一、用竞争ELISA检测火鸡冠状病毒抗体（论文文献综述）
李仕林,王雅雯,姜水兵,郭良帅,努尔麦麦提·麦麦提敏,王新新,焦海宏[1]（2021）在《致猪腹泻的冠状病毒病的研究进展》文中研究指明冠状病毒在自然界广泛存在,其宿主多样,可引起鸡、火鸡、猪、牛、犬等动物传染病。冠状病毒传染性较强、高发病率,严重制约畜牧业的发展,威胁人类健康。文章对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪急性下痢症候群冠状病毒病的病原、流行病学特征、临床病理变化、诊断及预防进行综述,进一步认识致猪腹泻的冠状病毒病的危害,为猪冠状病毒病的预防提供参考。
解文婷[2]（2019）在《猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒N蛋白交叉反应表位研究》文中研究说明猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）同属于α冠状病毒属,两者均主要通过粪-口途径传播,并引起宿主产生相似的组织病理学特征和临床症状,其临床症状主要表现为:腹泻,呕吐和脱水。两者因在仔猪中引起高死亡率,造成全球畜牧业严重的经济损失。血清学诊断在区分两种病原起到关键作用。冠状病毒主要编码四种结构蛋白,分别是:纤突（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。N蛋白在冠状病毒感染早期表达量丰富,具有良好的免疫原性。由于N蛋白缺乏糖基化位点,易于纯化,因此是PEDV与TGEV良好的诊断型抗原。而近年来,由N蛋白引起的交叉反应现象在冠状病毒中相继报道,不同病毒之间的交叉反应严重影响了病原体的特异性诊断。为了提高猪冠状病毒诊断的特异性,本研究以PEDV与TGEV作为研究对象,通过间接免疫荧光测定（IFA）和蛋白免疫印迹（Western Blot）方法分析猪冠状病毒的抗原关系。通过构建表达截短质粒,对PEDV与TGEV的交叉反应区域进行研究。在此基础上,通过一级序列与三级结构分析,针对交叉反应表位进行重点研究,期望为猪冠状病毒的特异性诊断提供理论指导依据。主要开展以下3个方面的实验内容:1.PEDV与TGEV抗原关系的研究。为了研究PEDV和TGEV病毒水平的交叉反应,使用针对PEDV或TGEV高免抗病毒血清和抗全长N蛋白多克隆抗体（PAbs）,对PEDV或TGEV感染的细胞进行IFA和Western blot检测。结果显示,抗TGEV高免血清、抗TGEV N蛋白PAb能检测到PEDV,抗PEDV高免血清、抗PEDV N蛋白PAb能检测到TGEV,表明两者在病毒水平存在双向的交叉反应;为了进一步确定N蛋白是否为交叉反应抗原,将表达PEDV或TGEV N蛋白的质粒瞬时转染到HEK-293T细胞中,收集细胞样品进行Western blot检测,发现两者N蛋白出现较强双向交叉反应。2.PEDV关键交叉反应区域的鉴定。基于预测的PEDV N蛋白的二级结构,构建了PEDV N蛋白不同长度的截短质粒。通过Western blot检测不同截短蛋白的交叉反应性。结果表明,抗TGEV N蛋白PAb能检测到PEDV N截短蛋白1-170aa与125-301aa,说明PEDV N蛋白N端区域与中间区域是重要的交叉反应区域。3.PEDV关键交叉反应表位的鉴定。基于序列比对结果与预测的PEDV N蛋白三级结构结果,找到PEDV N蛋白N端区域与中间区域位于结构表面且高度保守的氨基酸。将这些氨基酸在PEDV N蛋白全长基础上进行突变,使用针对抗全长PEDV或TGEV N蛋白PAb,通过Western blot检测不同突变体的交叉反应性。结果表明,与野生型PEDV N蛋白相比,58-RWRMRRGERIE-68、78-LGTGPHAD-85所对应的突变体与抗全长TGEV N蛋白PAb的结合能力大大减弱,与抗全长PEDV N蛋白PAb的结合能力无明显变化,说明PEDV N蛋白N端58-RWRMRRGERIE-68、78-LGTGPHAD-85是重要的交叉反应抗原表位。综上所述,本文对PEDV与TGEV的抗原关系进行了研究。在此基础上,进一步鉴定了PEDV N蛋白上两个交叉反应区域以及优势抗原表位,为猪冠状病毒的特异性免疫诊断提供新的依据。
魏姗[3]（2018）在《猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的初步鉴定》文中进行了进一步梳理猪δ冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCo V）是一种新兴冠状病毒,可引发仔猪的呕吐、腹泻、脱水,甚至死亡,给养猪业造成巨大损失。PDCo V主要编码的4个结构蛋白是:纤突蛋白（spike,S）、核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）、膜糖蛋白（membrane,M）、小膜蛋白（envelope,E）。其中,N蛋白在病毒RNA复制和产生过程中起重要作用,表达量大、保守性强,常作为其他冠状病毒检测病毒抗体的诊断抗原。决定抗原特异性的分子基础是抗原表位,通过对其进行研究,有利于进一步设计兼具有免疫活性和中和活性的多肽、新型诊断试剂和新型疫苗分子。鉴于此,本研究通过制备PDCo V N蛋白单克隆抗体并对抗原表位进行筛选与鉴定,为PDCo V诊断方法和新型疫苗的研究奠定基础。为了获取PDCo V N基因重组蛋白,本试验分别构建了PDCo V NH毒株的N基因的p ET-32a和p GEX-6p-1原核表达载体,并分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,利用浓度为1 m M的IPTG对重组菌进行诱导表达,进一步对表达的PDCo V重组N蛋白进行纯化与鉴定。结果显示,以PDCo V NH毒株病毒RNA为模板,通过RT-PCR扩增出约1 029 bp的N基因,与预期大小相符;SDS-PAGE电泳验证,结果显示,PDCo V N基因在大肠杆菌BL21（DE3）中获得成功表达,表达的重组N蛋白的分子量分别为56 k Da和64 k Da,与预期大小相符;Western blot结果中,纯化后的蛋白可以特异性的与PDCo V阳性血清发生反应,说明其抗原性良好。以表达并纯化得到的His-PDCo V-N为免疫原,免疫68周龄雌性BALB/c小鼠,共制备得到17株能特异性稳定分泌抗PDCo V N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G6、1F8、1E10、2G5、3A7、3F9、3E12、5D11、7B2、7E6、7G6、7F10、8E2、8D4、8E8、9G1、9G11。抗体亚类鉴定显示,3E12和9G11细胞株分泌的抗体亚类为Ig G2b型,其余15株均为Ig G1型,轻链均为κ链。Western blot鉴定结果显示,制备的17株单克隆抗体均与天然的PDCo V N蛋白发生免疫反应。为鉴定获得的PDCo V N蛋白单克隆抗体识别的抗原表位,对N蛋白进行了截短表达,应用Western blot试验初步确定所获得的单克隆抗体识别的主要抗原表位区域为aa51-115。本研究共得到17株稳定分泌抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体,并且鉴定出PDCo V N蛋白的主要抗原表位区域,为PDCo V N蛋白的结构功能研究以及PDCo V诊断和疫苗相关防控策略设计提供了物质基础。
杨婷,李华,谢天宏,杨水芝,洪超,岳磊,朱凡丽,张也,宋霞,龙润乡,杨蓉,罗芳宇,谢忠平[4]（2015）在《柯萨奇病毒A组16型不同纯化方法的比较研究》文中指出目的评价不同方法纯化柯萨奇病毒A组16型（Coxsakievirus A 16,CA16）的可行性和有效性。方法将CA16病毒收获液经切向流超滤浓缩后,分别进行离心、氯仿抽提、分子筛和蔗糖垫层/梯度离心,按《中国药典》（三部）（2010版）的检定要求检测不同纯化方法得到的样品,检测指标包括:感染性滴度、抗原含量、蛋白含量、比活性、HPLC纯度、残余牛血清白蛋白、残余抗生素、免疫原性。结果从比活性来看,分子筛纯化法是其他方法的221倍,明显优于其他工艺;经HPLC检测,分子筛纯化样品纯度>98%,而其他工艺均在50%以下;分子筛法所得纯化样品中牛血清白蛋白残留量符合《中国药典》要求（<50ng/剂）,去除率达99.97%;分子筛法和蔗糖垫层/梯度离心法所得纯化样品中抗生素残留量符合《中国药典》要求（<50ng/剂）,分子筛法去除率在80%以上;从免疫小鼠后的抗体阳转率来看,离心和氯仿抽提样品组阳转率为100%,分子筛组为80%,蔗糖离心组为50%;从抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）来看,氯仿抽提组最高,为1∶912。结论以Sepharose 6Fast Flow作为层析介质的分子筛法可得到高纯度的CA16病毒,综合分析,该法是CA16较为理想的纯化方法
