一、人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定（论文文献综述）
徐重新,刘媛,张存政,张霄,仲建锋,刘贤金[1]（2016）在《噬菌体展示抗体在我国食用农产品生物毒素检测中的应用研究》文中进行了进一步梳理噬菌体展示抗体技术是近年来研究最热的新型人工基因工程抗体制备技术。本文系统梳理了食用农产品在产供过程中主要生物毒素危害物种类,以及噬菌体展示抗体在相应毒素检测上的应用状况;探讨了该新型抗体制备技术存在的不足,并初步提出了相应的可行性解决方案,旨在为我国食用农产品产供过程中生物毒素危害物检测用新型抗体的研发和利用提供较为详实的参考资料。
仲晓丽[2]（2015）在《犬副流感病毒单克隆抗体的制备及单链抗体蛋白的表达和活性鉴定》文中研究表明犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus,CPIV）是引起犬传染性呼吸系统疾病（窝咳）的重要病原之一,目前几乎所有养犬国家均有此病流行。犬感染CPIV发病时往往伴随发烧、流涕、咳嗽等症状,容易与犬瘟热的症状混淆而延误治疗。因此,CPIV诊断、治疗试剂的研制非常重要。杂交瘤技术制备的单克隆抗体是目前最常用的疾病诊断治疗制剂,因此本研究使用浓缩的CPIV蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤技术筛选单克隆抗体。相对杂交瘤技术制备的单抗而言,单链抗体蛋白具有相对分子量小、穿透力强等优点,在解析抗原抗体复合物结构、制备交叉保护作用抗体、检测病毒基因型变化等方面具有重要意义。因此,本研究建立了一套抗体基因扩增与表达的体系,保存了抗体基因;获得的抗体蛋白在一定程度上可作为天然抗体的替代品使用,为后续抗原抗体结构的解析、基因工程疫苗的研究奠定了基础。主要研究内容包括:1.单克隆抗体制备及生物学活性研究本研究使用PEG6000对Vero细胞扩增的病毒进行浓缩。TCID50试验测定浓缩前病毒毒价为2.6×105 PFU/ml,浓缩后病毒毒价为7×106 PFU/ml。血凝试验显示CPIV对1%猪红细胞具有血凝特性,血凝效价为23。将浓缩的病毒用弗氏佐剂乳化后免疫6周龄Babl/c小鼠。当免疫小鼠血清12800倍稀释后ELISA检测效价高于1.0时进行融合试验。三次亚克后共获得六株能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为13E8、33B5、51D8、51E6、51G12和54D10。间接免疫荧光试验和Westernblot试验结果显示:13E8和51D8分泌针对P蛋白抗原的抗体,33B5、51E6、51G12和54D10分泌针对N蛋白抗原的抗体。为进一步分析针对N蛋白抗原的单克隆抗体的具体抗原域,分别构建N蛋白不同区域（1-509、40-509、204-50和40-375）的pc DNA3.1重组质粒,并于293T细胞中进行表达。间接免疫荧光试验结果显示,33B5和51G12的单抗识别抗原域位于N蛋白375-509位氨基酸内,而51E6和54D10的单抗识别抗原域位于N蛋白1-40位氨基酸内。2.单克隆抗体基因扩增、表达及单链抗体生物活性研究本研究成功获得了33B5、51D8和51E6 3株单克隆抗体基因,构建了p ET42b的重组质粒,并通过大肠杆菌进行原核表达。结果显示3种蛋白均表达在包涵体中。为获得有活性的目的抗体蛋白,本研究选取了33B5的抗体基因对其表达进行优化,包括:表达不同抗体区域、添加可溶性标签、更换表达载体和表达菌,调整表达时间、温度和诱导剂浓度。结果显示原核表达的33B5抗体蛋白均在包涵体中,且表达量很高。使用昆虫细胞表达33B5的抗体蛋白,结果显示抗体蛋白表达在昆虫细胞细胞质内或细胞膜上,且表达量很低。最终本试验通过尿素变性和梯度复性的办法获得了有活性的单链抗体蛋白33B5sc Fv。通过ELISA试验、CPIV感染Vero细胞后的间接免疫荧光试验以及浓缩CPIV的Westernblot试验分析后,我们证实了复性的33B5sc Fv蛋白具有跟天然抗体特异性一致的抗原结合能力。
林接玉,付明娟,许春森,谢捷明[3]（2015）在《免疫毒素Trastuzumab-Cucurmosin（T-CUS）的制备及鉴定》文中研究指明目的制备由抗人类表皮生长因子受体2（HER-2/NEU）单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab,简称T）与南瓜蛋白（Cucurmosin,简称CUS）偶联而成的免疫毒素,并进行鉴定。方法以N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫）丙酸酯（SPDP）为偶联剂,制备T-CUS,经过Ni Sepharose 6 Fast Flow和SP Sepharose 6 Fast Flow纯化后SDS-PAGE分析其纯度及成分,细胞ELISA法检测其对人乳腺癌BT-474细胞的结合能力。结果 SDSPAGE分析显示T-CUS免疫毒素成功构建,免疫毒素基本保留了对BT-474细胞的结合能力。结论利用SPDP可实现曲妥珠单抗与CUS的成功偶联。
