一、门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的研究（论文文献综述）
武家成[1]（2021）在《血竭素高氯酸盐通过内质网应激诱导肝细胞癌凋亡的机制研究》文中研究指明目的:肝细胞癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率在世界范围内位居第六位,每年新增病例数超过84万,尽管目前针对肝细胞癌的治疗方式多种多样,包括手术治疗、介入治疗、消融治疗以及化学药物治疗及分子靶向治疗等,但总体治疗效果不佳,总体五年生存期仅18%,每年因肝细胞癌死亡人数超过78万。因此,如何改善肝细胞癌预后是人们亟待解决的难题。手术切除是临床上针对肝细胞癌最基本的治疗方式,但由于其恶性程度高,发展隐匿等特点,绝大多数病例在确诊时已无法行根治性手术,且术后极易发生复发及转移,因此药物治疗成为目前抗肝细胞癌治疗的重要手段。虽然目前已经出现了以索拉菲尼为代表的多种抗肝癌药物,但效果并不理想,开发新型抗肝癌药物已成为研究者们关注的热点。细胞凋亡是程序性细胞死亡最重要的方式之一,是通过在生理和病理条件下有序协调的细胞程序而最终发生的主动性死亡,其过程受到严密的调控。在正常生理状态下,通过细胞凋亡能去除衰老及异常细胞,对进化、维持机体内环境稳态及器官发育存在重要意义。然而在某些病理条件下,细胞凋亡调节异常也能够导致多种疾病,包括肿瘤、神经退行性变等。根据凋亡信号启动途径的不同,细胞凋亡主要分为外源性凋亡及内源性凋亡,也称为死亡受体凋亡途径及线粒体凋亡途径,两者通过不同的级联信号传导最终均以激活caspase-3等蛋白而执行凋亡改变。通过各种方式诱导肿瘤细胞凋亡是达到抗肿瘤目的重要方式,其中,通过开发新颖的药物直接作用于肝癌细胞并选择性的诱导肝癌细胞凋亡是目前抗肝癌药物研发的重要方向。血竭素高氯酸盐是人工合成的类血竭素样的黄酮类化合物,其药用价值已经被多项研究证实,包括对组织愈合,创面修复及抗糖尿病方面存在一定作用。然而目前,其抗肿瘤作用已成为其药物研究的焦点。目前通过部分体外试验初步证实其在体外对人宫颈癌、肺癌、乳腺癌等存在抑制作用,且其抗肿瘤作用的机制主要以其诱导肿瘤细胞凋亡为主。然而,目前对血竭素高氯酸盐的抗肿瘤作用机制研究并不深入,且其是否对肝细胞癌存在有效的抗癌作用尚未有研究明确证实,因此,我们将通过体内外实验探索血竭素高氯酸盐对肝细胞癌的抗癌作用,并进一步探索其抗癌机制,为研发新颖的抗肝细胞癌药物提供依据。方法:1、通过MTT法、Hoechst33342、流式细胞仪凋亡检测以检测血竭素高氯酸盐对肝癌细胞及正常肝细胞的作用。2、通过电子显微镜观察肝癌细胞在血竭素高氯酸盐的作用下,细胞器形态学发生的改变。3、通过转录组测序分析肝癌细胞在血竭素高氯酸盐的作用下,转录水平上发生的改变。4、通过MTT法、Western Blot检测、流式细胞仪凋亡检测、流式细胞仪线粒体膜电势检测等检测血竭素高氯酸盐对肝癌细胞凋亡通路、内质网应激通路以及mTORC1通路的影响,并通过加入相应信号通路抑制剂分析各通路上下游关系。5、建立肝癌裸鼠移植瘤模型,测量记录在肿瘤在血竭素高氯酸盐作用下体积变化,并记录小鼠体重变化。6、HE染色观察移植瘤及其他重要器官组织的病理结构改变。8、TUNEL染色检测移植瘤组织凋亡情况。7、免疫组化检测移植瘤内p-4EBP1、p-PERK及CHOP的表达。结果:1、血竭素高氯酸盐在体外能够使人肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、Hep3B及Huh-7细胞活力显着下降,且对人正常肝细胞L02的细胞毒性明显小于肝癌细胞系。2、通过Hoechst染色、流式细胞仪凋亡检测及Western Blot发现血竭素高氯酸盐在体外能够诱导肝癌细胞凋亡,且细胞活力的抑制及细胞凋亡率能够被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK所逆转。3、血竭素高氯酸盐对肝癌细胞系在转录组层面上诱导巨大变化,涉及多种生物学过程及信号通路,包括内质网应激、内源性凋亡及mTORC1信号激活等。4、在电子显微镜下观察血竭素素高氯酸盐能够诱导肝癌细胞线粒体肿胀、内质网扩张、溶酶体增多等改变。5、通过流式细胞仪线粒体膜电势检测及Western Blot检测发现血竭素高氯酸盐能够诱导肝癌细胞线粒体膜电势降低,并诱导Bax及Bcl-2表达比例失衡及caspase-9活化。6、通过Western Blot检测发现血竭素高氯酸盐激活肝癌细胞内质网应激,PERK-ATF4-CHOP信号通路被显着激活,在应用4-PBA抑制内质网应激信号的同时,其诱导的线粒体途径凋亡信号得到逆转。7、通过Western Blot检测发现血竭素高氯酸盐能够激活肝癌细胞mTORC1信号,通过应用Torin-1抑制mTORC1的激活,能够逆转其诱导的内质网应激及下游凋亡信号。8、血竭素高氯酸盐能够在体内抑制肝癌细胞的生长,且对裸鼠体重无明显影响,通过HE染色观察肿瘤及重要器官的病理结构发现,血竭素高氯酸盐能够诱导肝癌移植瘤组织结构紊乱,坏死程度加重,且对肝、肺、肾、心、脑无明显毒性作用。9、应用TUNEL法对肿瘤切片进行检测发现血竭素高氯酸使移植瘤组织TUNEL凋亡染色显着增强。10、通过免疫组化检测,发现血竭素高氯酸盐能够上调移植瘤内mTORC1通路及内质网应激通路关键蛋白的表达。结论:1.血竭素高氯酸盐在体内及体外均能够显着抑制肝癌细胞的生长,并对正常细胞及组织毒性较小。2.血竭素高氯酸盐能够激活肝癌细胞内质网应激信号通路,并介导诱发内源性凋亡。3.血竭素高氯酸盐能够激活mTORC1,并通过激活内质网应激分支信号通路PERK-ATF4-CHOP介导下游凋亡信号。
李爽[2]（2020）在《益气活血方有效成分抑制巨噬细胞氧化亢进，防治门脉高压症的药理研究》文中指出门静脉高压（PH）是临床慢性肝病的常见难治并发症,以门脉的血流增多与阻力升高为主要病理生理特征,缺乏特异性治疗药物。汇管区巨噬细胞氧化亢进,超氧化物歧化酶3（SOD3）活性降低,引起一氧化氮（NO）和前列环素（PGI2）等舒张物生物利用度降低,是门脉压力升高的主要因素。本课题前期建立了恒流测压大鼠门脉离体灌流系统,发现益气活血方有效成分丹酚酸B和甘草酸二铵可有效降低门脉压力,缓解PH。因此,在前期基础上,本研究采用四氯化碳（CC14）诱导复制大鼠PH模型,以氯膦酸二钠脂质体清除肝脏巨噬细胞,与未清除巨噬细胞大鼠配对比较,确定巨噬细胞激活参与PH。在离体灌流门脉系统上,以盐酸氨基胍抑制内皮型一氧化氮合酶（iNOS）,塞来昔布抑制2型环氧合酶（COX-2）,观察舒张物生物利用度,并通过检测SOD3酶活性等,探索丹酚酸B和甘草酸二铵防治PH的药理机制。1.巨噬细胞参与大鼠门脉高压症[目的]观察巨噬细胞激活在大鼠门脉高压中的作用。[方法]Wistar雄性大鼠40只,随机分为2组,对照组每周2次皮下注射橄榄油（3mL/kg）,模型组每周2次皮下注射40%CCl4（3mL/kg）;d70-105,将模型大鼠分为2亚组,巨噬细胞未清除与清除组,半数动物每周1次尾静脉注射PBS脂质体（0.3mL/kg）,另半数动物尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体（15mg/kg）。