胡晓亮[5]（2015）在《猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN-β的分子机制》文中研究表明猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virusofswine,TGEV）是引起猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）的病原。临床方面表现为严重脱水、呕吐和水样腹泻,是一种高度接触性和急性传染病。各年龄段的猪对TGEV都易感,特别能够引起两周龄以下的仔猪死亡,致死率为100%。TGE流行范围非常广,发病率和致死率极高,是我国和其他国家仔猪死亡的重要疫病之一,并且给养猪业造成了严重经济损失。本实验从黑龙江省哈尔滨市周边某猪场收集腹泻仔猪的粪便通过TGEV的N基因引物进行RT-PCR鉴定,扩增到一段约1100bp的基因序列,同时用PRRSV、PEDV和PRV的引物进行特异性实验没有扩增到目的基因,将扩增得到的目的基因与pMD18-T载体连接后进行测序分析,结果表明该基因序列与TGEV核苷酸序列相似性为98.5%,这说明腹泻仔猪的粪便中含有TGEV。将该粪便病料经适当离心,0.22μm过滤后接种PK15细胞。经过盲传8代后细胞出现典型病变,利用透射电镜观察确定该病毒的形态是有囊膜的冠状病毒,直径大小在80～100nm,将该病毒分离株命名为TGEV-HX株。分别设计10对引物对HX株进行全基因组测序,可以成功拼接成28580 bp,基因组上依次为5’-UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-E-N-ORF7-3’UTR。与国内分离株同源性很高,遗传进化树分析显示HX株与Purdue在同一个进化分支,与疫苗株H165进化关系较远。固有免疫是宿主抵御微生物入侵的第一道防线,主要过程分为干扰素（IFNs）合成通路和IFNs信号通路,IFNs与相应受体结合后激活JAK/STAT途径,进而激活ISGs产生,最终导致抗病毒感染平台产生。本实验通过利用TGEVHX和UV-TGEVHX分不同时间段分别感染PK-15,收集细胞后提取总RNA后,采用qRT-PCR方法检测IFN-α1,IFN-β,IL6,IL12,TNF-α,IRF7,Mx1,ISG56,STAT1和β-actin的转录水平,进而分析TGEVHX与固有免疫细胞因子之间的相互关系。结果发现TGEV HX能够通过其自身复制抑制IFN-α1,IFN-β,TNF-α,IRF7和ISG56的转录,对于IL6,IL12和STAT1转录水平与UV-TGEV相当,而TGEV能够诱导高水平的Mx1基因转录。这说明TGEV利用其自身复制调节细胞因子的转录,进而完成病毒复制和传播。所有冠状病毒都编码木瓜样蛋白酶（PL）,负责将病毒早期ORF1合成的多聚蛋白切割开来,是病毒复制必需基因。SARS,NL63,PEDV和MHV中都发现PL蛋白有抑制IFN-β通路的作用,而TGEV也存在PL蛋白,且晶体结构分析表明TGEV PL与SARS PL结构相似,说明存在相似的功能。本实验研究发现TGEV PL蛋白能够抑制IFN-β的合成并且不依赖于其催化活性。PL能够定位于线粒体中不能影响STING形成的二聚体,但是具有去泛素化功能能够将RIG-1和STING蛋白去泛素化阻止向下游信号转导。综上,本实验成功分离TGEV地方流行毒株TGEV HX株,对该病毒的流行病学、实验室诊断和病毒的生物学特征进行研究;TGEV HX能够通过自身复制调节宿主细胞因子的转录从而有利于自身复制;TGEV HX PL能够通过去泛素化功能抑制IFN-β的产生。
潘龙[6]（2014）在《鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白亲和肽特性及相关受体功能研究》文中研究说明鸡传染性支气管炎（avian infectious bronchitis, IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus, IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。由于IBV变异频繁,血清型复杂,所致疾病的临床表现差异较大,在不同地区和不同时间的地方流行毒株总是以各种形式出现,所以对于IBV的分子生物学研究和与病毒入侵相关受体的研究成为一个重点。IBV纤突糖蛋白（Spike, S）是位于病毒粒子表面的结构蛋白,它既有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位,具有良好的免疫原性,又含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,是冠状病毒入侵和繁殖的关键蛋白。1.本实验成功构建了编码IBV Beaudette株S1基因的pET-S1原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行了原核表达,获得了大小为63 Ku的目的条带,使用IBV全病毒多抗进行Western blot证实所表达的蛋白为IBV S1蛋白。2.利用噬菌体随机十二肽库,以IBV S1重组蛋白为靶分子,进行了四轮生物淘选。对第四轮洗脱物进行功能鉴定,淘选出10个噬菌体单克隆进行序列测定,推导多肽序列,结果表明,最终筛选出三个可以与IBV S1蛋白特异性结合的噬菌体,推导氨基酸序列为LWAQAKSLHTLA, MYSPRPPALSTV, HWDPFSLSAYFP,分别命名为L,M,H多肽,ELISA实验证明H多肽可以和S1蛋白特异性的结合,并且可以和gAPN蛋白竞争结合S1蛋白,同时H多肽可以和gAPN的多克隆抗体结合,证明所筛选出的多肽H可以模拟gAPN的抗原表位,gAPN可能作为IBV的受体和IBV的S1蛋白结合。病毒体外抑制实验表明所筛选出来的多肽H具有良好的抗病毒活性,可以有效的抑制IBV感染Vero细胞,当多肽的浓度为500μg/mL时,抑制率最大为59.6%。3.利用筛选得到的噬菌体,建立了IBV的噬菌体介导ELISA检测方法,该方法可以有效的检测到IBV抗原,检测的最低病毒量为1.21×105copeis/μL,并具有较高的特异性,同时将所建立的ELISA方法与RT-PCR法和Real-Time PCR进行了比较,检测的敏感性依次为Real-Time PCR, RT-PCR法和噬菌体ELISA法。4.用FITC标记的H多肽进行免疫荧光,在Vero细胞和CEK细胞上证明了所合成的FITC标记的多肽可以有效的与IBV结合,并对鸡在感染IBV M41后体内病毒的分布进行了研究,证实了在气管、肺脏和肾脏均能有效的检测到病毒的分布,在感染后第1d即可在气管内检测到病毒,第3d可以在肺脏和肾脏中检测到IBV,气管持续到17 d,肺脏持续到7 d,肾脏持续到10 d,兔抗IBV多抗的检测结果是气管2-10 d,肺脏2-6 d,肾脏2-7 d,证明标记多肽的效果优于多克隆抗体,具有成本低,特异性好,操作方便的优势。5.克隆了鸡氨基肽酶N（gAPN）基因全长共2 906 bp,构建了pET-gAPN原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行原核表达,得到了大小为113 Ku的目的条带。以纯化的gAPN重组蛋白为免疫原制备了多克隆抗体。利用Western blot及间接免疫荧光实验证明此多克隆抗体具有良好的生物学活性,可以与原核表达的蛋白和天然的gAPN蛋白产生特异性的条带和荧光。Western blot实验证实了原核表达的gAPN蛋白可以和IBV结合,免疫共沉淀实验表明gAPN蛋白抗体能沉淀到S1蛋白,为证明gAPN是IBV的功能受体奠定了基础,利用gAPN多克隆抗体在CEK细胞进行病毒阻断实验,证实了gAPN抗体可以阻断病毒感染CEK细胞,gAPN血清稀释度为2-1时阻断率最高,阻断率为81.14%。