王晗,于蕊,于长明,陈薇[4]（2013）在《人破伤风基因工程中和抗体的研究进展》文中提出破伤风是一种既古老又年轻的疾病。2300年前,希腊医生希波克拉底首次描述了外伤引起破伤风感染病例。我国医书《五十二病方》、《黄帝内经》等均对破伤风有过描述。破伤风疫苗及抗毒素等的成功研制虽然大大降低了破伤风感染病死率,但作为世界上已知最毒的毒素之一,自然灾害、生物恐怖战剂以及治疗困难等使破伤风仍然在一些国家和地
王晗,于蕊,张晓鹏,任军,谢娜,樊红艳,张金龙,房婷,于长明,陈薇[5]（2013）在《人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选》文中研究指明目的构建人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,筛选抗破伤风毒素重链C端（TeNT-Hc）的特异性单链抗体（scFv）。方法利用RT-PCR从5名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中获得全套人破伤风抗体VH和VL基因,经过重叠PCR将VH和VL基因连接获得scFv片段。将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化大肠TG1感受态菌,获得抗体库。以TeNT-Hc为抗原对抗体库进行3轮筛选,获得特异性人源性抗TeNT-Hc单链抗体。scFv由pET32a（+）表达载体表达,产物包涵体采用HisTrap FF预装柱纯化并透析复性。采用非竞争酶免疫实验法测定scFv亲和常数（affinity constant,KD值）。检测scFv抑制TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的体外中和活性,计算抑制率。结果构建库容量为1×108的人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,经过筛选获得3株特异性较好的人源性抗TeNT-Hc单链抗体。原核表达结果显示,3株scFv均以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%～45%。包涵体经洗涤、纯化和复性后,scFv均保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,1 L培养物经纯化后可获得4～6 mg scFv蛋白。亲和力测定结果,27G、22D和S-4-7H-scFv的KD值分别为（1.25×10-7）,（2.31×10-7）和（1.97×10-7）mol/L。3株抗体对TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b结合的抑制率分别为64.5%,58.6%和51.5%。结论人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及具有体外中和活性的特异性抗TeNT-Hc单链抗体的获得,为人破伤风基因工程中和抗体的制备奠定了良好基础。
王晗,于蕊,张晓鹏,任军,谢娜,樊红艳,张金龙,房婷,于长明,陈薇[6]（2013）在《人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达》文中认为目的构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并进行原核表达和生物学特性鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,获得二硫键稳定的抗破伤风毒素重链C端（TeNT-Hc）单链抗体基因（27G-scdsFv）。连接pET22b（+）载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot法鉴定表达产物。ELISA检测27G-scdsFv体外抗原特异结合活性和抗体相对稳定性;非竞争酶免法检测抗体亲和力。采用免疫荧光法检测27G-scdsFv体外中和活性。结果测序结果显示获得正确的27G-scdsFv基因。原核表达scdsFv以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的50%。复性后的27G-scdsFv保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,亲和力较其scFv形式略有提升,KD=0.93×10-7mol/L,1 L培养物可获得5 mg scdsFv蛋白。27G-scdsFv的稳定性较scFv形式明显增强。27G-scdsFv在体外可以明显抑制TeNT-Hc与神经元细胞的结合。结论成功构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并获得有活性的目的蛋白,为27G-scdsFv的进一步生物学功能研究奠定基础。