d105,各组大鼠腹主动脉取血,检测在体门脉压力,单核细胞数量,血清sCD163和趋化因子2（CCL2）含量,免疫组化检测肝脏CD163阳性表达。[结果]PBS脂质体组内,与对照组比较,模型组大鼠门脉压力升高,单核细胞个数和百分比升高,血清CD163和CCL2含量增加,汇管区CD163免疫组化阳性表达量升高:氯膦酸二钠脂质体组内,与对照组比较,模型组大鼠单核细胞个数和百分比升高,门脉压力升高,血清CD163和CCL2含量增加,汇管区CD163免疫组化阳性表达量升高;各组大鼠配对比较,对照大鼠中,巨噬细胞清除组较未清除组血浆单核细胞个数和百分比降低,血清CD163含量降低和CCL2含量,模型大鼠中,巨噬细胞清除组较未清除组单核细胞个数和百分比降低,门脉压力降低,血清CD163含量、CCL2含量、CD163阳性表达量均下降。[结论]巨噬细胞参与大鼠门脉高压。2.益气活血方有效成分防治大鼠门脉高压药效[目的]观察丹酚酸B和甘草酸二铵防治大鼠门脉高压的药效。[方法]Wistar雄性大鼠132只分为对照组、模型组、阳性组、丹酚酸B组、甘草酸二铵组和联合组,对照组每周2次皮下注射橄榄油（3mL/kg）,模型组和治疗组每周2次皮下注射40%CC14（3mL/kg）;d56,对照组和模型组每天灌胃0.01%CMC（5mL/kg）,各治疗组分别给予卡托普利、丹酚酸B、甘草酸二铵、丹酚酸B+甘草酸二铵（5mL/kg）灌胃,d70,将各组大鼠再分为2亚组,巨噬细胞未清除与清除组,每周1次分别尾静脉注射PBS脂质体（0.3mL/kg）或氯膦酸二钠脂质体（15mg/kg）。d105,称量大鼠体重,麻醉后,收集腹水,检测在体门静脉压力,腹主动脉取血检测肝功,称量肝脏、脾脏重量,苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色,观察肝脏病理变化及胶原沉积,形态计量假小叶个数及体积比和胶原纤维构成比。[结果]治疗各组较模型组比较,可显着减少腹水量,缓解肝脏病理变化,减少假小叶形成及胶原纤维沉积,降低在体门静脉压力,改善肝功能;巨噬细胞清除同未清除组配对比较,阳性药、丹酚酸B、甘草酸二铵和联合组巨噬细胞清除组大鼠假小叶个数减少,平均体积增加,胶原纤维沉积比减少。[结论]丹酚酸B和甘草酸二铵能有效治疗大鼠门脉高压,且疗效具有巨噬细胞依赖趋势。3.益气活血方有效成分抑制巨噬细胞氧化亢进防治门脉高压药理[目的]探索丹酚酸B和甘草酸二铵抑制汇管区巨噬细胞氧化亢进,防治大鼠门脉高压的药理机制。[方法]Wistar雄性大鼠144只分为对照组、模型组、阳性组、丹酚酸B组、甘草酸二铵组和联合组,对照组每周2次皮下注射橄榄油（3mL/kg）,模型组和治疗组每周2次皮下注射40%CC14（3mL/kg）;d56,对照组和模型组每天灌胃0.01%CMC（5mL/kg）,各治疗组分别给予卡托普利、丹酚酸B、甘草酸二铵、丹酚酸B+甘草酸二铵（5mL/kg）灌胃治疗,d70,将各组大鼠分为2亚组,巨噬细胞未清除与清除组,每周1次分别尾静脉注射PBS脂质体（0.3mL/kg）,另半数动物尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体（15mg/kg）。d105,大鼠麻醉后,测量在体门脉压力,进行离体门脉灌流,测量NO和PGI2利用度,取左叶肝脏,采用免疫组化法测定肝脏NADPH氧化酶2（NOX2）,SOD3,iNOS,诱导型一氧化氮合成酶（eNOS）阳性表达量,肝脏匀浆,检测SOD3酶活性,NOX2和SOD3蛋白表达量。[结果]单体各组较模型组比较,门脉压力下降,NOX2和iNOS表达减少,eNOS和SOD3表达增加,SOD3酶活性升高,舒张物NO和PGI2利用度升高;巨噬细胞清除后同未清除组配对比较,模型组门脉压力下降,NOX2和iNOS表达减少,eNOS和SOD3表达增加,SOD3酶活性升高,舒张物NO和PGI2利用度升高;各中药单体组门脉压力下降,NOX2、iNOS和eNOS表达量下降,丹酚酸B和联合组NO和PGI2利用度升高,甘草酸二铵组NO和PGI2利用度降低。[结论]巨噬细胞参与门脉高压发生与发展,丹酚酸B和甘草酸二铵提高舒张物利用度,保护抗氧化酶活性,回降门脉压,防治门脉高压,巨噬细胞为丹酚酸B治疗门脉高压作用靶点之一。
郑磊[3]（2020）在《血管重构在门脉高压症中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分:门静脉高压症与动脉重构目的:探索肝硬化和非肝硬化门静脉高压症模型中是否存在血管重构表型。方法:分别采用CCl4吸入诱导肝硬化和PPVL手术诱导非肝硬化门静脉高压症大鼠模型,判定其成模情况后检测肠系膜血管重构表型。结果:两种模型平均动脉压均降低,门静脉压力均升高,肝脏组织学显示肝硬化门静脉高压症大鼠肝脏明显硬化改变,非肝硬化组大鼠肝脏无明显差别。在肝硬化门静脉高压症中肠系膜动脉变薄,非肝硬化门静脉高压症中无明显改变。结论:两种模型造模是成功的。肝硬化门静脉高压症模型存在显着动脉重构表型,非肝硬化门静脉高压症模型中不存在此表型。第二部分:门静脉高压症动脉重构的结构表现目的:阐明门静脉高压症动脉重构的血管成分异常。方法:通过电镜、WB、免疫组化和荧光检测肠系膜动脉主要结构相关蛋白的表达。结果:门静脉高压症大鼠肠系膜动脉中血管内皮凹凸不平,内皮细胞发生脱落,p-e NOS表达增多,钙调蛋白、弹性蛋白和α-SMA表达减少。结论:肠系膜动脉重构的主要改变以内皮细胞脱落、基底膜间隙增宽、收缩蛋白（钙调蛋白、弹性蛋白、α-SMA）表达减少,扩张蛋白p-e NOS表达增多。第三部分:VEGFR-3与门静脉高压症动脉重构目的:研究VEGFR-3与肠系膜动脉重构的关系。方法:运用PCR和免疫荧光检测门静脉高压症的肠系膜动脉相关基因和蛋白表达。结果:门静脉高压症的大鼠肠系膜动脉上VEGF-D和VEGFR-3表达增多,同时Ki-67增殖信号和cleaved caspase-3凋亡信号表达增多。结论:在门静脉高压症的肠系膜动脉重构中,VEGFR-3信号表达增加,其配体VEGF-D表达同时增加。血管增殖和凋亡信号均有所增加,但血管平滑肌细胞凋亡明显。第四部分:抑制VEGFR-3与门静脉高压症动脉重构目的:证明抑制VEGFR-3信号能够改善门静脉高压症中肠系膜动脉重构。方法:运用VEGFR-3抑制剂MAZ-51治疗门静脉高压症大鼠后检测重构表型。结果:两组大鼠门静脉压力、平均动脉压和VEGFR-3表达无明显差异,MAZ-51改善门静脉高压症大鼠肠系膜动脉重构,血管厚度和面积增加,肠系膜动脉平滑肌细胞凋亡减少。结论:运用VEGFR-3抑制剂MAZ-51能够通过减少肠系膜动脉平滑肌细胞凋亡,缓解门静脉高压症的肠系膜动脉重构。第五部分:VEGFR-3信号通路与门静脉高压症动脉重构目的:初探VEGFR-3信号在肠系膜动脉上内皮细胞层的信号通路。方法:原代分离肠系膜动脉内皮细胞,运用不同时间和浓度VEGF-D刺激内皮细胞,以及MAZ-51联合VEGF-D刺激内皮细胞,检测相关蛋白表达。结果:随着VEGF-D刺激时间和浓度的增加,VEGFR-3下游信号磷酸化e NOS、AKT和ERK的表达逐渐增加,在10min和50ng/ml磷酸化程度最为显着。MAZ-51组较VEGF-D组,下游蛋白AKT、ERK和e NOS磷酸化程度明显减弱。结论:运用VEGFR-3抑制剂MAZ-51能够减少肠系膜动脉内皮细胞的VEGFR-3信号下游磷酸化AKT、ERK、e NOS的表达。
