一、转化生长因子的生物学效应与纤维化疾病的研究（论文文献综述）
王瑞洁[1]（2021）在《活血除痹汤干预Akt-mTOR自噬通路治疗硬皮病硬化期模型小鼠的机制研究》文中提出目的:验证氧化应激异常、自噬异常反应在硬皮病硬化期模型小鼠皮损中存在,并观察活血除痹汤对硬皮病硬化期模型小鼠皮损氧化应激、Akt-mTOR自噬通路、促纤维化因子和胶原蛋白的调控作用,进一步探究活血除痹汤对硬皮病硬化期的治疗作用和机制。方法:（1）实验一将60只Balb/c小鼠随机分为中药高、中、低剂量组,阳性对照组,模型组,空白对照组,共6组,每组10只。空白对照组予灭菌注射用水皮下注射,其余组予400μg/ml博来霉素皮下注射,均每日1次0.lml,连续4周进行造模。其后中药高、中、低剂量组分别予浓度0.46g/ml、0.23g/ml、0.115g/ml的活血除痹汤,阳性对照组予0.013mg/ml的秋水仙碱,模型组和空白对照组予灭菌注射用水,均每日1次,每次0.2ml灌胃,连续4周。于第8周末处死小鼠采集皮肤标本,应用荧光探针法检测皮肤组织ROS含量,HE染色镜下观察皮肤厚度和病理改变,Masson染色镜下观察胶原含量,免疫组化和Western Blot法检测皮肤组织PDGF、TGF-β表达水平,免疫组化检测PDGF、TGF-β表达部位。（2）实验二在小鼠硬皮病造模及药物干预后,应用免疫组化和Western Blot法检测皮肤组织p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、LC3-Ⅰ/Ⅱ表达水平,免疫组化检测Akt、mTOR、LC3-Ⅰ/Ⅱ表达部位。结果:（1）实验一:模型组小鼠体重较空白对照组显着下降（P<0.01）,造模区域皮肤硬化、增厚,无毛发长出;病理变化可见表皮、真皮明显增厚,可见炎性细胞浸润,毛囊等附属器结构萎缩,脂肪层厚度明显降低,胶原纤维增粗、增多,结构紊乱,染色加深。模型组皮损皮肤厚度、ROS、PDGF和TGF-β水平较空白对照组显着增高（P<0.01）,胶原表达增高（P<0.05）。药物干预后相较空白对照组:①阳性对照组和中药高剂量组体重和皮肤厚度显着下降（P<0.01）;中药中、低剂量组皮肤厚度下降（P<0.05）。②阳性对照组和中药高剂量组可显着下调胶原表达（P<0.01）,中药中、低剂量中药组可下调胶原表达（P<0.05）;③阳性对照组和中药高剂量组均可显着下调ROS水平（P<0.01）,阳性对照组效果与中药高剂量组无显着差异（P>0.05）。④阳性对照组可显着下调PDGF水平（P<0.01）,各中药组下调PDGF均有统计学差异（P<0.05）,阳性对照组与中药高、中剂量组疗效无统计学差异（P>0.05）,优于中药低剂量组（P<0.05）。⑤阳性对照组可显着下调TGF-β水平（P<0.01）,且疗效优于中药各组（P<0.05）。中药高剂量组和中药低剂量组可下调TGF-β水平（P<0.05）。相关性分析显示皮肤组织TGF-β水平与PDGF水平极强相关（r=0.964,P<0.01）,与皮肤厚度相关（r=-0.578,P<0.05）,PDGF水平与皮肤厚度强相关（r=0.616,P<0.01）;ROS含量与TGF-β强相关（r=0.691,P<0.01）,与PDGF强水平相关（r=0.684,P<0.01）,与皮肤厚度强相关（r=0.635,P<0.01）。（2）实验二:模型小鼠皮肤Akt、mTOR活化水平和LC3-Ⅰ/Ⅱ表达水平较空白对照组均显着下调（P<0.01）。药物干预后:①各用药组可显着上调p-Akt/Akt水平（P<0.01）,阳性对照组效果与中药高剂量组无显着差异（P>0.05）,阳性对照组效果显着优于中药中剂量组和中药低剂量组（P<0.05,P<0.01）,中药高剂量组效果优于中药低剂量组（P<0.05）。②各用药组可显着上调p-mTOR/mTOR水平（P<0.01）,中药高、中剂量组效果优于阳性对照组（P<0.01、P<0.05）,中药高剂量组疗效优于中药中、低剂量组（P<0.01、P<0.05）。③各用药组可显着上调LC3-Ⅰ/Ⅱ表达水平（P<0.01）,阳性对照组效果与中药高剂量组无显着差异（P>0.05）,阳性对照组效果显着优于中药中剂量组和中药低剂量组（P<0.01）,中药高剂量组效果优于中药中、低剂量组（P<0.01）,中药中剂量组疗效优于低剂量组（P<0.05）。