的影响 |
| 2.2 热敏灸对HI模型小鼠体重的影响 |
| 2.3 热敏灸对HI模型小鼠行为学测试结果的影响 |
| 2.4 热敏灸对HI模型小鼠脑梗死面积的影响 |
| 2.5 热敏灸对HI模型小鼠脑组织形态观察 |
| 2.6 热敏灸对HI模型小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数的影响 |
| 2.7 热敏灸对HI模型小鼠脑组织caspase-9 阳性细胞数的影响 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1 实验动物的选择 |
| 2 HI模型的选择 |
| 2.1 气管夹闭术 |
| 2.2 延迟剖宫产术 |
| 2.3 动脉结扎法 |
| 3 热敏灸的概述 |
| 4 针灸大椎穴与脑病的探讨 |
| 5 腧穴热敏化的探讨 |
| 6 热敏灸治疗HI模型疗效的探讨 |
| 6.1 热敏灸对HI模型小鼠生理发育和行为学测试的探讨 |
| 6.2 热敏灸对HI模型的探讨 |
| 6.3 热敏灸对HI模型脑组织形态学的探讨 |
| 7 热敏灸治疗HI模型作用机制的探讨 |
| 7.1 热敏灸对HI模型小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数的探讨 |
| 7.2 热敏灸对HI模型小鼠脑组织caspase-9阳性细胞数的探讨 |
| 结论 |
| 1 文献研究 |
| 2 实验研究 |
| 本研究创新与不足之处 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 答辩委员会名单 |
四、细胞凋亡与缺氧缺血性脑损伤（论文参考文献）
- [1]黄芪甲苷调控MMP-9介导NLRP3/Caspase-1信号通路改善缺氧缺血性脑损伤的分子机制[D]. 李娜. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [2]TSPO在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及机制研究[D]. 周丹丹. 苏州大学, 2020(06)
- [3]TLR4/NF-κB信号通路介导海马神经元细胞自噬在缺氧缺血性脑病免疫炎症损伤中的作用及机制研究[D]. 蒋丽军. 苏州大学, 2020(06)
- [4]基于自噬和炎症探讨“智三针”改善HIBD大鼠认知障碍分子机制[D]. 秦玮珣. 广州中医药大学, 2020(06)
- [5]TIGAR在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及其机制研究[D]. 谭兰兰. 苏州大学, 2020(02)
- [6]基于Wnt/β-Catenin信号通路研究氧化苦参碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用[D]. 兰小兵. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [7]脑红蛋白在右美托咪定减轻大鼠缺氧复氧性脑损伤中的作用及机制[D]. 高艳. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]ULK1/FUNDC1对神经元细胞缺氧诱导的细胞自噬和细胞凋亡的影响[D]. 王黎. 青岛大学, 2019(07)
- [9]新生儿缺氧缺血性脑病危险因素分析及血清S100β在脑损伤中的应用[D]. 王燕. 青岛大学, 2019(02)
- [10]热敏灸对缺氧缺血性脑病新生小鼠脑组织细胞凋亡的影响[D]. 刘结民. 江西中医药大学, 2019(02)