6.构建了真核表达质粒pcDNA-gAPN,将其转染至Hela细胞,用IBV Beaudette株进行感染,RT-PCR, Real-Time PCR和间接免疫荧光均检测到了IBV的增殖,并绘制了病毒增殖曲线,证明IBV Beaudette株可以感染转染gAPN的Hela细胞,并产生感染性病毒粒子。免疫荧光共定位和激光共聚焦证明了gAPN可以介导IBV感染细胞,gAPN的荧光位于细胞膜,病毒的荧光位于细胞浆内。用不同的IBV毒株进行实验,证实了不同的IBV毒株H120,W93,M41,HH12均能感染转染了gAPN的Hela细胞,证实了实验的可靠性,分别在转染gAPN之后的12和24 h感染IBV Beaudette株,在接毒后12 h、18 h、24 h、36 h、48 h测定病毒的滴度,证实了少量的gAPN即可介导病毒的感染,感染量与gAPN的表达量呈正相关。分别构建了真核质粒pCDNA-gAPN 945和pCDNA-gAPN1695将gAPN进行了截短表达,通过间接免疫荧光证实了gAPN的受体结合部位位于gAPN的945～1695 bp之间,对比pAPN的蛋白质结构后确定了三个位于β转角的可能作为IBV S1蛋白的结合位点,为最终确定gAPN的受体结合部位奠定了基础。
李兰兰[7]（2014）在《鸡氨肽酶N蛋白亲和肽的筛选与生物学活性鉴定》文中提出病毒受体是指存在于宿主细胞表面的,能够被病毒的吸附性蛋白识别并且与之结合,进而引起病毒感染动物的分子复合物。氨肽酶N（APN）是位于细胞表面的一种锌离子依赖的金属糖蛋向,是大多数Ⅰ型和Ⅱ型冠状病毒发生感染时的细胞受体。鸡传染性支气管炎病毒（IBV）属于Ⅲ型冠状病毒中的一种禽类冠状病毒,在进化上被认为是处于Ⅰ型和Ⅱ刑冠状病毒之间,目前IBV发生感染时的功能性细胞受体还没有完全被确定,在IBV的功能性细胞受体研究中,鸡氨肽酶N的研究最为广泛,目前IBV侵染的宿主大多限于禽类,因此更详细深入的探讨禽类APN是否是IBV感染的功能性受体是非常具有研究价值的。本实验从18日龄鸡的肾脏中提取了其总RNA,利用设计的分段引物采用RT-PCR方法对gAPN基因进行了分段克隆,然后利用SOE-PCR将各个片段连接构成了大小为2906bp的gAPN全长基因,将全长基因连接到原核表达载体pET30a （+）中构建原核表达质粒pET-gAPN,将其转化到E.Coli Rosetta中,诱导得到了大小为113kDa的重组蛋白,以重组蛋白pET-gAPN免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测多抗血清的效价高达215,以原核重组蛋白pET-gAPN和制备的多克隆抗血清进行、Vestern blot试验,结果此多抗能与pET-gAPN蛋白发生特异性反应。此外,从18日龄鸡肾组织分离到天然gAPN蛋向,Western blot检测发现多抗能与天然蛋白发生特异性结合。为了进一步检测多抗血清活性,将真核质粒pcDNA-gAPN转染到Hela细胞上,间接免疫荧光检测多抗血清与细胞上表达的蛋白有很好的反应性,说明制备的多克隆抗体具有良好的生物学活性。以表达的原核重组蛋白pET-gAPN为靶蛋白,利用噬菌体展示技术,以噬菌体十二肽库对gAPN蛋白进行四轮生物淘选,对竞争ELISA检测中阳性的单克隆进行核苷酸序列测定,推导出它们的多肽序列,选取同源性较好的两条多肽序列合成多肽HDYLYYTFTGNP （H）、 TKFSPPSFWYLH （T）。间接ELISA结果显示,所合成两种多肽具有与S蛋白多抗血清特异性结合的特性。病毒体外抑制实验表明H和T多肽对IBV在鸡胚肾细胞上的复制具有一定的抑制作用。用亲和多肽所对应的噬菌体培养物免疫鸡检测其体内抗病毒活性,结果表明多肽H、T免疫组鸡体内产生抗IBV S蛋白特异性抗体,且具有体外中和IBV的能力,荧光定量PCR检测证明免疫组雏鸡气管、肺脏和肾脏内IBV的含量有一定程度的减少,说明其有一定的抑制病毒在鸡体内繁殖的能力。本实验为进一步研究鸡APN是否能作为IBV感染的功能性受体提供了依据,也为研究开发相关的多肽疫苗提供了一些理论基础和研究依据。
孙淑芳,王媛媛,刘陆世,姜雯,彭程,孙映雪[8]（2013）在《冠状病毒概述》文中进行了进一步梳理冠状病毒（Coronaviridae/Coronaviruse,CoV）是一类严重危害人类及家畜家禽健康的病原微生物,目前发现的冠状病毒有十几种。冠状病毒在自然界中广泛存在,其自然宿主包括人、牛、猪、禽及犬、猫、鼠、蝙蝠等,该属病毒的广泛宿主特点以及自身基因组的结构特征使其在进化过程中极易发生基因重组和变异,呈现遗传多样性,新亚型及新的冠状病毒在此过程中不断出现。本文旨在对冠状病毒的分类、形态结构、基因组结构特点、分离与鉴定、感染和防治措施等进行简要论述。
徐佳[9]（2009）在《鸡传染性支气管炎病毒核蛋白抗原表位鉴定与单链抗体初步研究》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。各种日龄的鸡均易感染。该病主要造成蛋鸡产蛋量和蛋品质下降,引起肉鸡的增重和饲料转化率下降,雏鸡可由于呼吸道或肾脏感染而造成死亡。此外,IBV往往引起其他病原微生物的混合感染,从而加重了对鸡群的危害,给全球养禽业带来巨大经济损失。IBV病毒含有4种结构蛋白:纤突蛋白（Spike,S）、小膜蛋白（Small envelope,E）、膜蛋白（Membrane,M）和核蛋白（Nucleocapsid,N）。其中N蛋白是磷酸化蛋白质,可与病毒RNA结合,构成螺旋状核衣壳。N蛋白又是诱导机体免疫应答,尤其是细胞免疫应答的重要免疫原蛋白。因而N基因及其编码蛋白是IBV研究的一个热点。本研究以鸡传染性支气管炎病毒核蛋白作为研究的靶蛋白。利用鸡传染性支气管炎病毒中国分离株tl/CH/LDT3/03,经4次免疫BALB/c小鼠,无菌取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG1450进行化学融合。通过经典杂交瘤技术获得了4株杂交瘤细胞。以本研究表达的重组IBV N蛋白和全病毒作为抗原,采用间接ELISA和western blotting分析,证明4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）均能够特异地与tl/CH/LDT3/03全病毒和重组N蛋白反应,为抗传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03N蛋白的单克隆抗体,分别命名为6H3、5E12、2C4和6F9。其染色体数目分别为90、99、91和102条,单克隆抗体亚类鉴定结果为mAb 6H3、mAb 2C4属于IgG1、mAb 5E12属于IgM、mAb 6F9为IgG2b,轻链均为κ链。在此基础上,本研究对2株单克隆抗体6H3和6F9的抗原表位进行初步鉴定。首先将N基因分成相互重叠的8个片段（N1、N2、N、N4、N5、N1-1、N1-2、N1-3）克隆至pGEX-6p-1载体GST标签下游,并转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,重组蛋白分别命名为GST-N1、GST-N2、GST-N3、GST-N4、GST-N5、GST-N1-1、GST-N1-2和GST-N1-3。经western blotting分析,mAb 6H3表位的初步定位在80-99aa。而mAb 6F9表位的初步定位在64-82aa。同时,选用不同致病型和组织嗜性的IBV中国分离株CK/CH/LDL/97Ⅰ、CK/CH/LHN/00Ⅰ、CK/CH/LSD/05Ⅰ、CK/CH/LSC/99Ⅰ、CK/CH/LHLJ/04Ⅴ、CK/CH/LHB/08Ⅰ和CK/CH/LAH/08Ⅱ以及4株不同致病性的其他毒株IBN、M41、H120和T作为抗原进行了western blotting分析,结果显示mAb 6H3可与除CK/CH/LHB/08Ⅰ以外的其他IBV发生反应。推测这11个IBV分离株氨基端第80-99aa区域内含有相同的一个B细胞表位。而mAb 6F9则不与CK/CH/LAH/08Ⅱ和CK/CH/LHB/08Ⅰ这两个分离株发生反应。此外,本研究选择了mAb 6H3作为研究对象,构建了抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体（single chain variable fragment,scFv）。利用TRIzol法提取杂交瘤细胞株6H3的mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将重链和轻链通过linker连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达。对表达产物应用ProBondTMPurification System纯化系统进行蛋白纯化,将纯化后蛋白用6～0mol/L尿素梯度复性溶液对scFv变性蛋白进行复性。纯化复性后,用夹心ELISA和Western blotting测定scFv的活性,结果表明scFv不但可以与亲本病毒tl/CH/LDT3/03发生反应,而且可以与重组N蛋白发生特异性结合,这与它的亲本杂交瘤细胞株分泌的单抗的反应是一致的。该结果为IBV单链抗体作为治疗性生物制剂的研究提供了进一步研究的工具,同时对其他冠状病毒的相关研究具有借鉴意义。