相关性分析显示ROS浓度与Akt磷酸化水平强负相关（r=-0.610,P<0.01）,与LC3-Ⅰ/Ⅱ水平强负相关（r=-0.482,P<0.01）,与mTOR水平负相关（r=-0.508,P<0.01）;皮肤Akt磷酸化水平与TGF-β水平负相关（r=-0.562,P<0.05）,与 PDGF 水平强负相关（r=-0.689,P<0.01）;mTOR 磷酸化水平与PDGF水平负相关（r=-0.556P<0.05）,与皮肤厚度负相关（r=-0.496,P<0.05）;皮肤LC3-Ⅰ/Ⅱ水平与TGF-β水平强负相关（r=-0.734,P<0.01）,与PDGF水平极强负相关（r=-0.843,P<0.01）,与皮肤厚度负相关（r=-0.556,P<0.05）。结论:①硬皮病模型小鼠皮损外观及病理变化符合硬皮病硬化期皮肤损害表现。模型小鼠皮肤组织中ROS、PDGF、TGF-β水平均明显升高,且皮肤组织ROS含量与TGF-β、PDGF水平和皮肤厚度均有相关性,证明硬皮病皮损中存在异常氧化应激反应,且氧化应激与PDGF、TGF-β在硬皮病发病机制中存在一定的关联。②模型小鼠皮肤组织中Akt和mTOR磷酸化水平及表达均明显降低,自噬标记物LC3-Ⅰ/Ⅱ表达降低,证实硬皮病皮肤中有自噬异常降低的现象。Akt、mTOR、LC3-Ⅰ/Ⅱ活性及表达与TGF-β、PDGF、皮肤厚度存在负相关性,表明自噬可抑制纤维化进程,其机制可能与抑制促纤维化因子表达和自噬过程降解胶原有关。③相关性分析结果显示皮肤组织ROS与Akt、mTOR、LC3-Ⅰ/Ⅱ活化、表达存在负相关性,表明硬皮病中存在的氧化应激可通过调控Akt-mTOR通路活性进而抑制细胞自噬。④应用活血除痹汤和秋水仙碱治疗后,ROS受到抑制,自噬相关因子Akt、mTOR、LC3-Ⅰ/Ⅱ活性及表达增强,促纤维因子TGF-β、PDGF降低,表明二者可能通过降低组织氧化应激进而促进自噬,从而加强对胶原的降解能力,同时可下调促纤维化因子,从而减少皮肤胶原合成。⑤中药不同剂量组的调控效果随用药浓度而有变化,表明活血除痹汤可能是剂量依赖性药物,并存在一定的作用阈值,本实验中多数高剂量应用效果更佳。
杨斓[2]（2021）在《基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:特发性肺纤维化是一种慢性的致命性肺部疾病,主要影响老年群体,至今为止,其发病机制尚不完全明确,药物治疗手段有限。本研究应用生物信息学方法,通过特发性肺纤维化病人的转录组学数据探索疾病机制,比较与联系不同病人群体的疾病机制特征;从网络药理学的研究角度阐释古方人参平肺散对特发性肺纤维化的网络调控机制特点,比较与联系不同病人群体的作用机制;通过计算机模拟分子对接研究和体外实验研究,验证人参平肺散及其拆方干预特发肺纤维化的作用机制。方法:1.从美国国立生物技术信息中心GEO数据库下载GSE150910临床试验中肺移植手术病例的RNA测序原始数据,使用基因集富集分析（GSEA）挖掘特发性肺纤维化潜在的调控基因集,使用Reactome通路数据库富集分析关键通路与反应,使用R语言差异基因分析特发性肺纤维化与正常健康人的差异表达基因,分析关键基因的表达状态。2.使用加权基因共表达网络（WGCNA）分析挖掘特发性肺纤维化不同病人群体关联的基因模块,使用Reactome通路数据库富集分析不同病人群体的关键通路与反应,比较分析其共性与不同,使用文氏图分析分布在不同特征关联基因模块中的差异表达基因。3.基于网络药理学的研究策略,使用已发表研究、TCMSP、SwissTargetPrediction和Pharmapper等资源平台预测古方人参平肺散的潜在靶点,以GSEA分析得到的基因集作为疾病靶点,通过蛋白质相互作用网络和Reactome通路数据库预测人参平肺散干预特发性肺纤维化疾病的网络调控机制;以WGCNA分析得到的高、中年特征关联基因模块为疾病靶点,通过蛋白质相互作用网络和Reactome通路数据库分别预测人参平肺散对高、中年特征的网络调控机制。4.选择前述人参平肺散的网络调控机制中较为突出的TGF-β信号通路为研究对象。