彭滔[4]（2019）在《GATA6/LOXL2复合体以及MACC1促进胆管癌血管生成的机制研究》文中研究指明研究背景:胆管癌（CCA）是仅次于肝细胞癌的第二常见肝胆系统肿瘤,预后差,其总体发病率在世界范围内呈上升趋势。对于早期CCA患者,手术切除是首选的治疗方案,但只有部分患者（约35%）适合于具有疗效的外科切除。因此,更好地深入了解CCA的分子特征和生物学行为将有助于寻找新的分子靶点治疗CCA。血管生成是由已有的血管系统形成新的血管过程,已成为恶性肿瘤的一个公认标志。肿瘤通过生成的血管提供营养和氧气维持迅速的生长和转移。血管内皮生长因子A（VEGFA）在肿瘤血管生成中起着关键作用,并与许多实体癌的肿瘤血管密度有关。高微血管密度（MVD）的实体瘤患者比低微血管密度的实体瘤患者生存期短。抗血管生成治疗已被临床应用于各种实体瘤,包括CCA。尽管如此,抗血管生成治疗对癌症的临床疗效仍不令人满意,而且临床副作用、细胞毒性、耐药和患者复发率均较高。因此,迫切需要理解血管生成的新机制。GATA结合蛋白6（GATA6）是GATA结合蛋白家族的一员,包含两个高度保守的含锌指转录因子。在胚胎发育期间GATA6对心血管系统、消化系统和其他组织的增殖、分化和发育至关重要。肿瘤发生与胚胎期基因激活密切相关,GATA6的过度表达可促进胃癌、结直肠癌、乳腺癌以及胆管癌的进展。一些研究表明GATA6与肿瘤血管生成有关,但其分子机制尚未研究。赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL2）是细胞外基质（ECM）修饰酶LOX家族的成员,其家族包括原型LOX和四种不同的LOX样蛋白（LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4）。LOXL2的C端区域负责其酶活性,N端包含四个富含半胱氨酸结构域的清道夫受体（SRCR）,这些区域被认为与蛋白质-蛋白质相互作用有关。已有研究表明,核内LOXL2可与某些转录因子协同调节上皮间质转换（EMT）,促进肿瘤转移。此外,靶向抑制LOXL2可降低肿瘤和眼科疾病的血管生成。然而,在CCA中LOXL2的血管生成机制尚未研究。结肠癌转移相关基因1（MACC1）在2009年首次通过全基因组在人类结肠癌组织和转移组织中搜索差异表达的基因而被发现。既往已有报道,MACC1 mRNA表达可能是结直肠癌、肺腺癌、胰腺癌、肝门部胆管癌复发及无病生存的独立预后指标。MACC1通过肝细胞生长因子（HGF）/c-Met/MAPK信号通路促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭性。先前的研究表明MACC1参与胃癌和宫颈癌的血管生成。然而,MACC1与CCA中血管生成的相关性尚未被研究。在我们的第一部分研究中,我们使用生物信息学分析表明GATA6可能与VEGFA的启动子区域结合。我们证实了GATA6转录调控了VEGFA的表达,并阐明了一种新的CCA血管生成机制,LOXL2与GATA6结合,上调VEGFA的表达,促进血管生成和肿瘤生长。在第二部分研究中,我们也发现CCA中MACC1和VEGFA显着上调,并且MACC1和VEGFA表达水平呈正相关,我们进一步证实了MACC1调控VEGFA的表达和分泌,促进了CCA细胞的血管生成。研究方法:第一部分1.分析TCGA和GEO数据库中GATA6和LOXL2的mRNA表达,以及与VEGFA的相关性。2.收集2013年至2016年西南医院手术切除91例CCA和31例癌旁患者的样本。这些患者术前或术后均未接受放疗或化疗。通过中国芯超公司将91例癌组织和31例癌旁石蜡样品组织制作成组织芯片（TMA）,采用免疫组化方法分析GATA6、LOXL2、VEGFA和MVD（CD34）在TMA上的表达水平。3.采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析GATA6/LOXL2表达与总生存率和无病生存率之间的相关性。在TMA中分析了GATA6/LOXL2表达与VEGFA表达和MVD的相关性。4.实时定量qPCR和Western Blotting检测干预GATA6和LOXL2表达后对VEGFA的影响。用激光共聚焦扫描显微镜检测GATA6和LOXL2在胆管癌细胞的共定位。采用免疫共沉淀法（Co-IP）分析了GATA6与LOXL2的相互作用。采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀法（ChIP）分析了GATA6与LOXL2转录激活VEGFA。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测VEGFA的分泌水平。通过基质胶血管形成实验检测对血管生成的影响。5.我们构建了两个缺失或保留SRCR结构域的LOXL2缺失突变体（Flag-LOXL2-Δ1:删除氨基酸548-774;Flag-LOXL2-Δ2:删除氨基酸1-547）和全长LOXL2（Flag-LOXL2-full）,以进一步探讨LOXL2和GATA6之间的相互作用位点。Co-IP实验检测不同的LOXL2突变体与GATA6的相互作用,并用双荧光素酶报告基因检测不同的LOXL2突变体对VEGFA启动子活性影响。6.我们利用裸鼠皮下肿瘤进一步验证GATA6/LOXL2复合体对VEGFA的调控及对血管生成、肿瘤生长的影响。通过手术切除皮下肿瘤,然后进行测量。肿瘤切片后行苏木精-伊红（HE）和IHC染色。第二部分1.TCGA（网址:https://cancergenome.nih.gov/）和GEO（网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的数据,进入编号:GSE76297,GSE89749,数据库是免费公开下载的。比较CCA组织与正常组织间MACC1和VEGFA的mRNA表达差异,并分析MACC1与VEGFA表达的关系2.2010年至2016年在西南医院肝胆外科接受手术的122例CCA患者中,有31例癌旁组织标本。2018年手术中获得7例成对的CCA和癌旁组织,并立即保存在液氮中。所有患者均未接受新辅助化疗或肝移植。采用real-time qPCR和Western blot技术检测7对CCA中MACC1和VEGFA的表达水平。采用免疫组织化学方法（IHC）检测石蜡包埋CCA样品中MACC1、VEGFA和MVD（CD34）的表达水平。3.采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析MACC1和VEGFA表达与总生存率的关系,分析MACC1表达与VEGFA表达及MVD的关系。4.采用real-time qPCR和Western blot检测干预MACC1表达对VEGFA的影响。通过共聚焦激光扫描显微镜检测MACC1和VEGFA表达的定位。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测VEGFA的分泌水平。HUVECs成管实验分析各组血管腔形成的差异。研究结果:第一部分1.数据中分析发现GATA6和LOXL2的mRNA表达在胆管癌中上调,并且与VEGFA的表达相关。2.免疫组化分析表明GATA6主要在细胞核表达,而LOXL2在细胞核和细胞质中均都表达。