一、癌的化学预防最前沿专辑(一) 基因调节化学预防——基于致癌基因异常的新预防技术开发（论文文献综述）
冯泽宇[1]（2021）在《IRAK1在结直肠肿瘤发生中的作用及乌梅丸防治的机制研究》文中研究表明目的:阐明IRAK1在结直肠肿瘤发病过程中的作用机制并探讨乌梅丸在此过程中的防治功效。方法:1.通过检索GEO数据库探讨IRAK1在正常肠组织、腺瘤组织、腺癌组织中的表达情况。利用临床样本验证IRAK1及其磷酸化蛋白正常肠组织、腺瘤组织、腺癌组织中的表达情况。利用Western Blot检测各个肠癌细胞系中IRAK1的表达水平,并根据各细胞IRAK1蛋白表达水平选取HCT116、RKO细胞进行研究。利用慢病毒转染在HCT116细胞系中构建IRAK1过表达和敲低的稳转细胞株,在RKO细胞系中构建IRAK1敲低的稳转细胞株。利用Western Blot验证IRAK1在HCT116及RKO稳转细胞株中的蛋白表达水平。利用CCK-8实验研究IRAK1在体外对人肠癌细胞活力的影响;利用克隆形成实验研究IRAK1在体外对人肠癌细胞增殖能力的影响。利用IRAK1抑制剂进行CCK-8及克隆形成实验,研究药理学抑制IRAK1对细胞增殖的影响。利用流式细胞技术,IRAK1在体外对人肠癌细胞凋亡及细胞周期的影响,利用Western Blot检测IRAK1对细胞周期相关蛋白的表达影响。利用IRAK1抑制剂检测研究药理学抑制IRAK1对肠癌细胞凋亡及周期的影响。2.利用基因富集分析挖掘IRAK1在腺瘤组织中的潜在功能。筛选出IRAK1促进结直肠肿瘤发生的可能机制为调控MYC表达。利用CO-IP、qPCR、Western Blot以及临床数据验证作用关系。在HCT116和RKO细胞系中利用IRAK1抑制剂15409及c-Myc抑制剂10058-F4,通过CCK-8以及克隆形成实验明确IRAK1是否通过调节c-Myc而影响肠癌细胞增殖。利用Western Blot筛选IRAK1下游通路因子变化相关情况,挖掘IRAK1调控c-Myc的可能途径。利用p38抑制剂SB203580验证挽救实验中抑制p38对过表达IRAK1以后c-Myc的改变情况。在HCT116和RKO细胞系中利用IRAK1抑制剂15409及p38抑制剂,通过Western Blot和qPCR验证IRAK1对MYC的调控是否依赖p38。利用p38抑制剂及c-Myc抑制剂,通过CCK-8以及克隆形成实验明确p38是否通过调节c-Myc而影响肠癌细胞增殖。利用c-Myc抑制剂通过Western Blot检测c-Myc对IRAK1激活的影响。3.液相色谱法获得复方乌梅丸的代表性成分,通过分子对接运算,挖掘其中可能作用于IRAK1的成分。建立以氧化偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠肠道肿瘤模型,探讨乌梅丸以及IRAK1抑制剂15409对其的缓解作用。计算各组小鼠生存情况、肠道成瘤数量以及肿瘤大小,通过HE染色验证肠道病理改变。Western Blot检测IRAK1/p38/c-Myc在各组小鼠肠组织中的表达情况。建立DSS诱导的小鼠肠炎模型,通过结肠长度以及HE染色评估乌梅丸以及IRAK1抑制剂对肠炎的缓解作用。Western Blot检测IRAKl/p38/c-Myc在各组小鼠肠组织中的表达情况。利用GEO数据库验证IBD患者肠组织中IRAK1和MYC表达的相关性。结果:1.多个 GEO 数据库（GSE117606、GSE37364、GSE41258 以及GSE71187）证实IRAK1在正常组织、腺瘤、腺癌中的表达逐渐升高（P<0.05）。同时含有腺瘤和腺癌的患者,其正常组织、腺瘤、腺癌中IRAK1及其磷酸化表达均逐渐升高（P<0.05）。Kaplan-Meier曲线分析TCGA的肠癌数据显示IRAK1过度表达的肠癌患者总生存期短（Log-rank P<0.05）。,HCT116过表达IRAK1的细胞株中IRAK1表达明显高于载体对照组。HCT116以及RKO敲减IRAK1的细胞株中IRAK1表达明显低于载体对照组。IRAK1过表达增加了 HCT116的细胞活力,而在HCT116及RKO中不同的IRAK1干扰片段均抑制了细胞活力（P<0.05）。IRAK1过表达增加了 HCT116的克隆形成率,而在HCT116及RKO中不同的IRAK1干扰片段均抑制了克隆形成（P<0.05）。IRAK1抑制剂15409抑制HCT116及RKO的细胞活性（P<0.05）。15409抑制HCT116及RKO的细胞克隆形成（P<0.05）。与载体对照比较,IRAK1的敲减不会影响HCT116及RKO的凋亡率。IRAK1过表达后HCT116细胞G2期比例下降,而IRAK1干扰后HCT116及RKO细胞周期阻滞在G2期（P<0.05）。IRAK1过表达的HCT116细胞CyclinB1、CDK1的表达升高,P21的表达降低。IRAK1干扰后的HCT116及RKO细胞CyclinB1、CDK1的表达降低,P21表达升高。15409干预HCT116及RKO细胞不会影响HCT116及RKO的凋亡率。15409干预HCT116及RKO细胞细胞周期阻滞在G2期（P<0.05）,降低CyclinB1、CDK1的表达,升高P21表达。2.GSEA分析GEO数据库腺瘤组织中IRAK1的表达情况在MYC靶标相关基因集显着富集。临床样本免疫组化检测证实大肠腺瘤组织中IRAK1与c-Myc的表达高度正相关（P<0.05）。CO-IP证实在HCT116和RKO细胞中IRAK1及c-Myc蛋白存在相互作用关系。IRAK1过表达的HCT116细胞系中MYC水平升高,而敲减IRAK1的HCT116及RKO中MYC表达降低（P<0.05）。HCT116和RKO细胞中,15409降低了 c-Myc蛋白表达,并且这种作用被MG132逆转。15409和10058-F4均降低HCT116及RKO细胞活性（P<0.05）;15409联合无法进一步增加10058-F4的效果。15409和10058-F均减少HCT116及RKO克隆形成（P<0.05）;I5409联合也无法进一步增加10058-F4的效果。IRAK1过表达的HCT116中p38被激活,而P65无明显改变,ERK1/2被抑制;IRAK1敲减的HCT116中p38及P65均受到抑制,ERK1/2活性无明显改变;IRAK1敲减的RKO中p38、P65及ERK1/2活性均受到抑制。SB203580能够逆转IRAK1过表达引起的c-Myc升高。15409或SB203580均能降低HCT116及RKO中MYC的mRNA及蛋白表达。SB203580及10058-F4均降低HCT116及RKO细胞活性（P<0.05）;SB203580 联合无法增加 10058-F4 的效果。SB203580 及 10058-F4均减少HCT116及RKO克隆形成（P<0.05）;SB203580联合无法增加10058-F4抑制的效果。10058-F4处理的HCT116及RKO细胞中IRAK1表达下降,p38活化受抑制。3.质谱鉴定乌梅丸中含量稳定的11个化学成分包括柠檬酸、小檗碱、黄柏碱、药根碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、6-姜酚、羟基-α-山椒素、细辛脂素、阿魏酸。其中柠檬酸、小檗碱含量较高。分子对接结果提示黄连中的小檗碱以及黄柏中的黄柏碱能结合IRAK1的磷酸化位点T387。成功构建AOM/DSS诱导的肠肿瘤模型。6g/kg乌梅丸口服能明显提高模型动物的生存率。减少了肠道肿瘤的数量（P<0.05）,同时也能减小肿瘤的体积（P<0.05）;药理学抑制IRAK1并不能减少肿瘤的发生,但是显着降低了肿瘤的体积（P<0.05）。6g/kg乌梅丸有效缓解了造模导致的肠粘膜破坏。显示模型小鼠IRAK1在Thr387处活化,同时伴有c-Myc及p38的激活,乌梅丸以及IRAK1抑制能降低激活的IRAK1、p38以及c-Myc。DSS诱导急性肠炎模型发中乌梅丸以及IRAK1抑制均能改善造模导致的结肠长度改变（P<0.05）。病理提示药物干预能减轻粘膜损坏情况。模型小鼠IRAK1在Thr387处活化,同时有p38的激活,模型小鼠肠组织c-Myc表达降低。各组药物均能降低激活的IRAK1以及p38。IBD数据集GSE3629以及GSE75214中样本表达IRAK1及MYC均高度正相关。结论:结直肠肿瘤发生过程中IRAK1通过激活p38上调MYC表达从而促进肿瘤增殖。乌梅丸通过抑制IRAK1起到防治结直肠肿瘤的作用。
李园媛[2]（2020）在《水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究》文中指出目的:通过水提法制备水蛭提取液,分别采用凝血酶间接检测提取液中水蛭素含量（根据2015版药典）和高分辨液质联用QE技术检测提取液成分,以确定水蛭提取液的主要成分。通过观察水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma RB）WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响,验证水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞生长和侵袭的作用。通过水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor VEGF）、缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a HIF-1a）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9 MMP-9）的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（Phosphatidylinositol 3kinase/Protein Kinae B PI3K/AKT）通路的影响,阐明水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞可能的分子机制。通过观察水蛭提取液对人脐静脉内皮细胞（Human Vascular endothelial cells HUVEC）的活性影响及表达VEGF和血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 VEGFR2）的影响,以此来研究水蛭提取液抑制肿瘤血管生成的潜能。方法:1.