聂艳桃,何太平,雷韬,葛永红,柏玉碧,张聪明,宋春雷,谭晓晶,唐菁燕,杨波[7]（2010）在《免疫抗体文库的构建及亚nM高亲和力人源抗体的筛选》文中指出目的构建免疫抗体文库,并筛选亚nM高亲和力人源抗体。方法采用破伤风类毒素（Tetanus toxoid,TT）免疫的高效价人B淋巴细胞,经PCR扩增可变区基因,构建免疫抗体文库,并筛选高亲和力人源抗体。将获得的抗体基因片段转换成全分子,进行真核表达和纯化,并与人抗TT多克隆抗体进行比较分析。结果构建的人破伤风免疫噬菌体抗体库库容为4.5×106,多样性符合引物设计要求,经筛选获得相对亲和力为10-10M的高亲和力人源抗体,其体内中和活性高于人多克隆抗体。结论根据抗体基因使用频率设计引物构建小容量免疫抗体文库,可获得亚nM的高亲和力人源抗体,该策略可用于抗感染性疾病人源抗体的开发。
高学慧[8]（2010）在《金黄色葡萄球菌（ATCC6538）蛋白A基因的克隆及应用研究》文中进行了进一步梳理抗体药物和制剂因为其特有的免疫学活性和目标针对性,近年来成为发展最快的一类生物技术药物,销售额也在最近短短十年的时间里从3.1亿美元上升到258亿美元。在整个生物制药行业中占的比例也从1/5上升到1/3。抗体的生产不仅为现代生命科学研究提供了重要的工具,而且在基因、蛋白质的结构和功能研究方面发挥着重要的作用。而作为在抗体药物和制剂生产中不可缺少的重要环节-抗体纯化,则从某种有意义上决定了抗体药物生产质量和水平。而在抗体纯化技术中亲和层析技术的发展显得尤为重要,目前商业化的亲和层析产品昂贵的价格也提高了抗体药物和制品的成本。金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）是上世纪70年代发现的能与多物种抗体Fc端进行结合的菌体蛋白,自发现以来就一直作为重要的抗体纯化层析配体进行研究,目前也是商业化较完善、应用较为广泛的亲和配体。所以能否提高SPA的活性和稳定性,对于抗体药物的生产显得尤为重要。本实验首次以ATCC6538株金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆得到了SPA的全长基因1503bp,编码501个氨基酸。经过与标准菌株CowanI的SPA比对,其中成熟蛋白功能区氨基酸序列（1-289）是完全相同的,具有5个IgG结合域,而X区域（305-370）有所不同,所以将这株菌的SPA序列发布到GenBank上供其他研究者参考,检索号为EU695225。本实验同时构建了两种高效表达载体pHis-SUMO-SPA（全长蛋白）和pHis-SUMO-FSPA（功能区蛋白）,转化入宿主菌Rosetta,将SPA的全长蛋白和功能区片段与SUMO标签进行融合表达,利用SUMO标签的作用提高SPA蛋白的稳定性和活性,经过IPTG诱导和表达条件的摸索,利用AKTA蛋白纯化系统纯化得到了纯度较高的SUMO-SPA和SUMO-FSPA蛋白。在利用ELISA方法对SUMO-FSPA的抗体结合活性和稳定性进行检测实验中,SUMO-FSPA显示出较好的抗体亲和性和稳定性,并将SUMO-FSPA于活化的琼脂糖连接,连接产物SUMO-FSPA-agarose成功应用于抗体的纯化。这些结果都说明利用SUMO标签与SPA的融合表达可以提高SPA蛋白的稳定性,没有影响与抗体的结合能力,并可以作为模型深入的开发抗体纯化产品。
乔春霞,沈倍奋[9]（2009）在《重组多克隆抗体——一类新的治疗制剂》文中研究说明
王群,刘军莉,高飞,张苹,张利宁[10]（2007）在《人源性TAT-Fab抗体的表达优化及生物活性测定》文中提出为了提高抗体的表达水平,获得有保护作用的人源性破伤风抗毒素Fab（TAT-Fab）抗体,对人源性TAT-Fab抗体在大肠杆菌中的表达条件进行优化并测定其体内外生物学活性.ELISA显示所表达的TAT-Fab抗体可特异性结合破伤风外毒素,且优化后的表达水平较优化前提高近5倍;表达产物经超滤分离浓缩后,Western-blot显示在分子量约50 kDa处有一TAT-Fab抗体的特异性表达条带;小鼠保护实验显示其可特异性中和破伤风外毒素,明显延长小鼠的生存时间.以上结果表明所制备的人源性TAT-Fab抗体在体内外均具有中和破伤风外毒素的效应,为人源性破伤风抗毒素的研制和生产提供了实验依据.