选择人参平肺散中的代表成分如 Ginsenoyne D、Ginsenoside 20-Glc-Rf、Notoginsenoside R1、Ginsenoside Rg1、6-Acetylacetonide、Caffeic acid、Timosaponin A1、Timosaponin B Ⅱ、Resveratrol、Rosmarinic acid、Xuelianlactone、Tectorigenin、sarsasapogenin、isomeranzin、glycyrol和Liquiritigenin作为配体,以TGF-β信号通路相关的靶点蛋白HDAC1、XPO1、HS90B、HS90A、A4、1433G、FYN、SRC、EGFR、LRRK2、ESR1、TGFB1、SMAD2、SMAD3和COL1A1为靶点,使用AutoDock进行拟分子虚对接,验证人参平肺散主要成分与靶点蛋白的结合能力。5.采用体外实验方法探讨人参平肺散全方及各拆方组（补益组、清肺组、化痰组）对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5表型转化的影响。使用PCR和Western Blot方法检测TGF-β通路的成分Smad2/3、上皮间质转化标志α-SMA、细胞外基质1型胶原COL1A1和NADPH 4型氧化酶NOX4的基因、蛋白表达水平的变化。结果:1.GSEA分析得到9个基因集,分别为HALLMARK上皮间质转化、Kras下游信号、糖酵解、血管生成、G2/M检查点、凝血、Myc靶点V2版、E2F靶点和细胞连接基因集,以及对应的485个领先基因;疾病机制主要富集于细胞外基质、细胞衰老、细胞有丝分裂周期异常、凝血、DNA修复缺陷、细胞连接、糖类代谢和程序性死亡缺陷等;信号通路集中于Ras下游的PIK3/AKT、MAPK6/MAPK4通路,Ras家族通路Rho GTPase,酪氨酸激酶受体通路,TGF β家族和TP53转录调控通路等;衰老相关性分泌表型（SASP）因子主要为白介素4和白介素13家族。差异基因分析显示衰老表型相关基因CCND2、CDKN2A、TERT、GDF15、E2F8等均在疾病组显着上调。2.WGCNA分析富集得到疾病机制主要有细胞外基质、细胞应激、免疫、有丝分裂异常、凝血、细胞连接、肌肉收缩和糖脂蛋白代谢等机制,与GSEA分析的富集结果大部分吻合。WGCNA分析得到高龄特征（65岁以上）相关基因1076个,中年特征（55-65岁）相关基因422个,两组的机制都富集在细胞外基质、免疫系统、Ras下游信号系统、TP53细胞周期调控和TGF-β信号通路等。不同的是细胞周期异常、固有免疫和获得性免疫等反应在中年特征中更为显着;细胞衰老、未折叠蛋白质反应和内质网应激等在高龄特征中更显着富集。与高、中年特征关联的差异基因分别有203个和39个,其中有4组差异基因具有高度相关性,且与高龄特征相关,分别是（1）CDH2、SFRP1、SERPINE2、CXCL12、SFRP4和GEM,与上皮间质转化活动密切相关。（2）GREM1、VCAM1、PTHLH和RGS4,与上皮间质转化活动密切相关;（3）SLC7A5和HIF1A,与G2/M检查点活动有关;（4）UGT2B17和SLC12A3,与Kras下游信号密切相关。3.靶点整理共获取人参平肺散的药理靶点608个,与GSEA分析得到的基因集进行蛋白质相互作用网络分析得到核心靶点152个,机制主要涉及蛋白质翻译后修饰、细胞周期、DNA修复、TP53和FOXO为代表的转录调控活动、氧化应激和致癌基因诱导的衰老、SASP、固有凋亡途径、分子伴侣介导的自噬、细胞因子、固有免疫系统、雌激素受体介导的信号系统、Ras下游信号和TGF-β1信号通路等。人参平肺散成分与中、高年特征相关基因的核心干预靶点各有83个和90个,分别富集后,机制都主要涉及蛋白质翻译后修饰、细胞周期、TP53为主的转录调控活动、DNA修复、分子伴侣介导的自噬、氧化应激诱导的细胞衰老、SASP、免疫反应、Ras下游信号通路和TGF-β信号通路等。不同之处在于高龄组中金属蛋白酶的泛素化反应,SKP2介导的p27/p21的降解反应,获得性免疫反应尤为显着,此外致癌基因诱导的衰老、SASP和固有凋亡等也显着富集。中年组中FOXO、E2F6为主的转录调控活动和Toll样受体3层级反应为主的固有免疫反应尤为突出,此外囊泡运输、血小板聚集、焦亡和坏死也富集明显。4.经过计算机模拟对接验证,除了人参成分Ginsenoyne D的结合分数略低以外,其它成分与TGF-β通路成分HDAC1、XPO1、TGFB1、SMAD2和SMAD3蛋白的结合分数都达到了-5 kcal mol-1 以下。