两种蛋白染色方法的评分只计算核内表达。在TMA中所有癌旁标本的胆管上皮GATA6、LOXL2和VEGFA染色均为阴性。在TMA中的癌组织,38例GATA6和LOXL2弱阳性或强阳性样本定义为双阳性,标记为GATA6/LOXL2阳性;28例定义为双阴性,标记为GATA6/LOXL2阴性。VEGFA表达在细胞浆中。免疫组化观察到VEGFA阳性表达（35/66）和阴性表达（31/66）。CD34在血管内皮细胞中表达并标记MVD。在38个GATA6/LOXL2阳性和28个GATA6/LOXL2阴性染色样本中,MVD的平均值（定义为截止值）为23.69/mm2。免疫组化观察到高MVD（40/66）和低MVD（26/66）。3.Kaplan-Meier分析显示,与GATA6/LOXL2阴性的CCA患者相比,GATA6/LOXL2阳性的CCA患者总生存率更差（log rank P=0.01）,无病生存率更短（log rank P=0.02）。利用Cox回归分析评估年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期和GATA6/LOXL2表达的危险比（HRs）,我们观察到GATA6/LOXL2的表达是总生存率和无病生存率的独立预测因子（HR=1.871,95%CI=1.070-3.271,P=0.028;HR=1.781,95%CI=1.013-3.129,P=0.045）。另外,TNM期（ⅢⅣ）是总生存率和无病生存率的另一个独立预测因子（HR=2.333,95%CI=1.3114.150,P=0.004;HR=1.861,95%CI=1.0533.291,P=0.033）。在TMA中的同一样本,我们观察到38个GATA6/LOXL2阳性组织中有25个（65.8%）VEGFA阳性组织,27个（71.1%）高MVD组织。因此,GATA6/LOXL2与VEGFA（P=0.02）和MVD（P=0.04）呈正相关。4.细胞实验表明GATA6和LOXL2敲除可显着降低QBC939细胞中的VEGFA蛋白水平,GATA6和LOXL2过表达可增加RBE细胞中的VEGFA蛋白水平。在CCA细胞中也观察到相同的mRNA水平变化。共聚焦激光扫描显微镜检测表明,GATA6位于细胞核内,LOXL2位于细胞核和细胞质内。这些结果与CCA组织的IHC结果一致。免疫共沉淀实验证实了GATA6和LOXL2在CCA细胞系中相互结合,通过这种相互作用转录调节VEGFA的表达和分泌,促进了血管的形成。5.基于Co-IP实验结果,在CCA细胞中,GATA6与LOXL2的SRCR结构域结合不依赖于催化结构域。并且,Flag-LOXL2-Δ1和Flag-LOXL2-full增加了VEGFA启动子活性;然而,LOXL2-Δ2没有增加VEGFA启动子活动。此外,QBC939细胞中GATA6或LOXL2的下调降低了LOXL2与GATA6的相互作用。基于这些结果,说明LOXL2的SRCR域与GATA6相互作用,增加VEGFA启动子活性。6.体内分析进一步验证了GATA6/LOXL2可促进VEGFA的表达、血管生成和肿瘤生长。第二部分1.与正常对照组织相比,数据集中CCA组织和配对的癌旁组织中MACC1和VEGFA显着上调。在TCGA、GSE76297和GSE89749数据集中,MACC1与VEGFA显着相关。2.与癌旁组织比较,7例冰冻CCA组织中MACC1和VEGFA的蛋白和mRNA水平均升高。免疫组化显示,CCA患者中,MACC1高表达和VEGFA高表达分别为53.3%（65/122）和54.9%（67/122）。MACC1/VEGFA共同高表达43例,MACC1/VEGFA共同低表达33例。然而,所有31例癌旁组织中MACC1和VEGFA均为低表达。122例CCA患者中,高MVD 56例（45.9%）,低MVD 66例（54.1%）。3.Kaplan-Meier分析显示,MACC1和VEGFA的高表达与总生存率降低显着相关（log-rank P<0.01和P<0.05）。MACC1-高/VEGFA-高表达组的总体生存率也低于MACC1-低/VEGFA-低表达组（log-rank P<0.001）。Cox回归分析显示,MACC1和淋巴结转移是CCA患者总体生存的独立预测因子。高MACC1表达的CCA组织中有66.2%（43/65）高表达VEGFA（P<0.01）,高MACC1表达的CCA组织中有60%（39/65）高MVD。4.激光共聚焦扫描显微镜显示,MACC1和VEGFA在胞质和细胞核中均有表达。Western blotting和real-time qPCR证实敲除MACC1可显着下调两种CCA细胞系VEGFA的蛋白和mRNA表达。ELISA结果表明,MACC1敲除显着降低了VEGFA的分泌水平。HUVECs成管实验显示,在两组CCA细胞中,MACC1敲低组的条件培养基的成管数均显着低于对照组（P<0.01和P<0.01）。研究结论:总之,我们的研究证明了一种新的分子机制,即LOXL2和GATA6相互作用促进血管生成,复合体结合在VEGFA的启动子区域从而增强VEGFA的表达,促进了血管生成以及促进肿瘤生长。小分子细胞渗透性抑制剂治疗CCA以及患者分层的预后标记候选可能具有很大的价值。除此之外,我们也发现CCA中MACC1和VEGFA表达上调,而MACC1和VEGFA的高表达预示着较差的生存率,并且MACC1是一个独立的生存预测因子,通过上调VEGFA促进CCA血管生成。
邓文升[5]（2018）在《环氧二十碳三烯酸对大鼠门脉高压症的作用机制研究》文中认为第一部分:门脉高压症大鼠模型制备目的:制备稳定可靠的门脉高压症（PHT）大鼠模型。方法:部分门静脉结扎（PPVL）和CCl4诱导大鼠PHT模型。结果:CCl4有明显的肝硬化,门静脉压力增高,平均动脉压降低,内脏血管稍有曲张;PPVL造模大鼠肝脏硬化不明显,门静脉压力增高,平均动脉压降低,内脏血管增粗、曲张严重。结论:两种造模方法均可靠,PPVL适合研究门高压内脏循环,而CCl4模型适合研究肝内病变。第二部分:环氧二十碳三烯酸（EETs）在大鼠门脉高压症中的作用目的:探索EETs对PHT大鼠的作用。方法:采用EETs水解酶可溶性环氧化物水解酶抑制剂t-TUCB处理CCl4诱导的PHT大鼠;检测血液动力学指标与肝纤维化程度。结果:t-TUCB处理后后,PHT大鼠体内EETs含量增加,门静脉压力和肝纤维化程度均降低。结论:EETs可缓解大鼠PHT和肝硬化程度。第三部分:EETs改善大鼠肝硬化PHT的机制目的:探索EETs改善大鼠肝硬化PHT的机制。方法:肝窦内皮细胞功能、肝组织e NOS和NF-κB表达。结果:t-TUCB处理组PHT大鼠肝窦内皮细胞功能好转,磷酸化e NOS和NO含量增加,NF-κB胞浆内表达增加而核内表达降低。结论:EETs通过上调e NOS/NO信号通路增强肝窦内皮细胞功能,并通过抑制NF-κB信号通路缓解肝纤维化,降低PHT大鼠门静脉压力。第四部分:NOX1/4在大鼠门脉高压症中的作用目的:探讨NADPH在大鼠门脉高压症中的作用。方法:使用NOX1/4抑制剂GKT137831处理PPVL造模的PHT大鼠,检测大鼠的门脉压力、心输出量、门静脉血流,门体分流率和门静脉血流阻力。结果:GKT137831降低PPVL大鼠的门脉压力、心输出量、门静脉血流,门体分流率,增加了门静脉血流阻力。结论:抑制NOX1/4可有效改善PHT大鼠门脉高压症。第五部分:抑制NOX1/4改善大鼠门脉高压症的机制目的:探索抑制NOX1/4改善大鼠PHT的机制。方法:检测PHT大鼠肠系膜动脉的收缩性、AKT/e NOS磷酸化水平以及肠系膜组织血管增生标志蛋白的表达。结果:GKT137831增强了PHT大鼠肠系膜动脉的收缩性,降低动脉AKT/e NOS磷酸化,也降低血管增生标志蛋白的表达。结论:GKT137831通过抑制内脏血管增生和增强肠系膜动脉收缩性,最终改善PHT大鼠门脉高压症。