二、人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定（论文提纲范文）
（1）噬菌体展示抗体在我国食用农产品生物毒素检测中的应用研究（论文提纲范文）
| 一、食用农产品产供过程中主要生物毒素危害物 |
| 二、噬菌体展示抗体技术在抗体制备中的优势 |
| 三、噬菌体展示抗体在我国食用农产品生物毒素检测中的应用现状 |
| 四、存在的不足及对策建议 |
（2）犬副流感病毒单克隆抗体的制备及单链抗体蛋白的表达和活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 犬副流感研究进展 |
| 1.1.1 犬副流感病毒的流行病学 |
| 1.1.2 犬副流感病毒的病原学特性 |
| 1.1.3 犬副流感病毒基因结构及蛋白功能 |
| 1.1.4 犬副流感病毒的致病机制 |
| 1.1.5 犬副流感病毒的临床诊断 |
| 1.1.5.1 病原检测 |
| 1.1.5.2 抗体检测 |
| 1.2 抗体研究进展 |
| 1.2.1 抗体基本结构与功能 |
| 1.2.1.1 抗体的单分子结构和功能 |
| 1.2.1.2 抗体的分类 |
| 1.2.1.3 抗体的基因组结构和功能 |
| 1.2.2 单克隆抗体技术 |
| 1.2.2.1 实验动物 |
| 1.2.2.2 骨髓瘤细胞 |
| 1.2.2.3 细胞融合试验 |
| 1.2.3 基因工程抗体 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 病毒、细胞及动物 |
| 2.2 主要药品及试剂 |
| 2.3 主要试剂配制 |
| 2.4 主要仪器及设备 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 细胞的复苏和培养 |
| 3.2 病毒毒价测定 |
| 3.3 病毒扩增和浓缩 |
| 3.4 血凝试验 |
| 3.5 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.6 动物免疫 |
| 3.7 间接ELISA方法的建立 |
| 3.8 单克隆抗体的制备 |
| 3.8.1 间接ELISA方法检测免疫小鼠血清效价 |
| 3.8.2 SP2/0 骨髓瘤细胞的制备 |
| 3.8.3 免疫脾细胞的制备 |
| 3.8.4 饲养细胞的制备 |
| 3.8.5 细胞融合 |
| 3.8.6 阳性杂交瘤细胞亚克隆 |
| 3.8.7 单克隆抗体的大量制备 |
| 3.8.8 单克隆抗体的效价检测 |
| 3.9 间接免疫荧光试验 |
| 3.10 Western Blot试验 |
| 3.11 细胞/病毒RNA提取 |
| 3.12 RNA反转及基因扩增 |
| 3.13 质粒构建 |
| 3.14 细胞转染实验 |
| 3.15 重组蛋白的原核表达 |
| 3.16 蛋白变性复性 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 犬副流感病毒的扩增和浓缩 |
| 4.1.1 病毒的扩增 |
| 4.1.2 病毒的血凝试验 |
| 4.1.3 病毒的浓缩 |
| 4.2 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 4.2.1 单抗的效价及亚型鉴定 |
| 4.2.2 单抗针对感染病毒细胞的IFA结果 |
| 4.2.3 单抗针对浓缩病毒的Western blot试验结果 |
| 4.2.4 单抗针对病毒各种结构蛋白的IFA结果 |
| 4.2.5 单抗针对N蛋白的靶位抗原区域的IFA结果 |
| 4.3 抗体基因的研究 |
| 4.3.1 抗体可变区基因的扩增和鉴定 |
| 4.3.2 抗体可变区基因序列的分析 |
| 4.3.3 33B5 抗体可变区蛋白的表达 |
| 4.3.4 33B5scFv蛋白的纯化 |
| 4.3.5 33B5scFv蛋白活性的鉴定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 病毒扩增与浓缩 |
| 5.2 小鼠免疫与单抗筛选 |
| 5.3 抗体基因扩增与分析 |
| 5.4 33B5scFv蛋白的表达与生物活性分析 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）免疫毒素Trastuzumab-Cucurmosin（T-CUS）的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.2 细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 用SPDP作为交联剂制备T-CUS[11] |