除知母成分Timosaponin AI、Timosaponin BⅡ对HS90A蛋白,人参成分Ginsenoyne D对HS90B和EGFR蛋白,桑白皮成分Xuelianlactone对LRRK2蛋白的结合分数较低,其它成分对TGF-β通路的间接作用靶点HS90B、HS90A、A4、1433G、FYN、SRC、EGFR、LRRK2和ESR1蛋白结合能力都达到了-5 kcal mol-1以下。所有成分与COL1A1蛋白结合能力都达到了-5 kcal mol-1以下。5.体外实验发现与模型组相比,全方组和各拆方组可明显降低α-SMA和COL1A1的mRNA和蛋白表达水平,提示全方组和各拆方组可以影响α-SMA和COL1A1基因的转录水平和转录后调控;全方组和清肺组可显着降低p-SMAD2的mRNA和蛋白表达水平,提示全方组和清肺组对该基因的转录水平和转录后调控都有明显疗效,补益组和化痰组对该基因的转录无明显调控作用;全方组和清肺组可显着降低p-SMAD3的mRNA和蛋白表达水平,补益组可显着降低mRNA水平,但蛋白表达无差异,说明全方组和清肺组对该基因的转录水平和转录后调控都有明显疗效,补益组对该基因的转录水平有明显调控作用,化痰组对该基因的转录无明显调控作用;全方组及各拆方组均可显着降低NOX4的mRNA和蛋白表达水平,说明全方组和各拆方组可以影响该基因的转录水平和转录后调控。结论:1.研究发现特发性肺纤维化病人的疾病机制与上皮间质转化、凝血、血管生成和糖酵解有关,并存在p16、TERT、CCND2和GDF15等细胞衰老表型,推测可能与Kras、Myc致癌基因诱导的衰老机制有关。研究既肯定了以往特发性肺纤维化异常基因与机制的研究,也发现了新的疾病机制特点和分子标志,如细胞周期异常、固有免疫和获得性免疫反应在55-65岁人群更为显着,细胞衰老、线粒体应激和未折叠蛋白质反应在65岁以上人群更为显着,得到了具有高度关联性,且与65岁以上特征相关的差异基因如GREM1、VCAM1、PTHLH和RGS4等。这些结果可能成为疾病的潜在靶点。2.人参平肺散可能通过蛋白质翻译后修饰、细胞周期、DNA修复、基因转录调控、氧化应激和致癌基因诱导的细胞衰老和免疫反应等机制干预特发性肺纤维化;可能通过金属蛋白酶降解,SKP2介导的p27/p21的降解反应和获得性免疫反应等机制干预65岁以上的病人;可能通过FOXO、E2F6的转录调控活动和固有免疫反应等机制干预55-65岁的病人。这些结果可能为进一步的实证研究提供理论依据。3.人参平肺散的代表成分与TGF-β信号通路中的成分蛋白和间接反应蛋白结合能力良好,为实证研究提供了理论基础。本章体外实验显示,人参平肺散全方和各拆方组可下调TGF-β1诱导的成纤维细胞间质标志α-SMA的升高,从而抑制成纤维细胞的表型转化。人参平肺散全方及拆方组均可减少TGF-β1诱导的成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白COL1A1的表达,从而抑制细胞外基质的沉积。人参平肺散全方和各拆方组均可下调TGF-β1诱导的成纤维细胞的促ROS生成酶NOX4的升高,从而抑制氧化应激压力。此外,人参平肺散全方和清肺组均可以抑制TGFβ的通路成分SMAD2/3的磷酸化。综上所述,人参平肺散可改善TGF-β1诱导后肺成纤维细胞的表型转化,可能是通过下调TGF-β通路中的SMAD2/3的磷酸化从而抑制了间质转化、细胞外基质沉积和氧化应激而作用。这些结果为进一步的实证研究提供了一定的依据。
牛红萍[3]（2021）在《调肾通络方防治重度宫腔粘连术后再粘连的临床疗效及其调控TGF-β1/Smads信号通路的作用机制研究》文中认为目的1.通过临床对照研究,观察调肾通络方防治重度IUA术后再粘连的临床疗效,以期为IUA患者提供一种简便、实用且有效的治疗方法。2.通过对IUA患者子宫内膜病理切片进行回顾性分析,明确IUA纤维化程度以及TGF-β1/Smads信号通路与IUA发生发展的相关性。3.经SD大鼠IUA模型体内实验,在组织水平从TGF-β1/Smads信号通路角度,分析调肾通络方防治IUA术后再粘连的疗效机制及作用靶点。4.经SD大鼠ESCs体外实验,在细胞水平从TGF-βl/Smads信号通路角度,分析调肾通络方防治IUA术后再粘连的疗效机制及作用靶点。