水蛭提取液的制备和检测:水提法制备水蛭提取液,并利用凝血酶间接测定水蛭素的含量;高分辨液质联用-QE技术分析水蛭的主要成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 将WERI-RB-1细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 以0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响; 以2个实验浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞凋亡的影响; transwell侵袭实验检测2个实验浓度对WERI-RB-1细胞侵袭作用的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Elisa实验检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,RT-PCR检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a和MMP-9 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Western Blot检测蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a、MMP-9、PI3K、人磷酸化AKT蛋白（Human phosphorylated AKT protein p-AKT）蛋白含量的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 将HUVEC细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,RT-PCR检测水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,Western Blot检测蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2蛋白含量的影响。结果:1.水蛭提取液的制备和检测:根据2015版《中华药典》中使用凝血酶测定水蛭提取液中水蛭素的浓度,经过多次反复提取及测定,水蛭提取液中水蛭素浓度保持相对稳定。高分辨液质联用分析仪-QE分析结果表明:水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 0.04U/ml、0.08U/ml的水蛭提取液组在48h对RB细胞的抑制率分别是9.70%、9.92%,与对照组比较,差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 实验组药物浓度干预的RB细胞主要阻滞在G2/M期。对照组、0.04U/ml水蛭提取液组、0.08U/ml水蛭提取液组处于G2/M期的阳性细胞率（%）分别为3.00±2.32、12.59±5.36、14.79±4.12（对照组与水蛭提取液组比较,P<0.01）。 实验组水蛭提取液浓度均可诱导RB细胞凋亡率上调,以上3组细胞凋亡率依次分别为4.64±2.56、37.91±3.44、33.05±2.25（与对照组比较,P<0.01）。 实验组Transwell下室中移行的、每高倍视野细胞数目均较对照组显着减少,3组检测结果（OD值）依次分别为1.21±4.36、0.44±2.08、0.53±3.42（与对照组比较,P<0.01）。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: Elisa实验结果显示:与对照组比较,0.04U/ml和0.08U/ml2个水蛭提取液浓度培养基上清中VEGF的表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,HIF-1a和MMP-9 m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 0.04U/ml和0.08U/ml水蛭提取液干预WERI-RB-1细胞48h后,细胞的抑制率分别为12.96±1.59、14.81±2.17,与对照组比较差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.水提法提取的水蛭提取液中水蛭素含量相对稳定。水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液通过抑制WERI-RB-1活性、引起周期阻滞、诱导细胞凋亡、抑制细胞侵袭等作用对视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞发挥抑制作用。3.水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞,同时抑制WERI-RB-1细胞中HIF-1a、MMP-9活性。4.水蛭提取液可抑制HUVEC细胞活性,抑制HUVEC细胞表达VEGF、VEGFR2蛋白活性。综上所述,在体外实验中,水蛭提取液在一定程度上可能通过VEGF/PI3K/AKT通路和HIF-1a、MMP-9因子影响WERI-RB-1细胞周期分布、凋亡、侵袭作用,从而发挥抑制RB的作用。同时发现水蛭提取液可能通过抑制VEGF、VEGFR2表达抑制脐静脉内皮细胞。我们的研究结果表明:水蛭提取液对RB细胞具有抑制作用,同时可能对RB血管也有抑制作用。从中医理论上进一步验证了其活血化瘀、其破血消瘕的作用。以上研究结果为开发新型抗肿瘤制剂水蛭提供了一定的临床前研究资料。
李晓飞[3]（2020）在《结直肠癌患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠腺瘤癌变的研究》文中指出目的:人体与微生物处于共生状态。在致病因素作用下,肠道微生物就会出现平衡失调,造成菌群紊乱,致病菌增加,有益菌减少,从而诱发肠道炎症,进而促进肿瘤生长。目前相关研究多集中在肠道肿瘤患者肠道菌群的检测及相关性分析,肠道菌群失衡在腺瘤进展转化过程中的作用机制如何?哪些关键因素参与这一过程?其关键信号通路是什么?本课题的研究目的将着重探讨这些问题。方法:天津医科大学总医院内镜中心及消化内科就诊且病理检查确诊为结直肠癌的患者,筛选符合条件的10名患者,留取粪便制备菌液。同时筛选出10名符合条件的健康者进行新鲜粪便收集,将收集到的新鲜粪便放入粪便盒中,做好标记,-80℃冰箱中保存。实验动物选择4周龄SPF级野生型C57BL/6J小鼠,4周龄SPF级雌性Apcmin/+小鼠。分为4组:FMT-CH组（C57BL/6J小鼠移植健康者粪菌液）、FMT-CC（C57BL/6J小鼠植入肠癌患者粪菌液）、FMT-AH(Apcmin/+小鼠植入健康者粪菌液)和FMT-AC(Apcmin/+小鼠植入肠癌患者粪菌液)。为了使菌群在肠道更易定植,实验前3天各组小鼠分别给予服用含有0.2g/L氨苄青霉素+0.2g/L新霉素+0.2g/L甲硝唑+0.1g/L万古霉素的饮用水。粪菌移植（FMT）第1周,每天灌胃1次,共7次;FMT第2周,隔天灌胃1次,共3次;FMT第3周开始,每周1次,共6次;整个实验过程中,FMT共计进行16次。整个FMT过程中,每天需观察小鼠的基本情况,包括活动状态、进食水量及鼠笼中血迹情况,每周称量体重1次。于实验开始前及实验结束后（实验第9周）,收集小鼠新鲜粪便,进行肠道菌群16S r RNA焦磷酸测序。运用q PCR方法检测肠道组织各种炎症细胞因子及结肠粘膜屏障相关因子水平（包括ZO-1、Claudin3、Occludin、Muc2、Cryptdin、NLRP3、IL-1β及TNF-α等）。免疫组织化学Ki-67染色。运用Western blot方法检测总β-catenin、cyclin D1、c-myc、β-actin表达量。分离结肠粘膜组织总RNA,用分光光度计测定RNA质量,并用互补DNA（c DNA）转换试剂盒进行反向转录。实时荧光定量PCR检测Apcmin/+小鼠结肠组织基因表达量。计算样本质检表达量的差异倍数（Fold change）,筛选出>2或<0.5的差异表达基因,探讨差异表达基因对腺瘤癌变的机制及临床预后分析。结果第一部分（1）结直肠癌粪菌液供体选取符合入组标准。结直肠癌及健康者粪菌液供体间平均年龄无明显差异。两者的BMI亦无明显差异。（2）与健康者的粪便混合上清液相比,CRC患者粪便混合上清液中Roseburia的相对丰度在属水平上降低。而CRC患者粪便混合上清液中Akkermansia的相对丰度较健康者增加。第二部分（1）实验周期8周结束后,FMT-CC组和FMT-CH组小鼠全肠道均未出现腺瘤。FMT-AH组小鼠肠道出现多发散在腺瘤,以小肠近端和中段明显;FMT-AC组全肠道腺瘤明显增多,部分结肠近端可见明显增大的腺瘤。病理结果显示,FMT-AH组30%的肠道腺瘤中可见高级别上皮内瘤变,FMT-AC组90%的小鼠肠道腺瘤可见高级别上皮内瘤变,部分腺瘤病理提示黏膜内癌。（2）FMT-AC组小鼠肠道肿瘤Ki-67阳性细胞百分比较FMT-AH组明显升高,差异有统计学意义。Western blot技术检测小肠肿瘤组织中总β-连环蛋白、cyclin D1和c-myc的蛋白水平,FMT-AC组较FMT-AH组均明显增加。（3）FMT-AC组小鼠ZO-1、Claudin3、OClaudin、Muc2和Cryptdin的m RNA相对表达量明显低于FMT-AH组。（4）FMT-AC组小鼠较FMT-AH组小鼠表现为更为明显的肠道低度炎症,实时荧光定量PCR显示FMT-AC组小鼠肠道上皮细胞IL-1β、NLRP3及TNF-α相对表达量较FMT-AH组明显升高。（5）FMT-AC组小鼠回盲部短链脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸）的水平明显低于FMT-AH组。（6）FMT移植结束后,FMT-AH组和FMT-AC组粪便行16S r RNA测序分析,在属水平上,分析结果显示FMT-AC组肠道菌群构成中致病菌Prevotella较FMT-AH组显着增多,差异具有统计学意义。而益生菌属Parasutterella较FMT-AH组减少,但并无统计学差异。第三部分（1）RNA-seq高通量测序筛选出FMT-AC与FMT-AH之间差异表达基因,得到了278个符合要求的差异基因,其中228个上调基因,50个下调基因。（2）对所得到的差异基因（DEG）进行功能注释。GO分析结果得出,Wnt蛋白结合、脂质代谢过程和免疫应答途径明显增强。（3）KEGG分析显示,在注释到KEGG的差异基因主要分布在T细胞受体信号通路、RAS信号通路、Wnt信号通路和NF-κB信号通路。（4）Hubba基因应用Cytoscape工具进行差异表达基因的网络互作分析,筛选感兴趣的Hubba基因Esr1。应用TCGA数据库,在结肠癌和癌旁组织中均存在差异表达,进一步行生存分析及免疫浸润分析。（5）生存分析在总体生存率方面,ESR1的不同表达水平直接影响到机体的生存时间,与患者的总生存期存在着显着的关系。（6）免疫浸润分析应用TIMER和TISIDB在线分析工具,ESR1表达与免疫浸润淋巴细胞和免疫调节剂之间存在显着相关。结论:1、结直肠癌患者肠道菌群整体上可以促进结直肠腺瘤癌变。2、肠道菌群紊乱可能通过促进炎症反应、降低短链脂肪酸浓度和激活Wnt信号通路促进腺瘤癌变。3、RNA-seq结果显示Wnt蛋白结合、脂质代谢过程和免疫应答途径明显增强可能与腺瘤癌变密切相关。4、差异表达基因Esr1在结肠腺瘤癌变过程中参与免疫逃逸,促进肿瘤的发展。