| 2.1.1 T-PDP的制备: |
| 2.1.2 CUS-PDP的制备: |
| 2.1.3 CUS-PDP-SH的制备: |
| 2.1.4 T-CUS的制备: |
| 2.2 免疫毒素的纯化 |
| 2.2.1 Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析去除反应过量的CUS[12]: |
| 2.2.2 用离子交换柱梯度洗脱纯化: |
| 2.3 免疫毒素的鉴定 |
| 2.3.1 纯度及成分分析: |
| 2.3.2 结合活性测定[13]: |
| 2.3.3 数据处理: |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫毒素纯化结果 |
| 3.1.1 反应终产物电泳图: |
| 3.1.2 反应终产物过Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化后电泳图: |
| 3.1.3 反应终产物经镍柱纯化后再经Sp-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱纯化: |
| 3.2 结合活性测定结果 |
| 4 讨论 |
（5）人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人破伤风VH和VL基因的PCR扩增 |
| 1.2.2 重叠 PCR |
| 1.2.3 人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建 |
| 1.2.4 抗体库重组率检测及多样性鉴定 |
| 1.2.5 噬菌体单链抗体库的富集筛选 |
| 1.2.6 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.7 阳性克隆特异性结合活性鉴定 |
| 1.2.8 阳性克隆scFv抗体基因序列测定 |
| 1.2.9 scFv在大肠杆菌中的表达及活性鉴定 |
| 1.2.9.1 scFv原核表达载体的构建及诱导表达 |
| 1.2.9.2 scFv包涵体的获得、洗涤和变性 |
| 1.2.9.3 scFv包涵体的纯化 |
| 1.2.9.4 scFv包涵体的复性及浓度测定 |
| 1.2.10 scFv亲和力测定 |
| 1.2.11 阳性克隆体外中和活性的初步判断[8] |
| 2 结果 |
| 2.1 人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建 |
| 2.2 噬菌体抗体库的构建及初步鉴定 |
| 2.3 抗体库的富集和筛选 |
| 2.4 阳性克隆的筛选及其特异性鉴定 |
| 2.5 scFv在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 2.6 scFv包涵体的复性及浓度测定 |
| 2.7 scFv亲和力的测定 |
| 2.8 阳性克隆体外中和活性的初步判断 |
| 3 讨论 |
（6）人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 27G-scdsFv表达载体的构建 |
| 1.2.2 27G-scdsFv在大肠杆菌中的表达 |
| 1.2.2.1 27G-scdsFv包涵体的获得、 洗涤和变性 |
| 1.2.2.2 27G-scdsFv包涵体的纯化 |
| 1.2.2.3 27G-scdsFv包涵体的复性及浓度测定 |
| 1.2.3 目的蛋白SDS-PAGE和Western blot分析 |
| 1.2.4 27G-scdsFv体外抗原特异结合活性鉴定 |
| 1.2.5 27G-scdsFv相对稳定性检测 |
| 1.2.6 27G-scdsFv亲和力测定 |
| 1.2.7 27G-scdsFv体外中和活性初步判断[4-5] |
| 2 结果 |
| 2.1 点突变获得27G-scdsFv基因 |
| 2.2 27G-scdsFv在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3 27G-scdsFv体外抗原特异结合活性鉴定 |
| 2.4 27G-scdsFv相对稳定性检测 |