华荣虹[10]（2005）在《SARS冠状病毒S蛋白抗原表位分析与定位研究》文中研究指明严重急性呼吸综合症（Severe acute respiratory syndrome, SARS）是由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的人类新发传染病,S、M、N、E蛋白是SARS-CoV病毒粒子的几种主要结构蛋白。用Lasergene软件系统分析SARS病毒结构蛋白S、M、N蛋白,预测了12个抗原表位,用这些预测表位序列设计组合成四个嵌合基因SSCV-A、SSCV-B、SSCV-C、SSCV-D。人工合成后插入pGEX-6p-1的BamHI和XhoI位点间,构建成融合表达质粒,转化宿主菌BL21经IPTG诱导后嵌合基因表达产物为可溶性蛋白。经免疫印迹试验表明嵌合基因表达产物可被SARS康复患者血清所识别,表明重组融合蛋白具有免疫反应性,提示预测表位中含有SARS-CoV结构蛋白的抗原表位。用纯化的重组融合蛋白GST-SSCV-D和GST-SSCV-A为抗原制备了一系列单克隆抗体。抗SSCV-D的单抗有两株,分别为D3D1和D3C5。将6个S蛋白预测表位分别与GST融合表达。在这6个融合蛋白中,GST-S5可以和单克隆抗体D3C5反应,GST-S2可以和单抗D3D1反应。Western blot分析表明两个单抗所识别的表位均为线性表位。两个表位分别位于SARS-CoV纤突蛋白的第447至458氨基酸残基和789至799氨基酸残基。D3D1表位（447～458）正位于S蛋白与受体结合的结构域中。 2C5是一株SARS-CoV S蛋白特异的有中和活性的单克隆抗体。以2C5为筛选靶分子,筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行ELISA分析和序列测定。在10个ELISA OD值大于0.2的阳性噬菌体克隆中,有8个噬菌体克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有该序列的噬菌体克隆能竞争抑制SARS-CoV S蛋白抗原与单抗2C5的结合。与SARS-CoV S蛋白序列比对分析发现该7肽序列散布于S蛋白的第539位到第559位氨基酸上。将S蛋白T539PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT559的21肽与GST进行融合表达,得到了可溶解的融合蛋白。该融合蛋白能不能被单抗2C5识别,但经Western blot分析表明该融合蛋白能被灭活SARS冠状病毒免疫鸡血清识别。表明T539PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT559是S蛋白的一个线性表位,而TPEQQFT为单克隆抗体2C5的模拟表位。 SARS冠状病毒S蛋白在病毒与宿主细胞受体结合、细胞膜融合及入侵、诱导机体产生中和抗体中起重要作用。S蛋白受体结合结构域的核心区域为318～510片段。克隆并融合表达了S蛋白318～510片段,分析表明原核表达的受体结合结构域融合蛋白能被SARS康复患者清和高免动物血清所识别。进一步设计了一套23个覆盖整个该受体结合结构域的长为16氨基酸残基的部分重叠的短肽,并进行了融合表达。用23个融合蛋白对受体结合结构域进行抗原表位作图。结果鉴定出两个抗原表位SRBD3(F334PSVYAWERKKISNCV349)和表位D3D1(K447LRPFERDI455)。 SARS冠状病毒S蛋白S1部分在与细胞受体结合以及诱导机体产生保护性中和抗体中发挥重要作用。用PCR扩增S1（12～672）及S1N（12～510）,S1C（318～672）和SRBD（318～510）四个片段。PCR产物分别克隆到表达载体pGEX-6p-1中,经诱导各融合蛋白均以包涵体形式表达。Western
二、用竞争ELISA检测火鸡冠状病毒抗体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用竞争ELISA检测火鸡冠状病毒抗体（论文提纲范文）
（1）致猪腹泻的冠状病毒病的研究进展（论文提纲范文）
| 1 猪流行性腹泻 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状及病理变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.5 防治措施 |
| 2 猪传染性胃肠炎 |
| 2.1 病原 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 临床症状及病理变化 |
| 2.4 诊断方法 |
| 2.5 防治措施 |
| 3 猪急性腹泻综合征 |
| 3.1 病原 |
| 3.2 流行病学 |
| 3.3 临床症状及病理变化 |
| 3.4 诊断方法 |
| 3.5 防治措施 |
| 4 展望 |
（2）猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒N蛋白交叉反应表位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 冠状病毒 |
| 1.1.1 冠状病毒概述 |
| 1.1.2 冠状病毒分类 |
| 1.2 猪肠道冠状病毒 |
| 1.2.1 猪肠道冠状病毒危害概述 |
| 1.2.2 猪肠道冠状病毒基因组结构与功能 |
| 1.2.3 猪肠道冠状病毒流行病学 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.3 交叉反应研究进展 |
| 1.3.1 不同PEDV之间的交叉保护 |
| 1.3.2 PEDV与不同属冠状病毒之间的交叉反应 |
| 第二章 研究目的及意义 |
| 第三章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分子克隆 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 目的蛋白的表达与鉴定 |
| 3.2.4 分子生物学分析 |
| 第四章 结果与分析 |
| 4.1 确定PEDV与 TGEV交叉反应现象 |
| 4.1.1 IFA法检测病毒间交叉反应 |
| 4.1.2 Western blot法检测病毒间交叉反应 |
| 4.1.3 Western blot法检测N蛋白交叉抗原反应 |
| 4.2 PEDV N蛋白交叉反应区域的鉴定 |
| 4.2.1 PEDV N各截短质粒的构建与蛋白的表达 |
| 4.2.2 Western blot法鉴定交叉反应区域 |
| 4.3 PEDV N蛋白结构预测与序列分析 |
| 4.3.1 PEDV N蛋白预测结构分析 |
| 4.3.2 PEDV与 TGEV N蛋白序列比对与分析 |
| 4.4 PEDV N蛋白交叉反应抗原表位的鉴定 |
| 4.4.1 PEDV N蛋白N端交叉反应抗原表位的鉴定 |
| 4.4.2 PEDV N蛋白中间区域交叉抗原表位的鉴定 |
| 4.4.3 灰度值分析结果 |
| 4.4.4 对交叉抗原表位的进一步鉴定 |
| 4.4.5 交叉反应表位信息汇总 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 1 文献综述 |
| 1.1 PDCoV概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 基因组结构 |