王丽娜[6]（2011）在《不同门脉高压模型犬的舌下络脉特征及其形成机制研究》文中指出研究背景舌诊是中医独具特色的诊法之一,为临床诊断不可或缺的依据。舌下络脉作为中医舌诊的重要组成部分,因其显露易见,成为观察人体气血、津液盈亏和瘀血的重要指征。近年来在心血管病、消化系统疾病、糖尿病及恶性肿瘤等的中医诊治中得到广泛应用。课题组在长期原发性肝癌的中西医结合临床中发现,肝癌患者多伴有舌下络脉的扩张、迂曲等形态及青紫、绛紫等颜色变化,这种变化非常灵敏,且多与患者的病情进展和治疗预后明显相关。根据传统中医理论,肝通过其经络直接与舌相连,故肝的异常可在舌上出现相应的改变。但对于异常舌下络脉形成的分子机制,目前尚鲜有报道,对肝癌异常舌象的研究就更少之又少。既往研究认为,异常舌下络脉形成可能与舌的静脉压力升高有关,但我们工作中注意到肝癌患者伴有门静脉压增高者更易出现舌下络脉异常,通过对肝癌患者的舌下络脉变化与肝门脉血管及其局部血液动力学指标的检测也证实了二者存在密切的关系。另有学者通过临床研究证实,门脉高压症患者的舌下络脉曲张率高达100%。在此基础上,我们提出了“舌下络脉和肝门静脉作为人体静脉血管系统的组成部分,二者在病理上必然存在密切的内在联系”这一假说。而门脉高压的形成存在肝外阻塞、肝内阻塞和肝外肝内复合阻塞三种类型,不同的门脉高压形成机制是否会导致舌下络脉的的不同的变化。继续的临床观察注意到肝癌伴有的肝硬化病理可以引起舌下络脉的颜色及性状异常,而如果患者门脉高压系继发于门脉血管受到肿瘤侵犯之后（门脉癌栓）,其舌下络脉更具有根底部粗张迂曲、络脉周围瘀血细络增多,出现新的小血管等自身特点,这很难简单地用门静脉压力增高引起舌下络脉被动扩张来完整解释,进一步提示不同门脉高压的形成机制,同样引起了舌下络脉构型上的多样性。而且,引起二者舌下络脉构型差异的背后必然存在着并不完全一致的分子机制。成体中血管的形成主要依赖于生理性和病理性的血管生成机制,近年来许多研究也已证实,在门静脉高压症过程中,肺脏和脾脏中均存在血管生成现象。舌下络脉作为全身静脉的一部分,其异常改变极可能与机体的血管生成现象存在内在联系。因此我们设想根据“血管生成”理论,重点从血管生成的角度,探讨不同门脉高压模型异常舌下络脉形成的可能分子机制。许多分子在血管生成中起着正向调节作用,血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）是近年来发现的参与血管生成的最主要的分子。缺氧反应、机械应力等多种机制均可通过激活VEGF/VEGFR信号通路调节血管生成。新近研究发现,脂肪炎症因子及其受体Apelin/APJ通路的调节与血管生成也有密切联系,可能与VEGF/VEGFR信号通路存在“串话”并起到协同作用,可以看作是治疗门脉高压新的靶点。研究目的本研究通过复制肝前型、肝内型、复合型三种门脉高压犬模型,观察模型犬舌下络脉的整体和微观变化,并从血管生成的角度,重点探寻VEGF/ VEGF2型受体（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2）及Apelin/APJ信号通路与异常舌下络脉形成之间的关系,为揭示异常舌下络脉形成的分子机制提供数据支持。研究方法（1）三种门脉高压犬模型的制备将Beagle犬随机分为正常组、假手术组和模型组。以门静脉窄缩术复制肝前型门脉高压模型;以二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine,DMN）连续给药诱导肝硬化制备肝内型门脉高压犬模型;以上两种方法结合复制复合型门脉高压模型。经皮下留置针以生物电记录系统连续监测其门脉压力通过血清肝功能测定和肝脏组织病理学观察进行成模检测。（2）三种门脉高压模型犬舌下络脉的特征观察检测成模后,肉眼观察舌下络脉形态和颜色变化;游标卡尺测量舌底根部络脉宽度;动物处死后,取舌底组织,免疫组织化学显色法检测舌底组织毛细血管密度;透射电镜观察舌下络脉的内皮细胞形态学变化。（3）三种门脉高压模型犬异常舌下络脉的形成机制研究硝酸还原酶法检测血清一氧化氮（nitric oxide, NO）浓度;Elisa法检测血清VEGF及其VEGFR2、缺氧诱导因子1α（Hypoxia-induciable factor 1-α, HIF-1α）浓度;免疫组织化学显色法和Western blot法检测犬舌下VEGF、VEGFR2、HIF-1α、Apelin、APJ蛋白表达;Real-time PCR法检测VEGF、VEGFR2、HIF-1αmRNA的表达量。结果（1）三种门脉高压犬模型的制备与假手术组比较,肝内型组和复合型组各实验犬在DMN诱导2周门静脉压力即开始升高（P<0.05）,随实验进展模型组门静脉压力在4周、6周、8周呈阶梯状上升（P<0.01）,8周后肝内型组门脉压力持续稳定,复合型组在进一步行门脉窄缩术后压力进一步升高（P<0.01）;肝前型组在行门脉窄缩术后,门脉压力迅速升高达峰值后逐渐下降后,处死前仍然处于较高水平（P<0.01）。另外,与正常组和假手术组比较,三个模型组实验犬的的肝脏组织学和（或）肝功能出现不同程度的异常改变,显示模型复制成功。（2）三种门脉高压模型犬舌下络脉的特征观察肉眼观察发现,肝内型门脉高压组和复合型组模型犬舌下络脉形态较正常组和假手术组迂曲粗大,血管周围出现瘀点和细络,颜色变暗变紫,舌根部络脉直径明显增粗（P<0.01）,肝前型门脉高压组犬仅络脉颜色变暗,舌根部络脉直径增粗不明显;与正常组和假手术组比较,免疫组化结果显示三个模型组实验犬舌底CD31表达均显着增加（P<0.01）,以复合型组增加最为明显;透射电镜显示,三个模型组实验犬血管壁全部或局部增厚,管腔变小,出现新的毛细血管,内皮细胞膜界限不清,细胞核损失甚或消失,复合型组改变程度最重,肝内组次之,肝前型组改变较小。（3）三种门脉高压模型犬异常舌下络脉的形成机制研究与正常组和假手术组比较,三种模型组实验犬血清NO浓度明显升高（P<0.01）;肝内型组和复合型组血清VEGF、HIF-1α浓度明显升高（P<0.01）,肝前型组升高不明显;三种模型组实验犬舌底组织VEGF、VEGFR2、HIF-1α蛋白表达均显着升高（P<0.05）,趋势为复合型组>肝内型组>肝前型组;舌底组织VEGF、VEGFR2、HIF-1α的mRNA表达量也较正常组和假手术组明显升高,趋势与蛋白表达一致;Apelin、APJ蛋白表达也较正常组和假手术组明显升高（P<0.05）,以复合型组表达增多最为明显,肝内型次之,肝前型升高较小。结论肝前型、肝内型、复合型三种门脉高压模型犬舌下络脉均从宏观和微观方面出现相应的改变,肝内阻塞因素所致的门静脉压力升高可能是导致其异常改变形成的一个重要因素,而肝外阻塞又往往成为诱发络脉变化加重的因素;VEGF及Apelin诱导的血管生成参与了模型犬异常舌下络脉的形成,分别与HIF-1α/ VEGF/ VEGFR2/ NO及Apelin/APJ通路诱导的血管生成密切相关,这可能是其舌下络脉血管重建的重要机制之一。