汪璐[4]（2018）在《Notch2信号通路在宫颈癌细胞迁移及上皮间质化中的作用》文中指出宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,是女性癌症的第二大常见肿瘤。每年有超过50万例的新发病例被报道,并且大多数病例都发生在发展中国家,尤其是在发展中国家的农村地区。其中,中美洲和南美洲、加勒比、撒哈拉以南的非洲和南亚是宫颈癌发病率最高的地区,并且患者年龄常在15-44岁之间。在部分地区,宫颈癌的发生甚至己经超越了女性恶性肿瘤第一位的乳腺癌。近年来随着早期筛查、检测技术及治疗方法的发展和推广,宫颈癌的诊断和治疗取得了显着进展,但是由于地域、经济及社会文化障碍等诸多的原因,许多发展中国家及地区的早期筛查受到限制。在印度,宫颈癌诊断分期通常较晚,超过80%的印度女性患者患有局部晚期（ⅡB-Ⅳa期）,而在工业化国家通常不到50%。早期宫颈癌的预后一般良好,然而局部晚期宫颈癌的5年生存率则逐渐下降,从ⅡB期的58%、ⅢA期的35%、ⅢB期的32%,甚至到IVa期的16%。总体来说,宫颈癌的预后极差,复发或晚期宫颈癌患者的1年生存率仅为10-20%。宫颈癌的治疗是根据国际妇产科联合会（FIGO）的临床分期来进行的,常规治疗包括手术、放疗和化疗单独或联合使用。这些治疗方法效果一般,在40-50%的晚期癌症患者中仍然能观察到残留的肿瘤。化疗药物耐受、肿瘤侵袭和转移的发生导致治疗失败,也是导致大多数患者相关死亡的重要原因。人乳头状病毒（HPV）是乳头状病毒科的一种,有约8kb的非包膜双链环状DNA（dscDNA）基因组,对皮肤和粘膜上皮细胞有高亲嗜性,它可以导致多种肿瘤,包括外阴,阴道,阴茎,肛门,食管,头部和颈部等多个脏器的癌症。迄今发现的HPV种类达100多种,根据组织趋向性,分为皮肤型和粘膜型,根据致癌潜能将其分为高危型（HR-HPV）和低危型（LR-HPV）。在全球范围内,病毒感染导致的癌症占所有人类癌症的约15-20%,而其中5%的癌症是由HPV感染引起的。众多流行病学,临床和实验证据研究发现,宫颈癌的发生与HPV感染存在密切关系,尤其是高危型人乳头状病毒（HR-HPV）,在宫颈癌变过程中发挥关键作用,其中有 13 种 HR-HPV 类型（HPV 类型 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68）被认为与宫颈癌前高度病变和浸润性宫颈癌有关,16和18型HPV是最常见且高度致癌的类型,可导致70%至80%的宫颈癌。另一方面,有 12 种不同的 LR-HPV 类型（6,11,40,42,43,44,53,54,61,72,73和81）与有生殖器疣和良性宫颈病变相关,如尖锐湿疣等,其中HPV 6和11型主要引起90%以上的生殖器疣。另外,早期性暴露,多个性伴侣,吸烟,长期使用口服避孕药以及同时合并感染2型单纯疱疹病毒或者人体免疫缺陷病毒（HIV）等某些性传播,可能增加患病风险。HPV中的癌蛋白能维持细胞增殖信号,逃避生长抑制因子的管控,细胞不断复制,抵抗细胞凋亡,持续血管生成,发生侵袭和转移,导致癌前病变的发生,最终发展为侵袭性癌症,这些过程受到多种信号通路的调控,共同作用参与调控肿瘤的发生及发展。因此肿瘤相关信号通路在宫颈癌细胞中的作用研究逐渐受到学者们的关注,这些改变的信号传导途径对于HPV相关癌症的起始和维持起到至关重要的作用,而针对这些癌蛋白激活的信号通路为宫颈癌的靶向治疗提供了方向。现在的研究普遍认为高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）的持续感染是宫颈癌发生的先决条件,在己诊断的的宫颈癌病例中,有高达95%的病例发现了 HPV感染。HPV的早期（E）区编码蛋白质包括E1、E2、E4、E5、E6和E7,是病毒复制和转录所必需的;晚期（L）区域编码病毒组装,需要L1和L2两个结构衣壳蛋白。在HPV相关的癌变过程中,过度表达的E6和E7癌蛋白是宫颈上皮细胞向肿瘤转化的主要促癌因素,维持癌细胞的转化表型,因此在宫颈细胞癌变过程中上皮间质转化（EMT）过参与其中,并发挥重要作用。EMT是指己经分化成熟的上皮细胞获得部分间质细胞的生物学特性的生理过程,在肿瘤发生、发展及肿瘤的侵润、转移及复发等过程中存在密切联系。人类的大部分癌症是来源于上皮的实体瘤,Notch信号与小鼠实体瘤的连接最早出现在小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）整合试验中。在数十年前,细胞内Notch 1在人类宫颈癌中首次被检测出,促使人们对这种通路在癌症中的可能发挥的作用进行了研究。但是Notch信号与HPV之间存在着复杂的相互作用,有实验报道了它们转录调控的复杂相互作用有剂量依赖性效应,也有数据证实了解除管制的Notch信号可以推动上皮转化的作用。在HPV相关的癌变过程中,多种信号通路和蛋白分子在宫颈癌细胞的发生及转移过程中发挥调控作用,其中EMT对增强宫颈癌细胞的侵袭、转移过程发挥关键作用。EMT不仅调控多种肿瘤细胞的发生、发展过程,而且其自身也受到复杂信号通路的调控,Notch信号通路及分子参与维持和调控EMT过程。然而Notch信号通路在宫颈癌EMT生物学过程中的功能目前尚未明确。因此,通过研究Notch信号通路在宫颈癌细胞形成、耐药及EMT转化之间的作用及机制,特异性的针对宫颈癌细胞的增殖、耐药、EMT等生物学过程进行靶向治疗,对提高宫颈癌的治疗效果将会显示重大意义。本课题通过实验证实Notch信号通路对宫颈癌细胞的增殖、耐药及EMT中的影响,发现Notch信号通路在调控宫颈癌增殖和EMT过程中发挥重要作用,特异性抑制Notch信号通路可以有效的抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、成瘤能力,为宫颈癌的联合用药和靶向治疗提供可靠的实验基础。第一部分宫颈癌细胞中Notch信号通路的作用研究目的:在恶性肿瘤的发生及进展过程中,Notch信号通路的调控机制非常复杂,而Notch信号通路在宫颈癌中的具体作用机制尚未明确。本课题的此章节会检测宫颈癌细胞中Notch信号通路及下游分子的表达情况,研究Notch信号通路对宫颈癌细胞增殖、耐药及转移能力的影响,为明确Notch信号通路在宫颈癌细胞中的作用机制提供实验依据。方法:通过流式细胞仪检测HPV-16-永生化宫颈上皮细胞系和宫颈癌细胞系中的Notch基因表达的情况;使用Western blot和荧光实时定量PCR,检测Notch信号通路的相关受体和下游靶基因Hes-1在两组细胞中的表达和转录的差异;无血清悬浮培养和平板克隆形成实验则用来体外评价宫颈癌细胞成瘤、耐药能力中Notch信号通路抑制剂的影响。结果:1、Notch2mRNA和蛋白质表达在转移性宫颈癌细胞系Caski细胞中最高,并且在非转移性宫颈癌细胞系Hela细胞中次之,在正常宫颈上皮细胞系CRL2614细胞中表达最低;2、γ-分泌酶抑制剂（RO4929097）可明显降低宫颈癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力;3、γ-分泌酶抑制剂（RO4929097）处理的宫颈癌细胞对顺铂诱导的细胞毒性的敏感性增加。结论:Notch信号通路及下游靶基因在宫颈癌细胞系中表达上调,其信号通路抑制剂（RO4929097）可阻断Notch途径并抑制宫颈癌细胞系的增殖、迁移和侵袭,抑制Notch信号传导途径可增加宫颈癌细胞对化学治疗药物的敏感性,对宫颈癌的发生和转移发挥重要作用。第二部分Notch信号通路在宫颈癌细胞EMT的作用研究目的:EMT过程的激活是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的关键步骤,而Notch信号通路作为EMT过程中的信号调控途径之一,同样在肿瘤耐药、转移等过程中发挥重要的作用。但在宫颈癌细胞中,尚无文献证实宫颈癌细胞中是否发生EMT转化,并且Notch信号通路对宫颈癌细胞EMT发挥何种调控作用亦未明确。本章节将探查EMT转化在宫颈癌细胞中表达情况,验证Notch信号通路对宫颈癌细胞EMT的作用机制,为宫颈癌的靶向治疗和联合用药提供新思路。方法:采用Western Blotting检测宫颈癌细胞中EMT标志性分子的转录水平;通过细胞划痕修复实验和Transwell细胞迁移实验检测宫颈癌细胞的迁移、侵润能力;使用Notch信号通路抑制剂检测对宫颈癌细胞中EMT的影响。结果:1、抑制Notch信号传导途径可降低宫颈癌细胞系中的EMT特异性标志物的表达;2、Notch信号通路抑制剂可降低宫颈癌细胞的迁移、侵润能力。结论:宫颈癌细胞发生EMT转化,并且Notch信号通路参与宫颈癌侵润、转移过程,对宫颈癌细胞发生EMT发挥协同作用。
王茜[5]（2018）在《白藜芦醇通过下调miR-31-5p的表达抑制细胞增殖》文中认为目的:（1）探讨白藜芦醇（Resveratrol,Res.）治疗结肠炎及肠炎相关肠癌的作用与miR-31-5p的关系。（2）人hsa-miR-31-5p与小鼠mmu-miR-31同源同序列。使用过表达mi R-31的转基因小鼠造成DSS（葡聚糖硫酸钠,Dextran Sulfate Sodium）肠炎模型,观察miR-31在溃疡性结肠炎发生发展中的作用。方法:（1）HCT 116细胞系分为6组:control组,24 h白藜芦醇组,miR-31-5p mimic组,miR-31-5p mimic加24 h给药组,mi R-31-5p inhibitor组,miR-31-5p inhibitor加24 h给药组。后四组使用脂质体瞬时转染miR-31-5p mimic和miR-31-5p inhibitor至HCT 116细胞中,其中加药组再给予终浓度为10μg/mL的白藜芦醇孵育细胞。使用qRT-PCR技术验证miR-31-5p mimic和inhibitor的瞬时转染效率。miR-31-5p mimic的作用主要是过表达miR-31-5p而miR-31-5p inhibitor的作用主要是敲低miR-31-5p。（2）运用克隆集落实验,检测各组细胞在培养14天后的细胞集落形成的数目、集落大小以此判断白藜芦醇对HCT 116细胞增殖能力的影响;细胞划痕实验检测各组细胞在划痕后24小时划痕的愈合能力以判断白藜芦醇对细胞迁移能力的影响;运用新型细胞计数仪器Cytation5细胞成像微孔板检测仪动态监测control组和24 h白藜芦醇组细胞长达16小时的细胞增殖和分裂情况,进一步证实白藜芦醇对各组细胞增殖能力的影响。（3）利用流式细胞术检测各组HCT 116细胞的凋亡情况和细胞周期,观察白藜芦醇对各组细胞的凋亡和细胞周期的影响。（4）使用Targetscan,miRWalk等miRNA靶点预测网站和测序结果预测miR-31-5p的潜在mRNA靶点。qRT-PCR观察control组,miR-31-5p mimic组,miR-31-5p mimic加24 h给药组及miR-31-5p inhibitor组中miR-31-5p可能的作用靶点。（5）Western Blot法检测六组细胞中NF-κB,ERK1/2,Bcl-2和Bax蛋白的表达。（6）30只FVB小鼠随机分为4组,正常对照组,正常+DSS组,miR-31过表达对照组,miR-31过表达+DSS组。其中人hsa-miR-31-5p与FVB小鼠mmu-miR-31同源同序列。利用1%DSS诱导FVB小鼠结肠炎观察mi R-31在肠炎中的作用。造模周期为1%DSS给予2个半cycle,每两天称重并每天观察炎症体征血便和小鼠活动状态,实验结束后留取结肠组织福尔马林固定、石蜡包埋进行H&E染色观察肠炎情况。结果:（1）我们的前期实验中利用利用基因芯片技术测定溃疡性结肠炎病人肠炎组织差异性表达的miRNA、选定有差异性表达而且目前研究较少的hsa-miR-31-5p作为我们的研究对象。此外动物实验H&E染色结果表明miR-31过表达小鼠DSS诱发肠炎明显,比正常对照组小鼠严重。HE染色镜下可看到炎症细胞浸润明显,病变可至粘膜层、肌层甚至达浆膜层,隐窝大部分破坏且变形,排列紊乱。结合上述结果我们将miR-31-5p列为研究靶点。（2）qRT-PCR结果证明白藜芦醇可以时间依赖性下调HCT 116细胞中miR-31-5p的表达。HCT 116细胞转染miR-31-5p mimic和mi R-31-5p inhibitor后,miR-31-5p的表达前者增加了约80倍（P<0.01）,后者降低了约1倍（P<0.01）,证明转染有效。