| 1.1.3 结构蛋白及功能 |
| 1.1.4 PDCoV的流行病学 |
| 1.1.5 冠状病毒跨种属传播的机制 |
| 1.1.6 PDCoV的病毒分离及体外培养特性 |
| 1.1.7 PDCoV的致病性及临床症状 |
| 1.1.8 PDCoV的诊断与检测技术 |
| 1.1.9 疾病的防治 |
| 1.2 研究目的与意义 2 猪δ冠状病毒重组N蛋白的制备与抗原性检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂、毒株及菌种 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RNA提取 |
| 2.2.2 采用RT-PCR方法将目的基因片段扩增 |
| 2.2.3 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.4 PCR产物与原核表达载体的双酶切 |
| 2.2.5 产物的连接及转化 |
| 2.2.6 鉴定重组质粒并表达蛋白 |
| 2.2.7 PDCoVN蛋白的纯化 |
| 2.2.8 PDCoV重组N蛋白的抗原性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PDCoVN基因的扩增 |
| 2.3.2 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.3 表达重组蛋白并纯化、鉴定 |
| 2.3.4 重组N蛋白的Westernblot分析 |
| 2.4 讨论 3 猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂、细胞及实验动物 |
| 3.1.2 主要实验仪器及设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.2 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 单克隆抗体的效价测定 |
| 3.3.4 抗体亚类的鉴定 |
| 3.3.5 单抗免疫活性及特异性鉴定结果 |
| 3.3.6 IFA试验结果 |
| 3.4 讨论 4 猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂、毒株及菌种 |
| 4.1.2 主要实验仪器及设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 N蛋白抗原表位的初步鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 N蛋白分段扩增、克隆与表达 |
| 4.3.2 1E10株针对抗原表位的初步鉴定 |
| 4.4 讨论 5 结论 参考文献 致谢 个人简历 |
（4）柯萨奇病毒A组16型不同纯化方法的比较研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（5）猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN-β的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 冠状病毒的概述 |
| 1.2 TGE的流行性与危害性 |
| 1.3 冠状病毒的基因组复制 |
| 1.4 TGEV分子生物学研究进展 |
| 1.4.1 TGEV的基因组结构 |
| 1.4.2 结构基因 |
| 1.5 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)诊断方法研究进展 |
| 1.5.1 病原学检测 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子诊断技术 |
| 1.6 PL蛋白研究进展 |
| 1.6.1 nsp3的功能 |
| 1.6.2 SARS PL蛋白是一种蛋白酶,具有去泛素化和去DUB活性的酶 |
| 1.6.3 PL蛋白与固有免疫的关系 |
| 1.7 本实验的研究目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒与菌种 |
| 2.1.2 样品的采集 |
| 2.1.3 常用生物学试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品的制备和病毒的分离 |
| 2.2.2 样品的PCR鉴定及电镜观察 |
| 2.2.3 总RNA的提取及反转录 |
| 2.2.4 TGEV测序引物的设计 |
| 2.2.5 TGEV全基因组的扩增 |
| 2.2.6 PCR产物纯化 |
| 2.2.7 目的基因DNA产物的连接与转化 |
| 2.2.8 质粒的提取与鉴定 |
| 2.2.9 TGEV遗传进化分析 |
| 2.2.10 TGEV与CCoV之间重组分析 |
| 2.2.11 荧光定量PCR引物的设计 |
| 2.2.12 猪天然免疫效应分子启动子荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.2.13 固有免疫分子的克隆 |
| 2.2.14 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.15 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.16 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细胞病变的观察 |
| 3.2 样品PCR检测结果 |
| 3.3 TGEV电镜观察结果 |
| 3.4 TGEV基因组各片段的PCR扩增 |
| 3.5 TGEV进化树分析 |
| 3.6 TGEV-HX的序列分析 |
| 3.7 S蛋白抗原位点分析 |
| 3.8 TGEV-HX与CCoV重组分析 |
| 3.9 巴马猪猪IFN-α1,IFN-β启动子及其NF-κB结合位点荧光素酶报告系统的建立 |
| 3.10 巴马猪固有免疫分子的RT-PCR扩增 |
| 3.11 巴马猪固有免疫分子重组质粒酶切鉴定 |
| 3.12 巴马猪固有免疫分子同源性分析 |
| 3.12.1 TLR7同源性分析 |
| 3.12.2 TLR8同源性分析 |
| 3.12.3 TLR9同源性分析 |
| 3.12.4 VISA同源性分析 |
| 3.12.5 STING同源性分析 |
| 3.12.6 IRF3同源性分析 |
| 3.13 TGEV-HX感染PK-15固有免疫分子细胞因子荧光定量分析 |
| 3.13.1 IFN-α1的检测 |
| 3.13.2 IFN-β的检测 |
| 3.13.3 IL6的检测 |
| 3.13.4 TNF-α的检测 |
| 3.13.5 IL12的检测 |
| 3.13.6 ISG56的检测 |
| 3.13.7 IRF7的检测 |
| 3.13.8 STAT1的检测 |
| 3.13.9 Mx1的检测 |
| 3.14 木瓜样蛋白酶PL1对抗IFN-β通路的研究 |
| 3.14.1 PL1抑制IFN-β启动子 |
| 3.14.2 PL1蛋白抑制IRF3的转核 |
| 3.14.3 PL1与STING的关系 |
| 3.14.4 TGEV PL1突变体与IFN-β的关系 |
| 3.14.5 TGEV PL1的亚细胞定位 |
| 3.14.6 TGEV PL1结合和去泛素化RIG-1和STING |
| 4 讨论 |
| 4.1 TGEV HX的分离鉴定 |
| 4.2 TGEV HX的序列分析 |
| 4.3 巴马猪固有免疫分子序列分析 |
| 4.4 TGEV与细胞因子 |
| 4.5 TGEV PL1对抗IFN-β通路的研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白亲和肽特性及相关受体功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 冠状病毒基因组结构和相关蛋白研究进展 |
| 1.1.1 冠状病毒的分类 |
| 1.1.2 冠状病毒基因组结构特点 |
| 1.1.3 冠状病毒基因组功能 |
| 1.1.4 冠状病毒相关受体结构和功能 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎研究进展 |