李涛[7]（2006）在《体外培育牛黄复方制剂抗血吸虫病家兔肺纤维化的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:通过观察血吸虫病家兔吡喹酮对照组和体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的病理学改变和FN、LN、c-fos、ERK1/2在血吸虫病家兔吡喹酮对照组和体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织中的表达,从而探讨体外培育牛黄复方制剂对血吸虫性肺纤维化形成的抑制性作用及其机制,为临床抗肺纤维化开拓一种新的药物选择。方法:采用光镜和电镜方法观察20例血吸虫病家兔毗喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的形态学改变;用免疫组化技术检测20例血吸虫病家兔吡喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的FN、LN、c-fos的表达。用Western Blot技术检测20例血吸虫病家兔吡喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的ERK1/2的表达。结果:光镜下可见血吸虫病家兔毗喹酮对照组肺组织呈肺泡渗出液较多,体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织呈肺泡腔较干燥;电镜下可见血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织呈肺泡腔渗出液较多,可见较多巨噬细胞,肺泡毛细血管扩张,毛细血管三层屏障结构模糊,体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织部分区域肺泡间隙纤维轻微增多,Ⅰ型上皮、基底膜、内皮结构基本完整,肺泡腔无明显渗出,血管无充血;血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织FN、LN、c-fos表达呈阳性或强阳性,体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织FN、LN、c-fos则呈阴性或弱阳性表达。血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织ERK1/2表达强度明显高于体外培育牛黄复方制剂干预组（P<0.01）结论:体外培育牛黄复方制剂能够有效预防血吸虫性肺纤维化,降低细胞外基质含量;它是通过改善肺微循环来抑制肺纤维化的形成。粘连蛋白,肺微循环,细胞外信号调节激酶,c-fos第一部分体外培育牛黄复方制剂抗血吸虫病家兔肺纤维化的病理组织学研究目的探讨体外培育牛黄复方制剂对血吸虫病家兔肺纤维化病理组织学的影响。方法采用光镜和电镜方法观察20例血吸虫病家兔吡喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的形态学改变。结果光镜下可见血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织呈肺泡渗出液较多,体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织呈肺泡腔较干燥;电镜下可见血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织呈肺泡腔渗出液较多,可见较多巨噬细胞,肺泡毛细血管扩张,毛细血管三层屏障结构模糊,体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织部分区域肺泡间隙纤维轻微增多,Ⅰ型上皮、基底膜、内皮结构基本完整,肺泡腔无明显渗出,血管无充血;结论体外培育牛黄复方制剂可以明显减轻血吸虫病肺纤维化病理形态学改变程度,对肺纤维化有治疗作用。第二部分体外培育牛黄复方制剂对血吸虫病家兔肺纤维化细胞外基质表达的影响目的探讨体外培育牛黄复方制剂对血吸虫病家兔肺纤维化FN、LN和胶原的表达的影响。方法用免疫组化技术检测20例血吸虫病家兔吡喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的FN、LN的表达。用Mallory三色染色技术检测20例血吸虫病家兔吡喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织胶原表达。结果血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织FN、LN表达呈阳性或强阳性,胶原表达增多,体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织FN、LN则呈阴性或弱阳性表达,胶原表达下降。结论体外培育牛黄复方制剂可以通过抑制FN、LN及胶原的表达,降解细胞外基质,保护和减轻血吸虫病对肺纤维化程度,对肺纤维化有治疗作用。第三部分体外培育牛黄复方制剂对血吸虫病家兔肺纤维化ERK,/2及c-fos表达的影响目的探讨体外培育牛黄复方制剂对血吸虫病家兔肺纤维化ERK1/2及c-fos表达的影响。方法用免疫组化技术检测20例血吸虫病家兔吡喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的c-fos的表达;用Western Blot技术检测20例血吸虫病家兔毗喹酮对照组和20例体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织的ERK1/2的表达。结果血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织c-fos表达呈阳性或强阳性,体外培育牛黄复方制剂干预组肺组织c-fos则呈阴性或弱阳性表达;血吸虫病家兔吡喹酮对照组肺组织ERK1/2表达强度明显高于体外培育牛黄复方制剂干预组(P<0.01结论体外培育牛黄复方制剂可以通过抑制ERK1/2及c-fos的表达,保护和减轻血吸虫病对肺纤维化程度,对肺纤维化有治疗作用。
李涛,杨镇[8]（2005）在《门脉高压性血管病变研究进展》文中进行了进一步梳理门静脉高压症属于血管性疾病,其病变部位不仅在肝内, 而且肝外门脉系统、体循环及肺循环的血管亦有结构和功能的变化.国内学者在长期的动物实验和临床实践中发现, 随着门静脉压力的升高,内脏血管可发生明显的病理改变, 如广泛的门体交通支形成和内脏大动脉、静脉的构型改建等,将其称为门静脉高压性血管病变.广义上说,血管病变还包括内脏,特别是胃、肠的微血管病变,称为门脉高压性胃病和门静脉高压性肠血管病变,主要以血管改变为基本病变,可引起便血、大便隐血或消化道大出血.门静脉高压还可合并肺血管病变,从而产生肺动脉高压和肺静脉高压.引起肺动脉高压的原因可能是血管活性物质经侧支循环到达肺部,亦可能是肺本身产生血管活性物质,从而造成肺的小动脉和动脉发生不可逆性的损伤.肺静脉高压可导致肺、气管、支气管静脉曲张,曲张静脉破裂后可引起咯血.