（3）划痕实验和克隆集落实验结果证明白藜芦醇可以减少HCT 116细胞的克隆集落数量以及抑制其迁移,且转染miR-31-5p mimic和inhibitor后,转染miR-31-5p mimic组细胞迁移面积增加（P<0.01）、克隆集落数量增加（P<0.01）,转染miR-31-5p mimic给予白藜芦醇组相比于miR-31-5p mimic组迁移面积减少（P<0.01）、克隆集落数减少（P<0.01）;miR-31-5p inhibitor组给予白藜芦醇后,迁移面积（P<0.01）和克隆集落数比control组减少（P<0.01）。（4）流式细胞结果证明,白藜芦醇可促进HCT 116细胞凋亡（P<0.01）,且使其细胞周期阻滞在G2期。miR-31-5p mimic组细胞凋亡率与control组无显着差异,但是白藜芦醇处理后细胞凋亡增加（P<0.01）;mi R-31-5p inhibitor组凋亡率显着高于control组（P<0.05）,且给白藜芦醇后凋亡增加明显（P<0.01）。细胞周期结果显示过表达miR-31-5p后,HCT 116细胞在S期的比例增加,给白藜芦醇后,S期比例减少;敲低miR-31-5p后,细胞周期比例无明显变化,但是给予白藜芦醇后细胞周期S期比例增加。（5）qRT-PCR结果证明当过表达miR-31-5p时,SATB2基因表达量比control组降低（P<0.05）,白藜芦醇处理后SATB2基因表达量增加（P<0.05）,敲低miR-31-5p后其表达量高于miR-31-5p mimic组（P<0.01）;敲低miR-31-5p的表达后PPP2R2A的表达量相比于control组上调（P<0.05）。（6）白藜芦醇可抑制NF-κB的表达（P<0.05）,与control组相比,过表达miR-31-5p时,NF-κB表达升高（P<0.05）,给予白藜芦醇后NF-κB表达比miR-31-5p mimic组下降（P<0.05）;当敲低mi R-31-5p并且给予白藜芦醇时,NF-κB表达低于control组（P<0.01）。此外,白藜芦醇还可下调Bcl-2和Bax的蛋白表达比值（P<0.05）,当过表达miR-31-5p时,Bcl-2和Bax比值高于control组（P<0.05）,当再次给白藜芦醇后Bcl-2和Bax比值减小（P<0.01）但仍高于单独给与白藜芦醇组;当敲低miR-31-5p并且给予白藜芦醇时,Bcl-2和Bax比值相对于control组下降（P<0.05）。各组ERK1/2蛋白表达无明显变化。结论:白藜芦醇对HCT 116细胞的抗增殖和促凋亡作用与靶向抑制miR-31-5p的表达有关。miR-31过表达可加重DSS诱导的溃疡性结肠炎的发生。
李宏权[6]（2016）在《Sal B-PLC-NPs防治口腔黏膜潜在恶性病变的研究》文中研究表明目的:本课题研究的目的是,验证丹酚酸B防治口腔黏膜潜在恶性病变（Oral Potentially Malignant Disorders,以下简称OPMDs）的有效性,以及比较丹酚酸B磷脂复合纳米颗粒（Sal B-PLC-NPs,以下简称Nano）防治口腔黏膜潜在恶性病变的活性是否比单纯的丹酚酸B（以下简称Free）更强。方法:本课题从体外细胞实验和动物模型体内实验两个方面（四个部分）展开。（一）体外细胞实验方面（包括第一部分实验）:本部分实验采用Nano和Free作用于口腔鳞状上皮细胞癌细胞系HN13和HN30细胞（以下分别简称癌细胞A、癌细胞B）、口腔白斑细胞系Leuk1（以下简称白斑细胞）,作相关比较研究:用激光共聚焦显微镜定性研究200μg/ml的Nano和Free分别作用于癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞的2h细胞摄取药物的定性差异。用荧光分光光度计定量研究分析Nano和Free在2h时间节点上25、50、100、200μg/ml的浓度梯度以及200μg/ml浓度条件下5、10、20、30min、1h、2h时间梯度的癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞摄取药物的定量差异。用MTS方法研究阴性空白对照组、Nano组和Free组对于癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞在25、50、100、200μg/ml浓度梯度条件下,其24、48、72、96h时间梯度抑制细胞生长增殖作用的差异。用流式细胞仪分析比较Nano和Free作用于癌细胞A（200μg/ml-24h）、癌细胞B（100μg/ml-48h）、白斑细胞（200μg/ml-48h）的条件下,阻滞细胞增殖周期的差异。用流式细胞仪分析比较Nano和Free作用于癌细胞A（200μg/ml）、癌细胞B（100μg/ml）、白斑细胞（200μg/ml）的条件下,在24h和48h两个时间点诱导细胞凋亡的差异。（二）体内动物模型实验方面（包括第二、第三、第四部分实验）:采用4NQO致癌剂诱导C57BL/6小鼠舌黏膜上皮癌变动物模型,灌胃给药干预实验动物18周,停药后继续观察4周,总共22周。进行大体观察和解剖记录、组织病理诊断、免疫组化检测细胞增殖和细胞周期指标表达的变化情况,比较Nano和Free防治4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜上皮癌变的活性。结果:（一）体外细胞实验结果:1、激光共聚焦显微镜下观测到,在Nano处理后的细胞内直观地显示出更多更强的亮蓝色荧光团。提示纳米剂型更容易被细胞摄取。2、Nano对癌细胞A在25、50、100、200μg/ml浓度、对癌细胞B在200μg/ml浓度、对白斑细胞在25、200μg/ml浓度作用2h后细胞内荧光强度比Free更强,具有统计学差异。提示对于不同系的癌细胞和OPMDs（口腔黏膜潜在恶性病变）细胞,其摄取纳米化药物峰值的药物浓度和时间节点是不同的。3、与阴性对照组相比,Nano和Free均具有抑制癌细胞A、癌细胞B和白斑细胞生长增殖的作用。其中:Nano对癌细胞A在200μg/ml-48h时、对癌细胞B在100μg/ml-96h时抑制细胞增殖作用明显强于Free;对白斑细胞在200μg/ml-96h时抑制细胞增殖作用有强于Free的趋势。提示:丹酚酸B无论对口腔鳞状上皮癌细胞或口腔白斑细胞都有抑制其生长增殖的作用,而纳米剂型对不同细胞系在特定时间和浓度条件下,其抑制活性优于非纳米剂型。4、Nano分别作用于癌细胞A（200μg/ml-24h）、癌细胞B（100μg/ml-48h）后,其增殖周期阻滞活性都比Free强。而Free作用于白斑细胞（200μg/ml-48h）后,阻滞作用比Nano更明显。细胞周期阻滞实验结果与细胞生长抑制曲线相符。5、Free诱导癌细胞A在200μg/ml-24h后凋亡率比Nano高;诱导癌细胞B在100μg/ml-48h后的早期凋亡率比Nano高;Free诱导白斑细胞在200μg/ml-24h和200μg/ml-48h后凋亡率比Nano更高。本实验结果与细胞生长抑制曲线相符。提示:从细胞周期及细胞凋亡以不同角度观察,均表现出丹酚酸B纳米剂型在特定的浓度和作用时间条件下,优于非纳米剂型。（二）体内动物模型实验结果:1、从8到30周小鼠生长发育良好,饮水先减、后增、再减,体重先增后减,没有出现意外死亡和其他疾病。小鼠自由饮用4NQO水溶液各组间没有统计学差异,说明4NQO对各组小鼠诱导致癌作用等同。根据小鼠体重变化曲线,早期小鼠体重平行增长,组间没有统计学差异,说明各组药物处理方式对小鼠没有明显毒性。2、根据4NQO阳性对照组小鼠的4、8、14、18、22周末大体解剖检查和病理诊断结果,小鼠舌黏膜上皮经历了“正常黏膜上皮→良性增生→轻度异常增生→中度异常增生→重度异常增生→黏膜上皮癌变及颈部淋巴结转移”的逐渐加重的程序式变化,说明本次实验所建立的4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜癌变动物模型是成功的。3、对药物干预组小鼠在8、14、18和22周末大体解剖检查和组织病理结果,进行评分和统计分析,发现Nano组小鼠的病情相对最轻,其次是Free组,4NQO阳性对照组病情最重,表明Nano比Free防治4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜癌变的活性更强。而相应的三个阴性对照组小鼠完全正常,说明无论是Nano或是Free都没有致癌、致畸的毒副作用。4、细胞增殖指标Ki-67、PCNA检测发现Nano具有更明显的抑制小鼠组织细胞生长增殖的趋势;5、细胞周期指标cyclin D1、p16检测表明Nano有更明显的阻滞小鼠组织细胞增殖周期的趋势。结论:本课题从体外细胞实验和体内动物模型实验两个方面证实了:1、丹酚酸B（无论纳米化或非纳米化剂型）均对HN13、HN30等口腔鳞癌细胞系、口腔白斑细胞,以及4NQO诱导的C57BL/6小鼠口腔黏膜癌变模型有抑制或阻滞作用,并且无明显毒性作用。2、细胞实验和动物实验均表明,在某些特定的药物浓度和时间节点条件下,纳米化的丹酚酸B抑癌活性比非纳米化的的丹酚酸B更强。3、纳米化的丹酚酸B比非纳米化的丹酚酸B被细胞摄取量更大,并在某些特定剂量和时间节点上,在细胞增殖、凋亡等流式细胞仪检测指标方面反应出更好的作用。这些现象是否可以用于解释纳米化丹酚酸B比非纳米化剂型抑癌活性更强,值得进一步研究。
李建波[7]（2016）在《肝癌中FAT4基因的表达与预后的相关性研究》文中提出我国是肝癌危害最严重的国家之一,由于HBV在我国的广泛肆虐流行,致其发病率和死亡率一直居高不下。肝癌的治疗方式多种多样,治疗效果强弱不一手术（如腹腔镜肝切除术）、放疗、化疗、射频消融等治疗方法的综合运用虽能治愈一部分早期患者,但对于一些中晚期患者,效果往往不够理想。而临床上发现诊断的肝癌患者往往都处于晚期,因此寻找一种更为有效的治疗方式是迫切需要的。治疗疾病最主要的就是针对病因的治疗,肝癌的发生离不开肝癌相关基因的改变,因此从基因层面上的治疗或许才称得上是根本上的治愈。基因治疗是指人为地通过调控基因的选择性表达来实现治疗疾病的目的。近年来FAT4基因作为一种抑癌基因被广泛研究,虽然FAT4基因的抑癌机制目前尚不十分明朗,但已被证实与胃癌、肺癌、肾母细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、乳癌等肿瘤具有明确的相关性。而FAT4基因是否同样在肝癌中表达,是否与预后具有相关性,相关报道不多。因此明确FAT4基因在肝癌中的表达及其与预后的关系是十分有意义的,并且可能为肝癌的基因治疗提供新的靶点。本实验通过收集我院病理科提供的2006年至2010年我院收治的肝细胞性肝癌（病理已证实且有详细随访资料）患者的手术切除的肝癌标本。用免疫组化的方法检测肝癌肿瘤组织中FAT4的表达量,对所有入组的肝癌患者免疫组化片子进行评分,整理患者的一般临床资料,肿瘤复发及预后情况,进行统计整理,分析FAT4在肝癌中的表达量与其预后的相关性,并通过甲基化特异性PCR （MSP）检测33例原发肝癌组织和配对的癌旁组织中FAT4的甲基化水平。得出结论：FAT4作为抑癌基因在肝癌中的表达存在差异,并与预后密切相关,有FAT4表达的肝癌患者对比无FAT4表达的肝癌患者预后相对较好,FAT4在肝癌中的失活可能是由于FAT4基因的甲基化引起的,但肝癌中FAT4的表达可能不是一个独立影响肝癌预后的因素。