方法1.随机对照观察调肾通络方防治重度IUA术后再粘连的临床疗效选取2019年4月至2020年12月在云南中医药大学第一附属医院（云南省中医医院）妇科就诊患者,按照纳入标准纳入重度IUA患者60例,随机分为治疗组和对照组（n=30）。治疗组平均年龄29.87±4.06岁,平均病程3.53±1.70月;宫腔操作次数为2.10±0.0.71次,宫腔粘连评分为15.33±6.78。对照组平均年龄29.30±3.23岁,平均病程3.73±1.80月;宫腔操作次数为1.87±0.68次;宫腔粘连评分为14.93±6.50;两组患者年龄、病程、宫腔操作次、宫腔粘连评分差异无统计学意义（P>0.05）。治疗组予调肾通络方治疗,对照组予芬吗通治疗,两组均治疗3个月经周期,经期停药,随访半年。采用以下指标评价各组疗效:术后3个月宫腔粘连评分,排卵日子宫内膜厚度以及PI、RI,月经量、色、质,腹痛、腰酸、焦虑等症状积分。2.IUA子宫内膜纤维化程度以及TGF-β1/Smads信号通路与IUA的相关性随机调取2018年1月至2019年5在云南中医药大学第一附属医院（云南省中医医院）妇科就诊的IUA患者子宫内膜内膜组织病理切片30例（轻、中、重各10例）;非粘连子宫内膜病理切片10例,为同期因宫内膜增厚行宫腔镜刮宫术,且内膜组织病检证实为子宫内膜单纯性增生10例。采用HE染色进行腺体计数,Masson染色评估胶原纤维面积明确IUA纤维化程度;免疫组化法检测与TGF-β1/Smads信号通路相关的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7表达水平,证实TGF-β1/Smads信号通路与IUA发生发展的相关性。3.动物实验采用双重损伤法构建稳定的SD大鼠IUA动物模型,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、调肾通络方低剂量组（2.875g/kg TTR）、中剂量组（5.75g/kg TTR）以及高剂量组（11.5g/kg TTR）。每组5只大鼠（每组共计10个子宫标本）。正常对照组、模型对照组常规喂食,喂食方法同给药组,并予给药组同等剂量生理盐水灌胃。调肾通络方低、中、高剂量组分别予调肾通络方免煎颗粒2.875g·kg-1、5.75g·kg-1、11.5g·kg-1灌胃8周。获取内膜标本,HE及Masson染色观察各组子宫内膜形态、腺体计数以及胶原面积,分析调肾通络方对SD大鼠IUA子宫内膜纤维化进展的影响;免疫组化检测Vimentin表达水平,分析调肾通络方对SD大鼠IUA子宫内膜细胞增殖的影响;qPCR法检测各组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7mRNA 表达水平,Western Blot 法检测 TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白表达水平,从TGF-β1/Smads角度分析调肾通络方防治IUA术后再粘连的作用机制及靶点。4.细胞实验提取SD大鼠ESCs,细胞培养48h后,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、5%、10%、20%调肾通络方含药血清组。正常对照组常规胎牛血清培养。模型对照组、肾通络方含药血各组以50ng/ml TGF-β1作用于ESCs 48h,之后模型对照组加入常规饲养大鼠血清,调肾通络方各组分别加入5%、10%、20%调肾通络方含药血清。各组于37℃培养箱中培养72h,收集上清液和细胞。qPCR检测各组Smad2、Smad3、Smad7mRNA表达水平;Western Blot 检测 Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7 蛋白表达水平,在细胞水平从TGF-β1/Smads角度分析调肾通络方对ESCs的影响。结果1.临床疗效治疗3个月经后期后,治疗组宫腔镜粘连评分、排卵日子宫内膜厚度、PI、RI、症状积分分别为 5.67±3.04、8.64±1.38、0.77±0.14、0.49±0.04、32.00±7.93。