| 1.2.1 鸡传染性支气管炎的流行病学 |
| 1.2.2 鸡传染性支气管炎的临床症状和病理机制 |
| 1.2.3 鸡传染性支气管炎的诊治 |
| 1.3 噬菌体展示技术的研究进展 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术概述 |
| 1.3.2 模拟病毒蛋白表位 |
| 1.3.3 病毒作用机制的研究 |
| 1.3.4 在新型疫苗研制方面的应用 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种、载体及质粒 |
| 2.1.3 工具酶、试剂盒和抗体试剂 |
| 2.1.4 标准参照物 |
| 2.1.5 实验试剂的配制 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 IBV S1基因的克隆及原核表达质粒的构建 |
| 2.2.2 IBV S1基因的原核表达及鉴定 |
| 2.2.3 噬菌体随机十二肽库对S1重组蛋白亲和配体的生物淘选 |
| 2.2.4 噬菌体结合克隆的特征鉴定、序列测定及多肽合成 |
| 2.2.5 S1蛋白亲和多肽的体外抗病毒活性检测 |
| 2.2.6 荧光标记S1蛋白亲和多肽对IBV感染雏鸡组织内病毒的检测 |
| 2.2.7 IBV检测方法的建立 |
| 2.2.8 gAPN基因的克隆及原核表达 |
| 2.2.9 gAPN重组蛋白的纯化、多抗制备及活性鉴定 |
| 2.2.10 gAPN真核表达质粒的构建及转染 |
| 2.2.11 S1蛋白与gAPN蛋白的亲和鉴定 |
| 2.2.12 gAPN多克隆抗体对IBV感染CEK细胞的阻断 |
| 2.2.13 gAPN介导IBV感染Hela细胞 |
| 2.2.14 gAPN的生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV S1基因的克隆及原核表达质粒的构建 |
| 3.1.1 IBV S1基因的RT-PCR扩增 |
| 3.1.2 S1基因重组原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.2. S1重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3.2.1 S1重组蛋白的表达 |
| 3.2.2 S1重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.3 噬菌体十二肽库对S1重组蛋白亲和配体的生物淘选 |
| 3.3.1 S1重组蛋白的纯化 |
| 3.3.2 噬菌体十二肽库对靶分子的四轮淘洗 |
| 3.3.3 S1蛋白亲和多肽的抗病毒活性检测 |
| 3.3.4 荧光标记S1蛋白亲和多肽对IBV感染雏鸡组织内病毒的检测 |
| 3.3.5 IBV检测方法的建立 |
| 3.4 gAPN的原核表达、多抗制备及生物学功能的研究 |
| 3.4.1 gAPN基因的克隆 |
| 3.4.2 gAPN基因的原核表达 |
| 3.4.3 gAPN多克隆血清制备及生物学功能的测定 |
| 3.5 gAPN真核表达质粒的构建和瞬时转染 |
| 3.5.1 gAPN真核表达质粒的构建 |
| 3.5.2 gAPN真核表达质粒的的转染 |
| 3.6 S1蛋白与gAPN蛋白的亲和鉴定 |
| 3.6.1 S1蛋白亲和噬菌体与gAPN蛋白的竞争ELISA |
| 3.6.2 S1蛋白亲和噬菌体与gAPN多抗的间接ELISA |
| 3.6.3 原核表达gAPN蛋白与IBV的Western blot鉴定 |
| 3.6.4 IBV S1蛋白和gAPN蛋白的免疫共沉淀 |
| 3.7 gAPN多克隆抗体阻断IBV感染CKE细胞 |
| 3.7.1 gAPN多抗阻断IBV感染CEK细胞的Real-time PCR检测 |
| 3.7.2 gAPN多克隆抗体阻断IBV感染CEK细胞的病变观察 |
| 3.8 gAPN受体功能位点的鉴定 |
| 3.8.1 gAPN转染Hela细胞对IBV感染的影响 |
| 3.8.2 IBV和gAPN在BHK细胞的间接免疫荧光共定位检测 |
| 3.8.3 gAPN表达量对IBV感染Hela细胞的影响 |
| 3.8.4 gAPN对不同IBV毒株感染Hela细胞的影响 |
| 3.8.5 不同长度gAPN对IBV感染Hela的影响 |
| 3.9 gAPN的生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IBV S1蛋白的生物学功能 |
| 4.2 S1蛋白亲和肽的筛选及序列测定 |
| 4.3 IBV检测方法的建立 |
| 4.4 S1蛋白特异性标记多肽对IBV抗原分布研究 |
| 4.5 gAPN作为IBV感染细胞功能受体的鉴定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）鸡氨肽酶N蛋白亲和肽的筛选与生物学活性鉴定（论文提纲范文）
| CONTENTS |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 冠状病毒受体的研究进展 |
| 1.2 IBV感染细胞相关受体的研究进展 |
| 1.2.1 氨肽酶N(APN) |
| 1.2.2 硫酸乙酰肝素 |
| 1.2.3 唾液酸 |
| 1.3 噬菌体展示技术研究进展 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术的基本原理 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统的分类 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术的应用 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种、载体及主要相关试剂 |
| 2.1.3 实验常规试剂的配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鸡氨肽酶N基因的克隆 |
| 2.2.2 gAPN原核及真核表达载体的构建及原核重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.3 gAPN重组蛋白的纯化及复性 |
| 2.2.4 多克隆抗血清的制备 |
| 2.2.5 多克隆抗血清的鉴定 |
| 2.2.6 噬菌体随机十二肽库对gAPN蛋白亲和配体的生物淘选 |
| 2.2.7 结合克隆的特征鉴定 |
| 2.2.8 亲和噬菌体共有氨基酸序列的推导及合成 |
| 2.2.9 亲和肽的生物活性鉴定 |
| 2.2.10 亲和噬菌体体内抗病毒活性 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 gAPN基因的克隆 |
| 3.2 gAPN基因序列测定与分析 |
| 3.3 鸡APN基因的重组原核、真核表达质粒的构建、蛋白表达 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 原核重组蛋白的表达 |
| 3.3.3 原核重组蛋白的纯化 |
| 3.4 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.4.1 gAPN多克隆抗血清的效价测定 |
| 3.4.2 多克隆抗体的Western blot检测 |
| 3.4.3 多克隆抗体的IFA检测 |
| 3.5 噬菌体十二肽库对gAPN重组蛋白亲和配体的生物淘选 |
| 3.5.1 噬菌体十二肽库对gAPN重组蛋白的四轮淘洗 |
| 3.5.2 亲和多肽的生物活性检测 |
| 3.5.3 亲和噬菌体体内抗病毒活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 gAPN基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 |
| 4.2 重组蛋白的纯化及生物活性的恢复 |
| 4.3 多克隆抗体的制备及其活性检测 |
| 4.4 鸡氨肽酶N亲和肽的筛选与鉴定 |