付钰洁[8]（2014）在《白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞效应及机制研究》文中研究说明乳腺癌高居女性恶性肿瘤发病率的榜首，占所有新发女性恶性肿瘤的29%，全世界每年约有70000新病例诊断出患有乳腺癌。尽管乳腺癌的诊断技术和治疗技术已经十分先进，但是乳腺癌的致死率仍然很高。因乳腺癌死亡的病例数仅次于肺癌，位居第二，占所有死于恶性肿瘤女性的14%。据美国国家癌症研究院报告，预防是减小乳腺癌患病率至关重要的一个环节。肿瘤干细胞假说认为癌症是由比例非常小的一部分干细胞引起的。肿瘤干细胞拥有自我更新和生成肿瘤的能力。肿瘤干细胞的概念对于肿瘤预防和治疗策略方面具有深远的临床意义。这个假说很好的建立，源于肿瘤初始细胞的识别和非肥胖糖尿病联合严重免疫缺陷小鼠移植模型实验。关于乳腺癌干细胞最初的发现，揭示了人乳腺癌细胞中带有细胞表面标记ESA＋/CD44＋/CD24-/low特征的细胞亚群，具有高度致瘤性。很少量的细胞，可以是200个标记为ESA＋/CD44＋/CD24-/low的细胞，或者是1000个标记为CD44＋/CD24-/low的细胞，在异体移植到非肥胖糖尿病联合严重免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠上后，均能成瘤。如果不经过荧光标记流式分选，需要超过50000个细胞才能异体移植成瘤。后来研究发现乙醛脱氢酶也能够作为乳腺癌干细胞（Breastcancer stem-like cells, BCSCs）和正常乳腺干细胞的标记物。肿瘤干细胞能够依靠标记物分离出来，促进了对其分子机制的研究，包括来源、自我更新、分化成癌细胞、放疗化疗抵抗、侵袭性和转移性等。乳腺癌干细胞的临床分析结果表明肿瘤干细胞的比例和不良预后存在相关性。因此，迫切需要建立特别针对肿瘤干细胞的化学预防和治疗措施。因为膳食中富含具有减少癌症风险的植物性食物，所以越来越多的兴趣放在可作为潜在化学预防试剂的水果蔬菜中营养成分和非营养成分的分离和描述其特征上。天然白藜芦醇，化学式为反式-3,4′,5-三羟基-二苯基乙烯，是多酚类化合物，主要来源于葡萄、红酒、浆果、花生、虎杖、桑椹等植物性食物。研究表明白藜芦醇具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等广谱药理生物活性。白藜芦醇的抗肿瘤功效，反映在调节肿瘤的不同阶段：致癌期、癌症早期、癌症发展期、癌症转移期。但是白藜芦醇抗癌效应的潜在分子机制还没有完全阐述清楚。鉴于在乳腺致癌和癌症发展中肿瘤干细胞的重要作用，深入研究白藜芦醇对乳腺癌干细胞的作用，并探讨相关分子作用机制，对于揭示揭示白藜芦醇抑癌机理具有重要理论和现实意义。本研究评价和研究白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞的抑制效应及其分子机制。首先采用乙醛脱氢酶1联合7AAD标记乳腺癌细胞MCF-7和SUM159，流式细胞术分选得到乙醛脱氢酶阳性乳腺癌干细胞群。再用体外实验评价白藜芦醇对乳腺癌干细胞的作用。CCK-8实验检验不同浓度的白藜芦醇处理人正常乳腺上皮细胞MCF10A和人乳腺癌细胞MCF-7和SUM15924小时后细胞毒性。CCK-8实验检验不同浓度白藜芦醇处理从MCF-7和SUM159细胞中分离的乳腺癌干细胞24小时后细胞毒性。流式细胞术分析不同浓度白藜芦醇处理SUM159和MCF-7细胞24小时后，其乙醛脱氢酶阳性比例。微球体培养实验检验不同浓度白藜芦醇处理乳腺癌干细胞7天后，成微球的大小和数量。然后用体内动物实验评价白藜芦醇对乳腺癌干细胞的作用，采用非肥胖型糖尿病联合严重免疫缺陷小鼠二次成瘤模型，异体移植5×106个肿瘤细胞SUM159到五周龄雌性小鼠脂肪垫下成瘤，两周后腹腔注射白藜芦醇（100mg/kg/d）和生理盐水，连续两周，每两天观察测量一次移植瘤大小。人道处死小鼠，剥离肿瘤，用机械力或酶的作用消化分散成肿瘤单细胞，流式细胞术分析部分单细胞中乙醛脱氢酶阳性比例，剩余单细胞分为对照组和白藜芦醇用药组，同时注射入第二批小鼠左侧和右侧的脂肪垫，生长30天，观察并测量小鼠的肿瘤大小。最后探讨白藜芦醇对乳腺癌干细胞作用的分子机制，用质粒转染、激光共聚焦、扫描电镜以及蛋白免疫印迹等方法进行研究关于白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞的分子机制。实验结果：（1）白藜芦醇（10-40μmol/L）显着降低SUM159和MCF-7的细胞活力，对MCF10A几乎没有细胞毒性。白藜芦醇降低人乳腺癌细胞SUM159和MCF-7中乙醛脱氢酶阳性细胞（BCSCs）比例，减小无血清诱导微球体培养的大小及数目。（2）非肥胖糖尿病联合严重免疫缺陷小鼠异体移植瘤，与对照组相比，白藜芦醇用药组由体重变化看出白藜芦醇几乎无细胞毒性，却能通过肿瘤体积变化看出明显抑制移植肿瘤的生长，且降低了肿瘤中乙醛脱氢酶1阳性比率。从肿瘤中分散单细胞进行二次成瘤，小鼠生长30天后，6只小鼠中仅1只用药组移植肿瘤生长，而6只中对照组移植肿瘤全部生长。（3）扫描电镜观察白藜芦醇处理从SUM159和MCF-7中分离的乳腺癌干细胞，与对照组相比，细胞内自噬体数量明显增加；GFP-LC3-Ⅱ质粒转染激光共聚焦观察可见绿色荧光小点数，白藜芦醇处理组明显高于对照组；Westren blotting检测自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7表达均随白藜芦醇浓度增加而增加，表明白藜芦醇诱导乳腺癌干细胞自噬的发生。（4） Westren blotting检测Wnt/β-catenin关键性蛋白cyclin1和β-catenin，这两种蛋白表达均随白藜芦醇浓度增加而降低，免疫化学检测证明白藜芦醇的处理降低了cyclin1和β-catenin的表达，表明白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞的Wnt/β-catenin信号通路；通过质粒转染过表达β-catenin、自噬抑制剂CQ分别与白藜芦醇联合使用，能降低BCSCs比例，减少白藜芦醇对BCSCs的细胞毒性，显着抑制白藜芦醇诱导的BCSCs自噬，表明白藜芦醇至少部分是通过下调Wnt/β-catenin信号通路诱导BCSCs自噬的。全文结论：白藜芦醇在体内外均可有效抑制BCSCs，其机制涉及通过下调Wnt/β-catenin自我更新信号通路诱导BCSCs自噬发生。
许文[9]（2009）在《索拉菲尼对肝细胞癌中免疫细胞作用的实验研究》文中研究说明背景和目的:肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）被公认是常见而难治的恶性肿瘤之一。其发病隐匿,早期发生浸润和转移,生存期较短、病死率较高,目前临床采用的传统治疗手段包括:手术切除、放化疗、肝移植和介入治疗,疗效均不理想。分子靶向治疗和生物免疫治疗是目前研究的热点,具有高效、特异和低毒等的特点,也给晚期HCC患者带来新的希望。近期多项临床研究结果显示,索拉菲尼（Sorafenib）作为一种多激酶抑制剂,可以通过抑制血管内皮生长因子受体等而阻断肿瘤新生血管的形成,间接抑制肿瘤细胞的生长,并成为第一个被证实能改善晚期HCC患者生存的药物。机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切的关系,个体免疫功能低下或免疫缺陷时,肿瘤的发病率明显增多,而恶性肿瘤患者的免疫功能不全更是普遍现象。在机体免疫中扮演重要角色的巨噬细胞（Macrophage,Mφ）和自然杀伤（natural killer,NK）细胞,同样在抑制肝癌形成、生长、转移中发挥重要作用。索拉菲尼显着抑制HCC作用是否存在免疫调节的分子机制,目前并不清楚。本实验采用改良的方法建立了大鼠HCC模型,动态观察Raf、Tec等信号分子在肝癌形成过程中的表达变化情况,并在HCC形成早期和晚期使用单-双倍剂量的Sorafenib进行干预,采用免疫组化、Western Blot等方法动态观察其对HCC组织Mφ、NK细胞、CD4+ T细胞、CD8+T细胞的影响,从免疫细胞的角度来探讨Sorafenib抗肝癌作用中可能存在的免疫分子机理。研究内容与方法1.采用改良的方法建立二乙基亚硝胺诱发Wistar大鼠HCC模型;利用H-E染色、免疫组织化学、RT-PCR和Western Blot等方法动态观察Raf、Tec等信号分子在肝癌形成过程中的表达变化情况。2.在模型HCC形成早期和晚期使用单-双倍剂量的Sorafenib进行干预,采用免疫组化、Western Blot方法动态观察其对HCC组织Mφ、NK细胞、CD4+ T细胞、CD8 +T细胞的影响,并观察Sorafenib对免疫功能影响的量效关系和肝功能损伤情况。研究结果1.改良方法建立动物模型1.1生存情况:传统方法组大鼠从第12周开始相继出现死亡,截止实验结束时死亡率为19.05%（8/42）,改良方法组死亡1只,死亡率为2.38%（1/42）,两者相比连续校正的P值为0.034,有统计学意义。1.2病理变化:正常大鼠肝脏表面光滑,未见结节。实验组（传统方法组和改良方法组）的大鼠由开始的表面光滑,到粗糙,再到结节出现,结节直径大小不一,个别呈巨大型,直径达15mm,有的呈弥漫分布,有的散在存在。镜下,正常对照组大鼠肝脏亦无变化。传统方法组和改良方法组的肝脏均呈现出肝炎-肝硬化-肝癌的变化规律。1.3肝指数:传统方法组大鼠肝指数在第18周时达到峰值,之后略有下降但维持在一定水平。改良方法组12-16周数据显示虽有所下降,但总的趋势是逐渐升高的,而正常对照组一直维持在较低的水平。正常对照组和实验组（传统方法组和改良方法组）的平均值在18周后相比均有显着性差异。2.诱癌过程中有关信号分子的表达以及索拉菲尼干预后的表达变化情况在单纯模型组中,随着诱癌时间的延长,Raf、Tec蛋白的表达呈现逐渐增加的趋势,索拉菲尼干预后,尤其是早期双倍组Raf、Tec蛋白表达下降明显（P<0.05,与同期单纯模型组比较）,P53的表达虽趋于下降,但与同期单纯模型组无统计学意义。3.诱癌过程中Mφ、NK细胞以及索拉菲尼干预后的变化CD57、CD68阳性细胞的数目单纯模型组逐渐增加,其他实验组（早期单倍组、早期双倍组、晚期单倍组、晚期双倍组）分别地在第12、14周时出现峰值后出现不同程度的减少,而早期双倍组、晚期双倍组在第18周后两者数目减少不明显,其中第20、22周时早期双倍组、晚期双倍组分别与单纯模型组相比均有显着增加（P值均<0.05）,同时早期双倍组比早期单倍组,晚期双倍组比晚期单倍组以及早期双倍组比晚期双倍组亦有显着增加（P值均<0.05）,其余各组之间无明显差异。4.诱癌过程中CD4+ T细胞、CD8 +T细胞以及索拉菲尼干预后的变化实验组（包括传统方法组和改良方法组）的CD4+T细胞数量和CD4+T/CD8+T比值从第10开始是逐渐降低的（第10周和第22周相比,P均<0.01）,CD8+T细胞数量从第10开始是逐渐升高的（P<0.05）。索拉菲尼干预后和未施加干预未见明显差别。5.肝功能损伤早期单倍剂量组较单纯模型组肝功能损伤减轻,无显着性差异;早期双倍剂量组比单纯模型组损伤减轻,但有显着性差异。结论:1.索拉菲尼不仅可以抑制肝癌组织局部的血管生成,还可以下调Raf、Tec等胞内信号蛋白激酶的表达。2.索拉菲尼可能诱导Mφ、NK细胞向HCC组织发生移动聚集,逆转HCC组织局部的免疫抑制,可能是其抗肿瘤作用的免疫分子机理之一。3.索拉菲尼对肝细胞癌中Mφ、NK细胞的影响呈一定剂量依赖关系,而单-双倍剂量对肝功能损伤无显着性差异。