对照组宫腔镜粘连评分、排卵日子宫内膜厚度、PI、RI、症状积分分别为8.57±3.93、7.08±1.83、0.96±0.14、0.53±0.04、38.00±7.85。两组治疗前后各项指标均较治疗前改善,差异显着（P<0.05）。与对照组比较,治疗组粘连评分、排卵日子宫内膜厚度、PI、RI、症状积分明显改善,优于对照组,差异显着（P<0.05）。治疗组防治IUA术后再粘连总有效率为83.3%,对照组总有效率为53.3%,治疗组明显优于对照组,差异显着（P<0.05）。2.IUA纤维化程度及与TGF-β1/Smads信号通路的相关性（1）各组子宫内膜腺体计数:HE染色结果显示非粘连组腺体丰富,呈圆形或长椭圆形,计数为48.13±6.55。粘连组腺体稀少,轻、中、重度粘连腺体计数分别为24.8±2.15、18.7±1.34、12.1±2.08。与对照组比较,粘连组腺体计数明显下降,差异显着（P<0.001）,且与粘连程度呈负相关。（2）各组子宫内膜胶原纤维面积比:Masson染色结果显示非粘连组组蓝染区域不明显,胶原纤维面积小,面积比率为0.489±0.241。粘连组可见明显蓝染区域,胶原纤维面积广泛,轻、中、重度粘连面积比率分别为12.92±5.054、25.82±2.636、32.5±6.969。与对照组比较,粘连组胶原纤维面积明显增加,差异显着（P<0.001）,且与粘连程度呈正相关。（3）各组子宫内膜组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7表达:免疫组化结果显示TGF-β1在各组子宫内膜腺上皮和间质均有表达,但主要表达于腺上皮细胞。非粘连组、轻、中、重度粘连组 TGF-β1 相对表达量分别为 1.37±0.49、2.90±0.31、3.80±0.42、4.50±0.42。与非粘连组比较,粘连组TGF-β1表达明显上调,并与粘连程度呈正相关,差异显着（P<0.01）。Smad2在各组子宫内膜腺上皮和间质均有表达。非粘连组、轻、中、重度粘连组其相对表达量分别为 2.77±0.43、4.80±0.42、5.00±0.47、5.00±0.47。与非粘连组比较,粘连组 Smad2表达明显上调,差异显着（P<0.01）,但与粘连程度无明显相关（P>0.05）。Smad3在非粘连组中主要表达于腺上皮,在粘连组中,腺上皮、间质均有表达。非粘连组、轻、中、重度粘连组Smad3相对表达量分别为1.97±0.56、3.30±0.67、3.70±0.82、4.40±0.52。与非粘连组比较,粘连组表达明显上调,差异显着（P<0.01）,并与粘连程度呈正相关。Smad7在各组中均有表达。非粘连组、轻、中、重度粘连组Smad7相对表达量分别为3.87±0.86、3.80±0.63、3.10±0.88、1.80±0.42。与非粘连组比较,粘连组表达明显下调,差异显着（P<0.01）,并与粘连程度呈负相关。3.动物实验（1）各组SD大鼠子宫大体解剖形态:各组在体子宫呈“Y”型子宫。正常对照组双侧子宫对称,粗细均匀相当,子宫壁光滑,呈淡红色,色泽光鲜,有较好的弹性。模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组子宫外形相似,但均有不同程度变形、僵硬,与周边组织粘连,其中以模型对照组、调肾通络方低剂量组最为明显,而调肾通络方中、高剂量组子宫弹性尚好,粘连程度较模型对照组、调肾通络方低剂量组低。（2）各组SD大鼠子宫内膜Vimentin免疫组化:免疫组化（IHC）检测结果显示在正常对照组、调肾通络方高、中剂量组均可见大量棕黄色颗粒沉积,Vimentin阳性表达相对量分别为21.71±1.88%、17.67±1.06%、15.39±1.53%。模型对照组、调肾通络方低剂量组则见较少棕色颗粒,其相对表达量分别为6.11±0.66%、11.92±1.74%。与正常对照组比较,模型对照组、调肾通络方低剂量组呈低表达,差异显着（P<0.01）。与模型对照组比较,调肾通络方高、中剂量组表达明显上调,差异显着（P<0.01）。（3）各组SD大鼠子宫内膜组织HE染色结果及腺体计数:正常对照组子宫内膜线完整,上皮细胞结构完整,内膜间质中见丰富圆形、椭圆形腺体,呈排列状、簇状,内膜表面可见腺体开口。模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组均不同程度出现内膜组织坏死,腺体稀少、甚至缺失,其中以模型对照组、调肾通络方低剂量组最为严重。