| 4.5 亲和噬菌体体内抗病毒分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）冠状病毒概述（论文提纲范文）
| 1 分类 |
| 2 形态结构 |
| 3 基因组结构 |
| 4 主要结构蛋白 |
| 4.1 纤突蛋白 (S) |
| 4.2 膜蛋白 (M) |
| 4.3 核衣壳蛋白 (N) |
| 4.4 血凝素酯酶糖蛋白 (HE) |
| 5 分离与鉴定 |
| 6 冠状病毒感染 |
| 7 冠状病毒防治 |
| 8 冠状病毒病示例 |
| 8.1 鸡传染性支气管炎病毒 (IBV) |
| 8.2 猪传染性胃肠炎 (TGEV) |
| 8.3 人冠状病毒 |
| 8.3.1 严重急性呼吸综合征病毒 (SARS-Co V) |
| 8.3.2 新型人冠状病毒 (HCo V-EMC) |
（9）鸡传染性支气管炎病毒核蛋白抗原表位鉴定与单链抗体初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概况 |
| 1.1.1 宿主对IBV易感性的差异 |
| 1.1.2 流行病学及临床症状 |
| 1.1.3 鸡传染性支气管炎病理变化 |
| 1.1.4 IBV引起免疫反应的实质 |
| 1.1.5 IB的诊断 |
| 1.1.6 鸡传染性支气管炎病毒的研究概况 |
| 1.1.7 鸡传染性支气管炎病毒主要结构蛋白及其生物学功能 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎病毒核蛋白及其表位研究进展 |
| 1.2.1 N蛋白研究进展 |
| 1.2.2 IBV N蛋白表位研究进展 |
| 1.3 单链抗体研究进展 |
| 1.3.1 抗体的分子结构 |
| 1.3.2 单链抗体的结构 |
| 1.3.3 单链抗体的特点 |
| 1.3.4 单链抗体的改进类型 |
| 1.3.5 单链抗体基因的构建 |
| 1.3.6 单链抗体的表达 |
| 1.3.7 单链抗体的应用前景 |
| 1.3.8 单链抗体技术的发展趋势及需要解决的问题 |
| 1.3.9 冠状病毒单链抗体研究进展 |
| 第二章 抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 毒株、细胞、菌株和质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 抗原的制备 |
| 2.2.2 动物免疫 |
| 2.2.3 N基因的克隆与表达 |
| 2.2.4 表达产物的western blotting分析 |
| 2.2.5 细胞融合 |
| 2.2.6 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 抗原的纯化和免疫 |
| 2.3.2 IBV N基因的PCR扩增 |
| 2.3.3 N基因与pMD-18T载体相连的重组质粒鉴定结果 |
| 2.3.4 N基因与pGEX-6p-1载体相连的重组质粒鉴定结果 |
| 2.3.5 融合蛋白的SDS-PAGE及western blotting分析 |
| 2.3.6 ELISA筛选方法的建立 |
| 2.3.7 阳性杂交瘤细胞筛选结果 |
| 2.3.8 单抗亚型的鉴定 |
| 2.3.9 杂交瘤细胞的染色体计数 |
| 2.3.10 4株单抗与重组N蛋白的western blotting分析 |
| 2.3.11 4株单抗与鸡传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03核蛋白的western blotting分析 |
| 2.3.12 间接ELISA方法检测单抗上清的结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 鸡传染性支气管炎病毒核蛋白B细胞线性表位的鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 菌株和载体 |
| 3.1.3 工具酶和主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗IBVN蛋白单克隆抗体抗原表位设计流程 |
| 3.2.2 目的基因的克隆 |
| 3.2.3 目的基因的原核表达 |
| 3.2.4 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.5 表达产物与单克隆抗体6H3、6F9 westem blotting分析 |
| 3.2.6 融合蛋白的割胶纯化 |
| 3.2.7 抗IBV N蛋白单克隆抗体6H3、6F9抗原表位的鉴定 |
| 3.2.8 ELISA鉴定抗原表位 |
| 3.2.9 IBV的不同分离株与mAbs 6H3、6F9的反应性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 N1、N、N3、N4、N5基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 N1-1、N1-2和N1-3基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.3 N基因与的分段克隆、表达 |
| 3.3.4 mAb 6H3和mAb 6F9与N基因分段表达产物的western blotting分析 |
| 3.3.5 IBV N1基因的分段克隆与表达以及western blotting分析 |
| 3.3.6 N1-2和N1-3与N1和N2互相重叠的部分进行了克隆与表达结果 |
| 3.3.7 N1-2和N1-3与N1和N2互相重叠的部分以及western blotting分析 |
| 3.3.8 ELISA检测单克隆抗体6H3和6F9与N基因分段表达产物的反应性 |
| 3.3.9 单克隆抗体6H3和6F9与其他传染性支气管炎病毒反应结果 |
| 3.3.10 mAb 6F9和mAb 6H3与不同IBV分离株western blotting分析结果 |
| 3.3.11 mAb 6F9所识别表位的各毒株的氨基酸序列差异分析 |
| 3.3.12 mAb 6H3所识别表位的各毒株的氨基酸序列差异分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抗IBV N蛋白单链抗体的制备及其生物学活性的研究 |
| 4.1.材料与方法 |
| 4.1.1 载体、菌株、细胞 |
| 4.1.2 酶类及主要生化试剂 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 目的基因的克隆 |
| 4.2.2 目的基因的原核表达 |
| 4.2.3 单链抗体生物学活性的初步研究 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 RT-PCR产物的鉴定结果 |
| 4.3.2 VH和VL基因序列测定的结果 |
| 4.3.3 重叠延伸PCR扩增单链抗体基因的结果 |
| 4.3.4 单链抗体基因的序列测定结果: |
| 4.3.5 单链抗体基因重组表达质粒的PCR鉴定结果 |
| 4.3.6 单链抗体基因重组表达质粒的酶切鉴定结果 |
| 4.3.7 scFv的表达、纯化及SDS-PAGE分析 |
| 4.3.8 双抗体夹心ELISA方法测定scFv的活性 |
| 4.3.9 scFv与重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白Western blotting分析 |
| 4.3.10 竞争ELISA方法测定scFv的活性 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）SARS冠状病毒S蛋白抗原表位分析与定位研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 1 SARS-CoV的形态结构 |
| 2 SARS-CoV的病原学与分类 |
| 3 SARS-CoV的基因组研究进展 |
| 4 SARS-CoV的受体 |
| 5 SARS-CoV的包装信号 |
| 6 SARS-CoV基因组编码蛋白 |
| 7 SARS-CoV S蛋白抗原表位的研究进展 |
| 8 SARS-CoV N蛋白抗原表位的研究进展 |
| 9 SARS的免疫学及分子生物学诊断方法研究进展 |