林德新[9]（2004）在《门静脉高压症患者脾动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的研究》文中研究说明目的 检测门静脉高压症患者脾动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的相关调控基因的表达状况,探讨其对脾动脉构型改建的调节以及对门脉高压症内脏高动力循环的影响。方法 应用光学显微镜、透射电镜和免疫组织化学法分别对21例门静脉高压症患者脾动脉（实验组）和7例正常血管（对照组）的平滑肌细胞进行细胞形态学观察和Ki-67、Bax及Bcl-2蛋白的检测。结果 门静脉高压症患者脾动脉管径增大,管壁变硬,内皮细胞受损,内膜明显增厚,内膜下间隙有大量平滑肌细胞和纤维结缔组织。中膜平滑肌细胞增厚,并迁至内膜增殖。内弹性膜和中膜弹性纤维被拉直、断裂和分层。电镜下可见平滑肌细胞变性、萎缩和凋亡,部分平滑肌细胞的表型由收缩型向合成型转变。Ki-67、Bax和Bcl-2在门静脉高压症患者脾动脉平滑肌细胞中阳性表达的细胞数占总细胞数分别为（35.82±11.17）%,（32.23±11.05）%和（8.80±4.51）%。分别与正常对照组（2.41±2.42）%,（1.53±2.32）%和（2.22±1.95）%比较,差异有显着性（P﹤0.01）。结论 门静脉高压症患者脾动脉平滑肌细胞可发生增殖与凋亡,增殖与凋亡共同参与并调节了脾动脉构型改建,使其收缩结构破坏和对缩血管活性物质反应性下降,可能是造成内脏高动力循环的原因之一。
曾金华[10]（2003）在《门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的研究》文中指出目的:观察门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞凋亡及相关基因表达,探讨其对门脉高压症时内脏高动力循环形成的作用。方法:采用原位DNA片断末端标记（TUNEL）法和免疫组织化学法,检测28例门脉高压症患者脾静脉和12例正常血管的平滑肌细胞凋亡及其相关基因Bax、Bcl-2的表达。结果:门脉高压症患者脾静脉平滑肌细胞TUNEL-阳性细胞数为（24.3±2.6）％,正常对照组仅为（0.8±0.2）％,差异有显着性意义（P<0.01）,Bax与Bcl-2阳性表达率分别为（22.06±3.2）％和（18.61±2.0）％,与对照组均为阴性比较（P<0.01）。结论:门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞可产生凋亡,Bax和Bcl-2蛋白参与血管平滑肌细胞凋亡的调节,凋亡与增殖失衡导致血管结构重塑,促进门脉高压症时内脏高动力循环的形成和发展。
二、门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的研究（论文提纲范文）
（1）血竭素高氯酸盐通过内质网应激诱导肝细胞癌凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肝细胞癌流行病学概述 |
| 1.2 肝细胞癌的治疗现状 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 外科及介入治疗 |
| 1.2.3 临床系统药物治疗 |
| 1.3 内质网应激在肝细胞癌中的多重调控作用 |
| 1.3.1 内质网应激概述 |
| 1.3.2 内质网应激与肿瘤 |
| 1.3.3 内质网应激与肝癌 |
| 1.4 血竭素高氯酸盐的研究现状 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验器材及试剂 |
| 2.1.1 实验器材 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 体外实验用血竭素高氯酸盐溶液配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞活力检测实验 |
| 2.2.4 荧光显微镜细胞核形态检测 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测线粒体膜电势(MMP) |
| 2.2.7 电子显微镜检测细胞器形态 |
| 2.2.8 RNA-seq |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.10 裸鼠皮下肝癌移植瘤模型建立及相关实验 |
| 2.2.11 提取细胞总蛋白 |
| 2.2.12 Westen blot法检测细胞及组织蛋白变化 |
| 2.2.13 HE染色观察组织结构 |
| 2.2.14 TUNEL凋亡检测 |
| 2.2.15 免疫组化检测 |
| 2.2.16 统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 血竭素高氯酸盐对人肝癌细胞及正常肝细胞的影响 |
| 3.1.1 MTT法检测显示血竭素高氯酸盐使人肝癌细胞系细胞活力显着下降 |
| 3.1.2 MTT法检测显示血竭素高氯酸盐对人正常肝细胞的细胞毒性明显小于人肝癌细胞系 |
| 3.1.3 荧光显微镜下发现血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞发生凋亡改变 |
| 3.1.4 凋亡抑制剂Z-VAD-FMK逆转血竭素高氯酸盐对肝癌细胞的抑制 |
| 3.1.5 流式细胞仪定量检测血竭素高氯酸盐诱导的细胞凋亡 |
| 3.1.6 血竭素高氯酸盐引起肝癌细胞凋亡蛋白改变 |
| 3.2 基于转录组测序探究血竭素高氯酸盐对肝细胞癌产生的生物过程改变 |
| 3.2.1 测序基因质量控制 |
| 3.2.2 差异基因分析 |
| 3.2.3 基于差异基因的GO富集分析 |
| 3.2.4 基于基因表达矩阵的信号通路富集分析 |
| 3.2.5 qRT-PCR验证 |
| 3.3 电子显微镜观察血竭素高氯酸盐诱发肝癌细胞形态学改变 |
| 3.4 血竭素高氯酸盐可诱导肝癌细胞发生线粒体途径凋亡 |
| 3.4.1 血竭素高氯酸盐诱导线粒体途径凋亡标志性蛋白上调 |
| 3.4.2 流式细胞仪检测提示血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞线粒体膜电势降低 |
| 3.5 血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞内质网应激 |
| 3.5.1 血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞内质网应激相关蛋白改变 |
| 3.5.2 4-PBA减轻血竭素高氯酸盐对的肝癌细胞的毒性 |
| 3.5.3 4-PBA逆转血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞凋亡 |
| 3.5.4 4-PBA逆转血竭素高氯酸盐诱导的线粒体膜电势降低 |
| 3.5.5 4-PBA逆转血竭素高氯酸盐诱导的线粒体途径凋亡蛋白改变 |
| 3.6 mTORC1 信号通路在血竭素高氯酸盐诱导细胞凋亡中的作用 |
| 3.6.1 血竭素高氯酸盐上调肝癌细胞内mTORC1 信号通路相关蛋白 |
| 3.6.2 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的肝癌细胞毒性 |
| 3.6.3 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的内质网应激通路激活 |
| 3.6.4 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的细胞凋亡 |
| 3.6.5 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的线粒体膜电势降低 |
| 3.7 血竭素高氯酸盐在体内对肝癌移植瘤小鼠的影响 |
| 3.7.1 血竭素高氯酸盐抑制肝癌移植瘤生长 |
| 3.7.2 血竭素高氯酸盐对移植瘤小鼠重要脏器无明显毒性作用 |
| 3.7.3 HE染色提示血竭素高氯酸盐影响肝癌移植瘤组织结构 |
| 3.7.4 TUNEL染色检测肿瘤组织凋亡 |
| 3.7.5 免疫组化发现血竭素高氯酸盐诱导肝癌移植瘤p-4EBP1、p-PERK及 CHOP表达上调。 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）益气活血方有效成分抑制巨噬细胞氧化亢进，防治门脉高压症的药理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 巨噬细胞参与大鼠门脉高压 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结果 |
| 5 参考文献 |
| 实验二 益气活血方有效成分防治门脉高压的药效 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 实验三 益气活血方有效成分抑制巨噬细胞氧化亢进防治门脉高压药理 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述一 脂质体研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 门脉高压发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 益气活血方有效成分防治门脉高压药理作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）血管重构在门脉高压症中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 第一部分:门静脉高压症与动脉重构 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料、试剂和实验仪器 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 实验数据统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 肝硬化PHT组大鼠造模 |
| 1.2.2 非肝硬化PHT组大鼠造模 |
| 1.2.3 肝硬化PHT组大鼠存在肠系膜动脉重构表型 |
| 1.2.4 非肝硬化PHT组大鼠无肠系膜动脉重构表型 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分:门静脉高压症动脉重构的结构表现 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料、试剂和实验仪器 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 实验数据统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 磷酸化 e NOS在肝硬化 PHT大鼠肠系膜动脉中表达增多 |
| 2.2.2 电镜检测大鼠肠系膜动脉结构异常 |
| 2.2.3 钙调蛋白在肝硬化PHT大鼠肠系膜动脉中表达减少 |
| 2.2.4 弹性蛋白在肝硬化PHT大鼠肠系膜动脉中表达减少 |
| 2.2.5 平滑肌肌动蛋白在肝硬化PHT大鼠肠系膜动脉中表达减少 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分:VEGFR-3 与门静脉高压症动脉重构 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料、试剂和实验仪器 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 实验数据统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 肝硬化PHT组大鼠SMA上 VEGFR-3 表达增多 |