正常对照组、模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组各组腺体计数分别为54±5个/HP、10±2个/HP、20±4个/HP、34±6个/HP、50±3个/HP。与正常对照组比较,各组腺体计数均不同程度减少,差异明显（P<0.01）。与模型对照比较,调肾通络方组腺体计数呈剂量依赖性增加,但调肾通络方低剂量组与模型对照组无差异（P>0.05）,中、高剂量组与模型对照组差异显着（P<0.01）。（4）各组SD大鼠子宫内膜Masson染色结果及纤维化面积:正常对照组、调肾通络方高、中剂量组见少量蓝色胶原纤维,纤维化面积比分别为13.73±1.67%、18.56±1.69%、28.38±2.8%。在模型对照组、调肾通络方低剂量组均可见大量蓝色胶原纤维,其纤维化面积比率分别为53.09±3.46%、41.82±2.89%。与正常对照组比较,模型对照组、调肾通络方各组纤维化面积增加,差异显着（P<0.01）。与模型对照组比较,调肾通络方中、高剂量组纤维化面积减少,差异显着（P<0.01）。调肾通络方低剂量组与模型对照组无差异（P>0.05）。（5）各组 SD 大鼠子宫内膜 TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7mRNA 表达:qPCR 检测结果显示正常对照组、模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组TGF-β1mRNA表达相对量分别为 2.64±0.35、4.61±0.66、4.07±0.38、3.92±0.42、3.13±0.41;Smad2mRNA 表达相对量分别为 2.96±0.33、3.83±0.55、3.64±0.57、3.28±0.67、3.00±0.53;Smad3mRNA 表达相对量分别为 3.17±0.22、4.75±0.53、4.14±0.26、3.71±0.28、3.27±0.41;Smad7mRNA 表达相对量分别为 5.82±0.33、4.03±0.19、4.60±0.62、4.69±0.47、5.76±0.27。与正常对照组比较,各组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达上调,Smad7 mRNA表达下调,差异显着（P<0.01）。与模型对照组比较,调肾通络方各组TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA呈剂量依赖性表达下调,Smad7mRNA表达上调。其中以中、高剂量组与模型对照组差异显着（P<0.01）,低剂量组与模型对照组表达水平无明显差异（P>0.05）。（6）各组SD大鼠子宫内膜TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3/7蛋白表达水平:Western blot检测结果显示显示正常对照组、模型对照组、调肾通络方低、中、高剂量组,TGF-β1 蛋白表达相对量分别为 0.177±0.08、0.808±0.045、0.584±0.054、0.411±0.164、0.206±0.025;p-Smad2 蛋白表达相对量分别为 0.126±0.017、0.728±0.370、0.587±0.043、0.281±0.021、0.159±0.027;Smad2 蛋白表达相对量分别为 0.281±0.014、0.780±0.035、0.559±0.057、0.312±0.030、0.276±0.047;p-Smad3 蛋白表达相对量分别为 0110±0.013、0.782±0.133、0.558±0.059、0.290±0.027、0.167±0.014;Smad3 蛋白表达相对量分别为0.134±0.015、0.570±0.059、0.458±0.032、0.267±0.031、0.162±0.018;Smad7 蛋白表达相对量分别为 0.448±0.030、0.096±0.021、0.131±0.018、0.188±0.019、0.198±0.057。与正常对照组比较,各组 TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3 蛋白表达上调,Smad7 表达下调,差异显着（P<0.01）。