| 10 SARS防治研究进展 |
| 11 存在的问题与展望 |
| 12 本研究目的与意义 |
| 研究报告 |
| 实验一 SARS冠状病毒结构蛋白表位预测及多表位嵌合基因的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 酶与标记物 |
| 1.3 抗SARS-CoV血清 |
| 1.4 结构蛋白抗原表位的预测 |
| 1.5 嵌合基因的设计与合成 |
| 1.6 pGEX-SSCV融合表达载体的构建 |
| 1.7 重组质粒的原核表达与纯化 |
| 1.8 Western biot检测融合蛋白与SARS康复病人血清的免疫反应性 |
| 2 结果 |
| 2.1 结构蛋白特性分析及表位预测 |
| 2.2 嵌合基因的设计 |
| 2.3 融合表达质粒的构建 |
| 2.4 GST-SSCV融合蛋白的表达 |
| 2.5 GST-SSCV融合蛋白的纯化 |
| 2.6 融合蛋白的免疫反应性 |
| 3 讨论 |
| 实验二 SARS冠状病毒单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 单克隆抗体的制备 |
| 1.2 表达S蛋白预测表位寡核苷酸链的设计 |
| 1.3 表达覆盖S2和S5的9氨基酸短肽系列的设计 |
| 1.4 预测表位及9肽的融合表达 |
| 1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.6 免疫印迹试验(Western blot) |
| 2 结果 |
| 2.1 预测表位及9肽融合蛋白的表达 |
| 2.2 重组多表位融合蛋白GST—D免疫印迹检测结果 |
| 2.3 预测表位融合蛋白GST—S2和GST—S5免疫印迹检测结果 |
| 2.4 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.5 单克隆抗体的表位鉴定 |
| 2.6 单克隆抗体表位的精确定位 |
| 3 讨论 |
| 实验三 SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5识别表位的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 噬菌体随机肽库、菌株和单克隆抗体 |
| 1.2 其它试剂与材料 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 噬菌体的滴定 |
| 1.5 噬菌体肽库的亲和筛选 |
| 1.6 筛选噬菌体的克隆和扩增 |
| 1.7 噬菌体序列的测定 |
| 1.8 噬菌体ELISA |
| 1.9 噬菌体竟争抑制ELISA |
| 1.10 多肽的融合表达与融合蛋白的纯化 |
| 1.11 融合蛋白与单克隆抗体2C5的ELISA分析 |
| 1.12 融合蛋白与鸡抗SARS冠状病毒血清的Western blot分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 噬菌体肽库的筛选 |
| 2.2 噬菌体的克隆与结合分析 |
| 2.3 噬菌体展示序列的测定与分析 |
| 2.4 噬菌体的竟争ELISA |
| 2.5 短肽的融合表达与纯化 |
| 2.6 融合蛋白的免疫反应性 |
| 3 讨论 |
| 实验四 SARS冠状病毒S蛋白S1部分的表达与免疫分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌种及SARS基因 |
| 1.2 血清、抗体及试剂 |
| 1.3 S1、S1N、S1C及SRBD基因片段的PCR扩增 |
| 1.4 S1、S1N、S1C及SRBD片段表达质粒的构建 |
| 1.5 重组质粒的诱导表达 |
| 1.6 表达产物的Western blot分析 |
| 1.7 表达产物的ELISA分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 重组质粒的诱导表达 |
| 2.4 表达产物的Western blot分析 |
| 2.5 表达产物的ELISA分析 |
| 3 讨论 |
| 实验五 SARS冠状病毒S1蛋白主要抗原决定区的表位作图 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒怀菌株 |
| 1.2 酶与标记物 |
| 1.3 抗SARS-CoV阳性血清及真核表达S蛋门抗原 |
| 1.4 短肽融合蛋白的设计 |
| 1.5 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达纯化 |
| 1.6 鼠抗融合蛋白血清的制备 |
| 1.7 Western blot |
| 1.8 ELISA |
| 1.9 动物免疫 |
| 1.10 间接免疫荧光试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 短肽融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.2 抗原表位作图 |
| 2.3 抗原表位的免疫原性 |
| 2.4 抗表位单因子血清的特性 |
| 3 讨论 |
| 实验六 SARS冠状病毒S蛋白受体结合结构域的表达及表位作图 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒与菌株 |
| 1.2 酶与标记物 |
| 1.3 抗SARS-CoV阳性血清 |
| 1.4 pGEX-SRBD融合表达载体的构建与表达 |
| 1.5 短肽融合蛋白的设计与表达纯化 |
| 1.6 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达纯化 |
| 1.7 鼠抗融合蛋白GST-SRBD和GST-SRBD3血清的制备 |
| 1.8 Western blot |
| 1.9 ELISA |
| 2 结果 |
| 2.1 受体结合结构域的融合表达与免疫印迹分析 |
| 2.2 短肽融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 短肽融合蛋白的Western blot分析与ELSIA分析 |
| 2.4 SRBD3的免疫原性 |
| 2.5 受体结构区抗原表位作图结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、用竞争ELISA检测火鸡冠状病毒抗体（论文参考文献）
- [1]致猪腹泻的冠状病毒病的研究进展[J]. 李仕林,王雅雯,姜水兵,郭良帅,努尔麦麦提·麦麦提敏,王新新,焦海宏. 现代畜牧兽医, 2021(02)
- [2]猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒N蛋白交叉反应表位研究[D]. 解文婷. 华中农业大学, 2019(02)
- [3]猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的初步鉴定[D]. 魏姗. 黑龙江八一农垦大学, 2018(07)
- [4]柯萨奇病毒A组16型不同纯化方法的比较研究[J]. 杨婷,李华,谢天宏,杨水芝,洪超,岳磊,朱凡丽,张也,宋霞,龙润乡,杨蓉,罗芳宇,谢忠平. 中国病毒病杂志, 2015(04)
- [5]猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN-β的分子机制[D]. 胡晓亮. 东北农业大学, 2015(12)
- [6]鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白亲和肽特性及相关受体功能研究[D]. 潘龙. 东北农业大学, 2014(05)
- [7]鸡氨肽酶N蛋白亲和肽的筛选与生物学活性鉴定[D]. 李兰兰. 东北农业大学, 2014(01)
- [8]冠状病毒概述[J]. 孙淑芳,王媛媛,刘陆世,姜雯,彭程,孙映雪. 中国动物检疫, 2013(06)
- [9]鸡传染性支气管炎病毒核蛋白抗原表位鉴定与单链抗体初步研究[D]. 徐佳. 中国农业科学院, 2009(10)
- [10]SARS冠状病毒S蛋白抗原表位分析与定位研究[D]. 华荣虹. 中国农业科学院, 2005(07)