刘辉[10]（2009）在《EphA2在胃癌中表达的生物学意义及其体外实验研究》文中研究指明目的:胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,在我国居各类恶性肿瘤之首。近年来的研究表明,胃癌的发生发展是一个多基因参与的多阶段过程。因此,探讨胃癌的发病机制,寻找新的预防和治疗靶点以及有效的治疗药物,对降低胃癌发病率和死亡率,将有十分重要的意义。受体酪氨酸蛋白激酶（Receptor tyrosine kinase, RTK）是外界刺激信息传递至细胞核,转化成细胞效应的信号转导通路中的关键分子组成。EPH（erythropoietin-producing hepatocellular）基因家族是新发现的最大的RTK家族,而EphA2是该亚家族第三个发现并被克隆全长cDNA的成员,是该亚家族成员中被发现有酪氨酸激酶活性的第一个基因。在正常细胞,EphA2严格定位于上皮细胞膜表面的细胞间连接处,可与相邻细胞膜表面的配体EphrinA1结合后形成受体-配体复合物,继而激活胞浆的酪氨酸激酶而活化,参与胚胎发育、细胞迁移导向和血管形成等许多生理过程。EphA2正常表达时启动的信号转导途径抑制了Ras/MAPK的级联反应,削弱PDGF、EGF、VEGF等多种生长因子对MAPK的活化而抑制细胞的生长,并通过破坏细胞的灶状黏附对细胞粘附进行负调节。近年来EphA2在癌症发生发展中的作用越来越受到人们的关注。研究发现EphA2受体在许多肿瘤中有高表达和高活性,包括乳腺癌、大肠癌、前列腺癌及非小细胞肺癌,这些肿瘤细胞的生长、转化、转移与它的突变、过表达、异常定位或（和）异常活化有密切关系。因此,EphA2可能是一个肿瘤临床诊治的新靶点,但目前关于EphA2在胃癌中的异常表达尚缺乏详实的实验依据。格尔德霉素（Geldanamycin, GA）属于苯醌胺莎类抗生素,其作用靶点为热休克蛋白90（Heat Shock Protein, HSP90）,为HSP90活性的抑制剂。HSP90是一组高度保守的分子伴侣,广泛存在于生物体中,在肿瘤细胞中异常高表达,其下游底物蛋白参与了肿瘤进展的所有关键环节。HSP90的底物蛋白种类繁多,包括甾体激素受体、苏氨酸激酶受体、酪氨酸激酶受体等,EphA2作为RTK家族一员很可能是HSP90下游的底物蛋白。近年来研究表明,格尔德霉素对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用,并能诱导细胞凋亡,已成为抗肿瘤新药研究的热点。但格尔德霉素对胃癌的抑瘤作用至今未见报道,且其对细胞周期的影响及促凋亡机制是否通过调节EphA2蛋白表达量来实现尚未阐明。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNAs, dsRNA ）分子介导的序列特异性转录后基因沉默（ post- transcriptional gene silencing, PTGS）过程,为dsRNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程。目前,RNAi技术在人类基因功能研究和药物靶点鉴定等方面备受青睐,并且具有潜在的临床应用价值。为此,本研究探讨了EphA2及其配体EphrinA1在胃癌发生和发展中的表达情况及其与临床病理特征的关系,分析EphA2表达与胃癌细胞间粘附力、细胞增殖、细胞凋亡及血管形成的关系;观察HSP90抑制剂格尔德霉素对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响,并通过检测EphA2、Survivin和Caspase-3下游蛋白表达,深入探讨EphA2是否是GA抗胃癌治疗的作用靶点;并应用RNAi技术沉默EphA2,观察人胃癌细胞株MGC-803的增殖情况,进一步阐明EphA2基因表达与胃癌形成的关系,以期为EphA2成为胃癌临床预防和治疗的新靶点提供理论依据,也为最终阐明胃癌发生和发展的分子机制奠定基础。方法:1 EphA2及其配体EphrinA1在胃癌、癌旁胃黏膜、手术切缘正常胃黏膜中的表达及意义采用免疫组织化学方法检测82例原发性胃癌组织、同个体的癌旁胃粘膜（距癌边缘2-5 cm）和手术切缘正常胃黏膜（距癌边缘5 cm以上,组织学上证实）组织中EphA2、EphrinA1和E-cadherin蛋白的表达,分析其表达与胃癌临床病理特征的关系;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western Blot技术对其中随机选取的30例标本进行EphA2 mRNA及其蛋白的定量检测。采用CD34抗体对82例癌组织标记微血管内皮细胞,计算微血管密度（MVD）,分析EphA2表达与MVD之间的相关性,及它们与胃癌临床病理特征的关系;采用流式细胞术（FCM）检测82例癌组织中细胞凋亡率及增殖指数（PI）,分析EphA2表达与细胞凋亡、增殖的关系;2研究格尔德霉素对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响,探讨其调控EphA2表达的作用分子机制。常规培养人胃癌细胞系MGC-803。采用MTT法检测不同浓度的格尔德霉素（20、40、200、400、2000nmol/L）在12h、24h、48h及72h四个时间点对MGC-803细胞的增殖抑制作用;流式细胞术（FCM）测定细胞周期变化及细胞凋亡率;姬姆萨（Giemsa）染色法观察细胞形态学改变;免疫细胞化学染色法及流式细胞术分析EphA2、Survivin及Caspase-3蛋白的表达变化。3 RNAi沉默EphA2基因对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响由武汉晶赛公司根据人EphA2基因序列转录RNA的位置及小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）设计原则,设计了3个靶位点,并构建了3个针对靶位点的一个载体编码一个小发夹状RNA（small hairpin RNA, shRNA）的质粒表达载体（S1、S2和S3）,同时合成了一个阴性对照质粒表达载体（HK）。这些载体能表达绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）和具有新霉素（neomycin,neo）抗性。采用阳离子脂质体将它们转染入人胃癌MGC-803细胞;FCM、激光共聚焦显微镜观察转染效率,选择出阳离子脂质体和质粒表达载体最合适的比例;MTT观察转染效果最佳时间,用于后续实验;在转染后48h,分别采用RT-PCR和Western blot观察MGC-803细胞EphA2 mRNA和蛋白沉默效果,筛选出干扰效果最好的质粒表达载体,用于后续实验。采用干扰效果最好的质粒表达载体转染入MGC-803细胞后,观察EphA2表达、细胞增殖活性、细胞凋亡率及细胞周期的改变。结果:1不同病变胃组织EphA2蛋白及其配体EphrinA1的表达及与胃癌临床病理特征的关系免疫组化结果显示EphA2、EphrinA1蛋白表达强度:胃癌组明显高于癌旁组及正常胃粘膜组（P<0.01）;中低分化组明显高于高分化组（P<0.05）;深层浸润组明显高于浅层浸润组（P<0.05）;淋巴结转移组显着高于无淋巴结转移组（P<0.05）。E-cadherin蛋白表达强度:胃癌组明显低于癌旁组和正常胃粘膜组（P<0.01）;中低分化组明显低于高分化组（P<0.05）;深层浸润组明显低于浅层浸润组（P<0.05）;淋巴结转移组显着低于无淋巴结转移组（P<0.05）。EphA2与EphrinA1两者呈显着正相关（r=0.707, P<0.01）;两种蛋白均与E-cadherin呈显着负相关（r=-0.231, r=-0.403, P<0.01）。RT-PCR结果显示EphA2 mRNA在各组中的表达水平无显着性差异（P>0.05）,Western Blot与免疫组化结果一致。FCM结果显示EphA2高表达组细胞凋亡率显着低于低表达组（P=0.018）,而其增殖指数（PI）显着高于低表达组（P=0.002）。胃癌组织中MVD显着高于癌旁组织及正常胃粘膜（P<0.01）;MVD值与胃癌的分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关（P<0.05）,MVD值还与肿瘤直径有关（P<0.05）;EphA2表达与MVD呈显着正相关（r= 0.485, P<0.01）。2格尔德霉素（geldanamycin, GA）对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响及调控EphA2等蛋白的表达各浓度组GA均可显着抑制MGC-803细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖关系,最大抑制率可达（77.69±0.91）%;GA作用48h后的IC50为558.94nmol/L;各浓度组GA均可阻滞MGC-803细胞于S期,诱导细胞凋亡率的显着升高（P<0.01）;姬姆萨染色可见用药组细胞出现凋亡形态学改变:细胞核染色质浓缩、深染,可见核碎裂和凋亡小体;各浓度组GA可显着抑制EphA2、Survivin蛋白的表达,同时上调Caspase-3蛋白的表达（P<0.01）。3 RNAi沉默EphA2基因对人胃癌细胞MGC-803增殖和凋亡的影响当阳离子脂质体/质粒表达载体=2μl/1.0μg转染人胃癌MGC-803细胞时,转染效率能达到86.4%。MTT实验显示:转染后48h EphA2沉默效果最好。RT-PCR和Western Blot显示质粒载体S3对人胃癌MGC803细胞EphA2沉默的效果最好。EphA2表达沉默后抑制MGC-803细胞增殖,在48小时效果最好,随后逐渐下降。EphA2表达沉默后诱导MGC-803细胞凋亡,并可阻滞细胞进程,使G0/G1期细胞比例显着增加。结论:1首次联合检测EphA2、EphrinA1及E-cadherin蛋白在胃癌中的表达,证实EphA2在胃癌组织中异常高表达,并与胃癌浸润深度、分化程度降低及淋巴结转移密切相关。联合检测三种蛋白对胃癌转移、预后及恶性发展的监控具有重要意义。2 EphA2在胃癌组织中异常高表达,可抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,在胃癌的发生发展中发挥重要作用,其机制与EphA2 mRNA的转录异常无关,而可能是其翻译水平上调或蛋白质稳定性增高所致。3 EphA2在胃癌组织中的特异性高表达,可能参与肿瘤血管的生成,与胃癌的恶性进展具有密切关系。4首次报道格尔德霉素可抑制胃癌细胞增殖,阻滞细胞周期进程,诱导细胞凋亡,并进一步阐明其机制可能与下调EphA2等蛋白表达有关。5首次应用RNAi技术探讨EphA2表达在胃癌中的作用:EphA2基因沉默后,可抑制胃癌细胞的增殖,诱导其发生凋亡,提示EphA2有望成为预防胃癌发生和治疗胃癌的新靶点。
二、癌的化学预防最前沿专辑(一) 基因调节化学预防——基于致癌基因异常的新预防技术开发（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、癌的化学预防最前沿专辑(一) 基因调节化学预防——基于致癌基因异常的新预防技术开发（论文提纲范文）
（1）IRAK1在结直肠肿瘤发生中的作用及乌梅丸防治的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 前言 |
| 2. 肠癌发生发展机制 |
| 3. 肠癌发生中的炎症因素 |
| 4. IRAK1作为肿瘤治疗靶点 |
| 5. 肠癌的化学预防现状 |
| 6. 中医药对大肠癌的防治 |