| 2.5 27G-scdsFv亲和力测定 |
| 2.6 27G-scdsFv体外中和活性初步判断 |
| 3 讨论 |
（7）免疫抗体文库的构建及亚nM高亲和力人源抗体的筛选（论文提纲范文）
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 免疫抗体文库的构建 |
| 1.5 噬菌体抗体库的筛选 |
| 1.6 抗体库的多样性分析 |
| 1.7 可溶性Fab在大肠杆菌中的表达 |
| 1.8 人源破伤风抗毒素抗体 (TT-Ab) 基因全分子的表达 |
| 1.9 抗体的相对亲和力检测 |
| 1.1 0 抗体的体内中和活性检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 抗体库的构建及库容 |
| 2.2 抗体库的多样性 |
| 2.3 噬菌体抗体库的筛选 |
| 2.4 全分子抗体的鉴定 |
| 2.5 重组人单克隆抗体与人抗TT多克隆抗体的比较分析 |
| 2.5.1 相对亲和力: |
| 2.5.2 体内中和活性: |
| 3. 讨论 |
（8）金黄色葡萄球菌（ATCC6538）蛋白A基因的克隆及应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 1.1 抗体药物研究进展 |
| 1.1.1 抗体综述 |
| 1.1.2 抗体药物生产技术研究进展 |
| 1.2 抗体纯化技术研究进展 |
| 1.2.1 盐析法 |
| 1.2.2 Protein A 出现之前应用于抗体提纯的层析技术 |
| 1.2.3 以 Protein A 为代表的亲和层析技术研究进展 |
| 1.3 亲和层析配体研究进展 |
| 1.3.1 G 群链球菌蛋白 G(Protein G) |
| 1.3.2 大消化链球菌蛋白 L(Protein L) |
| 1.3.3 金黄色葡萄球菌蛋白 A(Protein A) |
| 1.3.4 蛋白 A 类似物作为配体 |
| 1.3.5 蛋白 C1q 及 MBP 在 IgM 纯化上的应用 |
| 1.4 SUMO 蛋白标签研究进展 |
| 1.4.1 SUMO 分类和结构 |
| 1.4.2 SUMO 的生物学活性 |
| 1.5 SPA 研究的必要性 |
| 1.6 SPA 研究的目的和意义 |
| 2.材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 克隆和表达载体 |
| 2.3 酶和生化试剂 |
| 2.4 引物 |
| 2.5 主要仪器和设备 |
| 3.方法 |
| 3.1 金黄色葡萄球菌蛋白 A 基因的克隆与序列分析 |
| 3.1.1 金黄色葡萄球菌的培养 |
| 3.1.2 金黄色葡萄球菌基因组 DNA 的提取 |
| 3.1.3 SPA 成熟蛋白全长基因的 PCR 扩增 |
| 3.1.4 PCR 产物的回收 |
| 3.1.5 PCR 回收产物与克隆载体的连接 |
| 3.1.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.1.7 重组克隆载体的转化 |
| 3.1.8 阳性克隆的筛选 |
| 3.1.9 阳性重组质粒的鉴定 |
| 3.1.10 成熟 SPA 全长基因序列测定与结果分析 |
| 3.2 pET-30a-SPA 原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 |
| 3.2.1 pET30a(+)表达载体和 SPA 插入片段的制备 |
| 3.2.2 SPA 片段与 pET30a(+)表达载体的连接 |
| 3.2.3 重组原核表达载体的转化 |
| 3.2.4 阳性重组质粒的筛选与鉴定 |
| 3.2.5 阳性重组质粒转化表达宿主菌及鉴定 |
| 3.2.6 pET-30a-SPA 重组质粒的诱导条件的确定 |
| 3.3 pHis-SUMO-SPA 高效原核表达载体的构建极其在大肠杆菌中表达 |
| 3.3.1 pHis-SUMO-SPA 高效原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 重组质粒 pHis-SUMO-SPA 在大肠杆菌的表达 |
| 3.4 SPA 功能区蛋白基因高效原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 |
| 3.4.1 用于表达 FSPA 的 pHis-SUMO 表达载体的构建 |