| 3.2.2 肝硬化PHT组大鼠SMA上增殖信号表达增多 |
| 3.2.3 肝硬化PHT组大鼠SMA上凋亡信号表达增多 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四部分:抑制VEGFR-3 与门静脉高压症动脉重构 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料、试剂和实验仪器 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 实验数据统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 MAZ-51 对肝硬化PHT大鼠血流动力学无明显改变 |
| 4.2.2 MAZ-51 改善肝硬化PHT大鼠SMA重构 |
| 4.2.3 MAZ-51 对肠系膜动脉VEGFR-3 表达无明显改变 |
| 4.2.4 MAZ-51 抑制SMA平滑肌细胞凋亡 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五部分:VEGFR-3 信号通路与门静脉高压症动脉重构 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料、试剂和实验仪器 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.1.4 实验数据统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 时间梯度VEGF-D刺激肠系膜动脉EC下游磷酸化表达增加 |
| 5.2.2 浓度梯度VEGF-D刺激肠系膜动脉EC下游磷酸化表达增加 |
| 5.2.3 运用VEGFR-3 抑制剂MAZ-51 刺激肠系膜动脉EC下游磷酸化表达减少 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（4）GATA6/LOXL2复合体以及MACC1促进胆管癌血管生成的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| abstract |
| 中文摘要 |
| 第一部分 GATA6/LOXL2 复合体促进胆管癌血管生成的机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 数据库中分析GATA6和LOXL2 在胆管癌中的表达以及与VEGFA的相关性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 GATA6/LOXL2 的表达与胆管癌患者临床病理特征的相关性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 GATA6/LOXL2 复合体转录调控VEGFA的表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 GATA6/LOXL2 复合体上调VEGFA分泌促进胆管癌血管生成 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 本部分总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MACC1 促进胆管癌血管生成的机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 分析MACC1和VEGFA在胆管癌中表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 分析MACC1和VEGFA的表达与病人预后的关系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MACC1 上调VEGFA的表达并促进血管生成 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 本部分总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)与疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）环氧二十碳三烯酸对大鼠门脉高压症的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分:门脉高压症大鼠模型制备 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分：EETs 在大鼠门脉高压症中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分:EETs 改善大鼠肝硬化门脉高压症的机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分:NOX1/4 在大鼠门脉高压症中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五部分:抑制 NOX1/4 改善大鼠门脉高压症的机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士学习期间发表文章与申请课题 |
（6）不同门脉高压模型犬的舌下络脉特征及其形成机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 不同门脉高压犬模型的制备及其门脉高压特点 |
| 一 实验材料 |
| （一） 实验动物 |
| （二） 药品与试剂 |
| （三） 主要仪器 |
| 二 实验方法 |
| （一） 动物分组 |
| （二） 模型制备 |
| 1、肝内型门脉高压犬模型的制备 |
| 2、肝前型门脉高压犬模型的制备 |
| 3、复合型门脉高压犬模型的制备 |
| 4、假手术组 |
| 5、正常组 |
| （三） 观测指标与方法 |
| 1、各组实验犬门静脉压力测定 |
| 2、观测样品的采集与处理 |
| 3、肝组织病理学观察 |
| 4、血清肝功能测定 |
| （四） 统计学方法 |
| 三 实验结果 |
| （一） 各组实验犬的一般情况 |
| （二） 各组实验犬门脉压力的变化 |
| （三） 各组实验犬肝组织病理变化 |
| （四） 各组实验犬血清肝功能的变化 |
| 四 小结 |
| 五 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同门脉高压模型犬的舌下络脉特征观察 |
| 一 实验材料 |
| （一） 实验动物 |
| （二） 药品与试剂 |
| （三） 主要仪器 |
| 二 实验方法 |
| （一） 模型制备 |
| （二） 观测指标及方法 |
| 1、舌下络脉观察及横径宽度测量 |
| 2、舌下络脉毛细血管密度观察 |
| 3、透射电镜观察舌底络脉超微结构 |
| （三） 统计学方法 |
| 三 实验结果 |
| （一） 各组实验犬舌下络脉特征的观察 |
| （二） 各组实验犬舌下络脉横径变化 |
| （三） 各组实验犬舌底毛细血管密度的变化 |
| （四） 各组实验犬舌下络脉超微结构的变化 |
| 四 小结 |
| 五 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 不同门脉高压模型犬异常舌下络脉的形成机制研究 |
| 一 实验材料 |
| （一） 实验动物 |
| （二） 药品与试剂 |
| （三） 主要仪器 |
| 二 实验方法 |
| （一） 模型制备 |
| （二） 观测指标及方法 |
| 1、血清NO 含量测定 |
| 2、血清VEGF、HIF-1α含量检测 |
| 3、舌底VEGF、HIF-1α、VEGFR2、Apelin、APJ 蛋白表达测定 |
| 4、舌底VEGF、HIF-1α、VEGFR2mRNA 表达量检测 |
| （三） 统计学方法 |
| 三 实验结果 |
| （一） 各组实验犬血清NO 的浓度变化 |
| （二） 各组实验犬血清VEGF 的浓度变化 |
| （三） 各组实验犬血清HIF-1α的浓度变化 |
| （四） 各组实验犬舌底组织VEGF 的蛋白表达 |
| （五） 各组实验犬舌底组织VEGFR2 蛋白表达 |
| （六） 各组实验犬舌底组织VEGFmRNA 表达 |
| （七） 各组实验犬舌底组织VEGFR2mRNA 表达 |
| （八） 各组实验犬舌底组织HIF-1α蛋白表达 |
| （九） 各组实验犬舌底组织HIF-1αmRNA 表达 |
| （十） 各组实验犬舌底组织Apelin 蛋白表达 |
| （十一） 各组实验犬舌底组织APJ 蛋白表达 |
| 四 小结 |
| 五 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（7）体外培育牛黄复方制剂抗血吸虫病家兔肺纤维化的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言及研究背景 |
| 正文 |
| 第一部分:体外培育牛黄复方制剂抗血吸虫病家兔肺纤维化的病理组织学研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:体外培育牛黄复方制剂对血吸虫病家兔肺纤维化细胞外基质表达的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:体外培育牛黄复方制剂对血吸虫病家兔肺纤维化ERK_(1/2)及c-fos表达的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 致谢 |
（8）门脉高压性血管病变研究进展（论文提纲范文）
| 0引言 |
| 2门脉高压性血管病变的机制 |
（9）门静脉高压症患者脾动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前 言 |
| 主要试剂和仪器 |
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 结 论 |
| 参考文献 |
| 致 谢 |
| 综 述 |
四、门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的研究（论文参考文献）
- [1]血竭素高氯酸盐通过内质网应激诱导肝细胞癌凋亡的机制研究[D]. 武家成. 吉林大学, 2021(01)
- [2]益气活血方有效成分抑制巨噬细胞氧化亢进，防治门脉高压症的药理研究[D]. 李爽. 北京协和医学院, 2020(05)
- [3]血管重构在门脉高压症中的作用机制研究[D]. 郑磊. 上海交通大学, 2020
- [4]GATA6/LOXL2复合体以及MACC1促进胆管癌血管生成的机制研究[D]. 彭滔. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [5]环氧二十碳三烯酸对大鼠门脉高压症的作用机制研究[D]. 邓文升. 上海交通大学, 2018
- [6]不同门脉高压模型犬的舌下络脉特征及其形成机制研究[D]. 王丽娜. 第二军医大学, 2011(09)
- [7]体外培育牛黄复方制剂抗血吸虫病家兔肺纤维化的实验研究[D]. 李涛. 华中科技大学, 2006(03)
- [8]门脉高压性血管病变研究进展[J]. 李涛,杨镇. 世界华人消化杂志, 2005(01)
- [9]门静脉高压症患者脾动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的研究[D]. 林德新. 福建医科大学, 2004(01)
- [10]门脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的研究[J]. 曾金华. 中西医结合肝病杂志, 2003(S1)