| 7. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 IRAK1在结直肠肿瘤中高表达并促进肠癌细胞增殖 |
| 1. 目的 |
| 2. 材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三章 IRAK1调控MYC促进肠癌细胞增殖的分子机制研究 |
| 1. 目的 |
| 2. 材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 附图表 |
| 参考文献 |
| 第四章 乌梅丸靶向IRAK1减轻小鼠肠道肿瘤发生 |
| 1. 目的 |
| 2. 材料 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 附图表 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 水蛭提取液的制备和主要成分分析的初步研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法与步骤 |
| 1.2.1 水蛭提取液的制备和含量检测 |
| 1.2.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 水蛭提取液的制备和水蛭素含量测定 |
| 1.3.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液主要成 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 水蛭提取液的制备和检测的初步研究 |
| 1.4.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 第二部分 水蛭提取液对WERI-Rb-1 细胞活性、周期、凋亡、侵袭的影响 |
| 2.1 实验细胞、试剂及配制、仪器设备和耗材 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要实验设备仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养、传代和冻存 |
| 2.2.1 细胞培养和传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 CCK-8法检测水蛭提取液对细胞的活性影响 |
| 2.3.2 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞周期的影响 |
| 2.3.3 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.4 水蛭提取液对 WERI-RB-1 侵袭能力的影响 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 不同浓度药物对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.5.2 流式细胞技术检测药物对细胞周期的影响 |
| 2.5.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡的影响 |
| 2.5.4 transwell 实验检测水蛭提取液对 WER-Rb-1 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.6.2 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞周期的影响 |
| 2.6.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡影响 |
| 2.6.4 细胞凋亡与增殖 |
| 2.6.5 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞侵袭能力的影响 |
| 第三部分 水蛭提取液对WER-Rb-1 细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究 |
| 3.1 实验细胞、试剂、耗材和仪器设备 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要实验设备仪器 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 Elisa 实验检测水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞表达 VEGF 的影响 |
| 3.2.2 HIF-1a、MMP-9、VEGFR2 的实时定量RT-PCR检测 |
| 3.2.3 Western Blot法检测HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白表达 |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Elisa 检测培养基上清中 VEGF 蛋白的表达 |
| 3.4.2 HIF-1a基因表达 |
| 3.4.3 MMP-9基因表达 |
| 3.4.4 Western Blot 检测各组 PI3K 和 p-AKT 蛋白的表达 |
| 3.4.5 Western Blot 检测各组 HIF-1a 和 MMP-9 蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 VEGF、HIF-1a和 MMP-9 在肿瘤生成中的作用 |
| 3.5.2 PI3K/AKT信号通路在肿瘤疾病中的作用 |
| 3.5.3 水蛭素通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9 因子抑制RB细胞 |
| 第四部分 水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响 |
| 4.1 实验细胞、试剂和仪器设备 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验设备仪器 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性的影响 |
| 4.2.2 RT- PCR 检测 VEGF 和 VEGFR2 基因表达 |
| 4.2.3 Western Blot法检测VEGF、VEGFR2 的蛋白表达 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性及抑制率的影响 |
| 4.4.2 VEGFR2基因表达 |
| 4.4.3 VEGF基因表达 |
| 4.4.4 水蛭提取液对 HUVEC 细胞表达 VEGF 和 VEGFR2 蛋白的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 VEGF和 VEGFR2对血管生成的调控 |
| 4.5.2 水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和 VEGFR2的影响 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件 1 文献综述 水蛭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二 文献综述 视网膜母细胞瘤的生物标志物 |
| 参考文献 |
| 附件3 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 附件4 倒置显微镜下细胞形态 |
（3）结直肠癌患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠腺瘤癌变的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 结直肠癌患者粪菌液供体筛选及粪菌液制备 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 粪菌液供体的选择 |
| 1.1.2 粪菌液供体的筛查 |
| 1.1.3 主要实验设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 结直肠癌患者及健康者粪菌液制备 |
| 1.2.2 结直肠癌患者及健康者粪菌液检测 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 结直肠癌患者基本情况分析 |
| 1.3.2 结直肠癌患者肿瘤分型情况 |
| 1.3.3 结直肠癌及健康者粪菌液检测情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 FMT供体的筛选 |
| 1.4.2 CRC患者和健康者粪菌液供体的选择 |
| 1.4.3 CRC患者和健康者粪菌液的检测 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 结直肠癌患者粪菌移植诱导Apc~(min/+)小鼠肠癌发生 |
| 2.1 实验对象、主要试剂和设备 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要设备和仪器 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验小鼠的饲养 |
| 2.2.2 动物分组、实验干预及标本留取方法 |
| 2.2.3 实验小鼠肠道腺瘤的大体观察及病理组织学观察 |
| 2.2.4 免疫组织化学染色 |
| 2.2.5 Realtime-PCR技术 |
| 2.2.6 Western blot技术 |
| 2.2.7 Apc~(min/+)小鼠回盲部粪便短链脂肪酸水平 |
| 2.2.8 Apc~(min/+)小鼠肠道菌群检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 FMT对 Apc~(min/+)小鼠基本情况的影响 |
| 2.4.2 FMT对各组小鼠肠道腺瘤的影响 |
| 2.4.3 FMT对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 2.4.4 FMT对各组小鼠肠道屏障功能的影响 |
| 2.4.5 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道低度炎症的影响 |
| 2.4.6 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道肿瘤信号分子活化情况 |
| 2.4.7 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道短链脂肪酸浓度的影响 |
| 2.4.8 FMT对 Apc~(min/+)小鼠肠道菌群的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 Apc基因在结直肠癌中的多重作用 |
| 2.5.2 肠道炎症与结直肠癌的发生 |
| 2.5.3 肠屏障在结直肠癌发展中的作用 |
| 2.5.4 短链脂肪酸在结肠癌中的作用 |