| 3.4.2 pHis-SUMO-FSPA 重组质粒在大肠杆菌中的表达 |
| 3.4.3 pHis-SUMO-SPA/pHis-SUMO-FSPA 两种重组表达载体表达条件的优化 |
| 3.5 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 两种蛋白表达量分析 |
| 3.6 目的蛋白的纯化 |
| 3.6.1 HisTrapTM FF crude colum 的平衡 |
| 3.6.2 融合蛋白 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 的纯化 |
| 3.6.3 融合蛋白 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 脱盐 |
| 3.6.4 纯化后的 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 两种蛋白的质量分析 |
| 3.6.5 Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 的再生与保存 |
| 3.7 融合蛋白 SUMO-SPA、SUMO-FSPA 抗体结合活性的的测定 |
| 3.8 融合蛋白 SUMO-FSPA 稳定性的测定 |
| 3.9 融合蛋白 SUMO-FSPA 与固相载体的连接 |
| 3.9.1 环氧氯丙烷活化的琼脂糖方法 |
| 3.9.2 羰基二咪唑活化的琼脂糖 |
| 3.9.3 溴化氰活化的琼脂糖 |
| 3.10 SUMO-FSPA-agarose 在纯化抗体方面的应用 |
| 3.10.1 抗 mFGF21 的兔免疫血清的制备 |
| 3.10.2 利用 SUMO-FSPA-agarose 对免疫后的兔血清进行抗体纯化 |
| 3.10.3 对纯化后的抗体进行浓度纯度及效价的检测 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 金黄色葡萄球菌蛋白 A(SPA)全长基因的克隆 |
| 4.1.1 金黄色葡萄球菌基因组 DNA 的提取 |
| 4.1.2 SPA 全长基因的 PCR 扩增 |
| 4.1.3 PCR 产物的回收 |
| 4.1.4 重组克隆质粒 pMD18-T-SPA 的鉴定 |
| 4.1.5 SPA 全长基因序列测定与结果分析 |
| 4.2 pET-30a-SPA 原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 |
| 4.2.1 pET30a 表达载体和 SPA 基因插入片段的制备 |
| 4.2.2 阳性重组质粒 pET-30a-SPA 的筛选与鉴定 |
| 4.2.3 pET-30a-SPA 重组质粒的诱导条件的确定 |
| 4.3 pHis-SUMO-SPA 高效原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 |
| 4.3.1 pHis-SUMO-SPA 重组表达载体的构建 |
| 4.3.2 pHis-SUMO-SPA 重组质粒的诱导 |
| 4.4 pHis-SUMO-FSPA 高效原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 |
| 4.4.1 pHis-SUMO-FSPA 高效原核表达载体的构建 |
| 4.4.2 pHis-SUMO-FSPA 重组质粒的诱导 |
| 4.5 融合蛋白 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 表达条件的优化与表达量分析 |
| 4.5.1SUMO-SPA 表达条件的优化 |
| 4.5.2 融合蛋白 SUMO-SPA 表达量的分析 |
| 4.5.3 SUMO-FSPA 表达条件的优化 |
| 4.5.4 重组 pHis-SUMO-FSPA 融合蛋白表达量分析 |
| 4.6 目的蛋白的纯化 |
| 4.6.1 SUMO-SPA 蛋白和 SUMO-FSPA 蛋白的纯化 |
| 4.7 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 两种蛋白抗体结合活性的检测 |
| 4.8 融合蛋白 SUMO-FSPA 稳定性实验 |
| 4.9 目的蛋白 SUMO-FSPA 与活化琼脂糖的偶联 |
| 4.9.1 环氧氯丙烷活化的琼脂糖 |
| 4.9.2 羰基二咪唑活化的琼脂糖 |
| 4.9.3 溴化氰活化的琼脂糖偶联 |