| 2.5.5 肠道菌群与结直肠癌的关系 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 FMT对 Apc~(min/+)小鼠结直肠腺瘤癌变发生相关基因探讨 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 文库构建 |
| 3.2.2 总RNA的质量控制 |
| 3.2.3 生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 数据概况 |
| 3.3.2 差异基因筛选 |
| 3.3.3 差异基因功能注释和富集分析 |
| 3.3.4 KEGG信号通路分析 |
| 3.3.5 基因互作网络分析 |
| 3.3.6 生存分析 |
| 3.3.7 ESR1与肿瘤免疫浸润淋巴细胞的相关性分析 |
| 3.3.8 ESR1与PDCD1及LRRC32 的相关性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 GO分析讨论 |
| 3.4.2 结直肠癌中RNA-seq分析 |
| 3.4.3 肿瘤组织免疫细胞浸润与结直肠癌的发生 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道菌群在结肠癌发生过程中的作用机制 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）Notch2信号通路在宫颈癌细胞迁移及上皮间质化中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写一览表 |
| 前言 |
| 第一部分 宫颈癌细胞中Notch信号通路的作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Notch信号通路在宫颈癌细胞EMT的作用研究 |
| 前言 |
| 1、实验材料与仪器 |
| 2、实验方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 后记 |
（5）白藜芦醇通过下调miR-31-5p的表达抑制细胞增殖（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 白藜芦醇影响HCT116细胞增殖和迁移的作用机制初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 白藜芦醇抑制HCT116细胞的迁移和增殖 |
| 2.2 白藜芦醇使HCT116细胞的细胞周期阻滞于G2期 |
| 2.3 白藜芦醇抑制HCT116细胞NF-κB蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 miR-31在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎发生发展中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠一般反应及体重变化 |
| 2.2 小鼠的结肠长度 |
| 2.3 小鼠脾和胸腺质量的变化 |
| 2.4 小鼠结肠H&E染色结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 白藜芦醇通过下调miR-31-5p的表达抑制细胞增殖的机制 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 白藜芦醇可以下调miR-31-5p的表达 |
| 2.2 miR-31-5pmimic和inhibitor的瞬时转染效率 |
| 2.3 白藜芦醇下调miR-31-5p对HCT116细胞迁移的影响 |
| 2.4 白藜芦醇下调miR-31-5p对HCT116细胞克隆集落形成的影响 |
| 2.5 白藜芦醇下调miR-31-5p对HCT116细胞凋亡的影响 |
| 2.6 白藜芦醇下调miR-31-5p对HCT116细胞周期的影响 |
| 2.7 白藜芦醇下调miR-31-5p对靶基因表达的影响 |
| 2.8 白藜芦醇下调miR-31-5p对蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）Sal B-PLC-NPs防治口腔黏膜潜在恶性病变的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 绪论 |
| 第一部分 Sal B-PLC-NPs抑制口腔鳞癌细胞和白斑细胞增殖活性的体外细胞实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二部分 Sal B-PLC-NPs防治4NQO诱导C57BL/6 小鼠舌黏膜癌变的体内动物实验研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 Sal B-PLC-NPs抑制4NQO诱导C57BL/6 小鼠舌黏膜上皮细胞增殖的实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四部分 Sal B-PLC-NPs阻滞4NQO诱导C57BL/6 小鼠舌黏膜上皮细胞增殖周期的实验研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 在读期间参加及负责的课题 |
| 在读期间申请专利 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）肝癌中FAT4基因的表达与预后的相关性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 1 引言 |
| 2 实验 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（8）白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞效应及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 乳腺癌干细胞的分选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞效应研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| Resveratrol inhibits breast cancer stem-like cells andinduces autophagy via suppressing Wnt/β-cateninsignaling pathway |
| Abstract |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
| Reference |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的文章 |
| 致谢 |
（9）索拉菲尼对肝细胞癌中免疫细胞作用的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写及中英文对照表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 索拉菲尼对肝细胞癌中免疫细胞作用的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 改良法建立大鼠肝细胞肝癌模型及免疫生物学特征研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 索拉菲尼对大鼠肝细胞癌巨噬细胞和自然杀伤细胞的影响研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 干细胞、肿瘤干细胞与肝细胞癌发生关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 表皮生长因子受体与肝细胞癌分子靶向治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章 |
（10）EphA2在胃癌中表达的生物学意义及其体外实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 EphA2 在胃癌中表达的生物学意义及其体外实验研究 |
| 引言 |
| 第一部分 EphA2 及其配体EphrinA1 在胃癌组织中的表达及意义 |
| 一、胃癌组织中EphA2/EphrinA1 mRNA 及蛋白的表达及其与胃癌临床病理特征的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 二、EphA2 在胃癌组织中的表达与癌细胞的增殖、凋亡及血管生成的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 格尔德霉素对人胃癌细胞株MGC-803 增殖与凋亡的影响及调节EphA2 表达的作用机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 RNA 干扰沉默EphA2 基因对人胃癌细胞株MGC-803 生长的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 Eph 受体与Ephrin 配体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌发生发展的分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、癌的化学预防最前沿专辑(一) 基因调节化学预防——基于致癌基因异常的新预防技术开发（论文参考文献）
- [1]IRAK1在结直肠肿瘤发生中的作用及乌梅丸防治的机制研究[D]. 冯泽宇. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究[D]. 李园媛. 成都中医药大学, 2020(01)
- [3]结直肠癌患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠腺瘤癌变的研究[D]. 李晓飞. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]Notch2信号通路在宫颈癌细胞迁移及上皮间质化中的作用[D]. 汪璐. 武汉大学, 2018(01)
- [5]白藜芦醇通过下调miR-31-5p的表达抑制细胞增殖[D]. 王茜. 山西医科大学, 2018(10)
- [6]Sal B-PLC-NPs防治口腔黏膜潜在恶性病变的研究[D]. 李宏权. 上海交通大学, 2016
- [7]肝癌中FAT4基因的表达与预后的相关性研究[D]. 李建波. 浙江大学, 2016(02)
- [8]白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞效应及机制研究[D]. 付钰洁. 第三军医大学, 2014(09)
- [9]索拉菲尼对肝细胞癌中免疫细胞作用的实验研究[D]. 许文. 第三军医大学, 2009(06)
- [10]EphA2在胃癌中表达的生物学意义及其体外实验研究[D]. 刘辉. 河北医科大学, 2009(10)