| 4.10 抗体的纯化和检测 |
| 4.10.1 抗体的纯化效果 |
| 4.10.2 抗体效价的测定 |
| 5.讨论 |
| 5.1 金黄色葡萄球菌菌株的选择及蛋白 A 的基因多态性 |
| 5.1.1 菌株的选择 |
| 5.1.2 蛋白 A 基因的多态性 |
| 5.2 表达载体的选择和表达条件的确定 |
| 5.2.1 表达载体的选择 |
| 5.2.2 表达载体的构建 |
| 5.3 目的蛋白的纯化 |
| 5.4 目的蛋白抗体结合活性与稳定性的检测 |
| 5.4.1 抗体结合活性的检测 |
| 5.4.2 SUMO-FSPA 蛋白稳定性检测 |
| 5.5 偶联反应介质的选择和条件的摸索 |
| 5.6 兔血清抗体的纯化 |
| 5.6.1 高免兔血清的制备 |
| 5.6.2 抗体纯化方法 |
| 5.7 抗体的效价 |
| 5.8 融合蛋白 SUMO-FSPA 的应用前景 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 附录D |
| 附录E |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）重组多克隆抗体——一类新的治疗制剂（论文提纲范文）
| 1 重组人源多克隆抗体制备技术 |
| 2 重组多克隆抗体的特性鉴定 |
| 3 重组多克隆抗体的应用 |
| 4 展望 |
（10）人源性TAT-Fab抗体的表达优化及生物活性测定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及试剂 |
| 1.2 人源性TAT-Fab噬菌体抗体的筛选鉴定 |
| 1.3 分泌型人源性TAT-Fab抗体工程菌的制备 |
| 1.4 分泌型人源性TAT-Fab抗体表达条件的优化 |
| 1.5 人源性TAT-Fab抗体的分离及免疫结合活性检测 |
| 1.6 人源性TAT-Fab抗体的小鼠保护实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人源性TAT-Fab噬菌体抗体的筛选鉴定 |
| 2.2 分泌型人源性TAT-Fab抗体工程菌的制备 |
| 2.3 人源性TAT-Fab抗体表达条件的优化 |
| 2.4 人源性TAT-Fab抗体的分离及免疫结合活性检测 |
| 2.5 人源性TAT-Fab抗体的小鼠保护实验 |
| 3 讨 论 |
四、人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定（论文参考文献）
- [1]噬菌体展示抗体在我国食用农产品生物毒素检测中的应用研究[J]. 徐重新,刘媛,张存政,张霄,仲建锋,刘贤金. 农产品质量与安全, 2016(06)
- [2]犬副流感病毒单克隆抗体的制备及单链抗体蛋白的表达和活性鉴定[D]. 仲晓丽. 华中农业大学, 2015(02)
- [3]免疫毒素Trastuzumab-Cucurmosin（T-CUS）的制备及鉴定[J]. 林接玉,付明娟,许春森,谢捷明. 海峡药学, 2015(05)
- [4]人破伤风基因工程中和抗体的研究进展[J]. 王晗,于蕊,于长明,陈薇. 中华微生物学和免疫学杂志, 2013(05)
- [5]人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选[J]. 王晗,于蕊,张晓鹏,任军,谢娜,樊红艳,张金龙,房婷,于长明,陈薇. 军事医学, 2013(02)
- [6]人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达[J]. 王晗,于蕊,张晓鹏,任军,谢娜,樊红艳,张金龙,房婷,于长明,陈薇. 细胞与分子免疫学杂志, 2013(01)
- [7]免疫抗体文库的构建及亚nM高亲和力人源抗体的筛选[J]. 聂艳桃,何太平,雷韬,葛永红,柏玉碧,张聪明,宋春雷,谭晓晶,唐菁燕,杨波. 中国生物制品学杂志, 2010(12)
- [8]金黄色葡萄球菌（ATCC6538）蛋白A基因的克隆及应用研究[D]. 高学慧. 东北农业大学, 2010(05)
- [9]重组多克隆抗体——一类新的治疗制剂[J]. 乔春霞,沈倍奋. 中国免疫学杂志, 2009(01)
- [10]人源性TAT-Fab抗体的表达优化及生物活性测定[J]. 王群,刘军莉,高飞,张苹,张利宁. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2007(06)