与模型对照组比较,调肾通络方各组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达呈剂量依赖性表达下调,Smad7表达上调。其中以中、高剂量组与模型对照组差异显着（P<0.01）,低剂量组与模型对照组表达水平无明显差异（P>0.05）。4.细胞实验（1）SD大鼠原代ESCs的分离、培养及鉴定:刚分离的ESCs大小不一,形态各异,多呈圆形、锥形以及多角形。培养0.5 h左右开始贴壁,培养24h后细胞呈梭形、三角形、多角形,分散排列,无明显规律。48h后细胞增多,开始出现聚集现象。培养72h后细胞明显聚集现象,多呈现梭形。vimentin免疫荧光呈绿色为阳性,阳性率为90.10±0.15%。（2）各组SD大鼠ESCs形态及密度:正常对照组、20%调肾通络方含药血清组ESCs外形相似,呈圆形或椭圆形,细胞饱满,呈铺路石状密集排列;模型对照组、5%、10%调肾通络方组细胞不同程度变细长,细胞密度下降。（3）各组SD大鼠ESCs Smad2、Smad3、Smad7mRNA表达:qPCR结果显示正常对照组、模型对照组、5%、10%、20%调肾通络方含药血清组Smad2mRNA表达相对量分别为 3.981±0.510、5.040±0.210、4.997±0.323、4.539±0.241、4.070±0.265;Smad3mRNA 表达相对量分别为 3.539±0.137、5.014±0.321、4.819±0.330、4.318±0.368、3.792±0.475;Smad7mRNA 表达相对量分别为 5.614±0.250、4.508±0.451、4.681±0.074、4.894±0.085、5.257±0.370。与正常对照比较,模型对照组、调肾通络方含药血清各组Smad2、Smad3 mRNA表达不同程度上调,Smad7表达下调。与模型对照组比较,调肾通络方含药血清组Smad2、Smad3 mRNA表达呈剂量依赖性下调,而Smad7的表达上调,其中以中、高剂量组与模型对照组差异显着（p<0.05）,低剂量组与模型对照组差异不明显（p>0.05）。（4）各组SD大鼠ESCs p-Smad2/3、Smad2/3/7蛋白表达:Western blot检测结果显示:正常对照组、模型对照组、5%、10%、20%调肾通络方含药血清组p-Smad2蛋白表达相对量分别为 0.151±0.016、0.850±0.035、0.730±0.029、0.690±0.024、0.621±0.023、Smad2 蛋白表达相对量分别为 0.190±0.019、0.862±0.028、0.812±0.031、0.681±0.026、0.610±0.028;p-Smad3 蛋白表达相对量分别为 0.130±0.011、0.911±0.027、0.751±0.022、0.660±0.021、0.592±0.027;Smad3 蛋白表达相对量分别为 0.161±0.018、0.841±0.019、0.720±0.025、0.632±0.019、0.492±0.018;Smad7 蛋白表达相对量分别为 0.730±0.035、0.150±0.011、0.261±0.018、0.381±0.029、0.550±0.016。与正常对照组比较,模型对照组、调肾通络方含药血清各组p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3蛋白表达不同程度上调,Smad7蛋白表达下调。与模型对照组比较,调肾通络方含药血清组p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3蛋白表达呈剂量依赖性下调,而Smad7的表达上调,其中以中、高剂量组与模型对照组差异显着（p<0.05）,低剂量组与模型对照组差异不明显（p>0.05）。结论1.调肾通络方应用于重度IUA术后,能明显改善患者月经量、焦虑、倦怠、腰膝酸软等不适临床症状;增加子宫内膜厚度,改善子宫内膜血流,促进子宫内膜修复,有效防治重度IUA术后再发粘连。2.IUA的病理本质为子宫内膜纤维化,纤维化进展参与了 IUA的发生发展,且内膜组织纤维化程度与粘连程度呈正相关;TGF-β1/Smads信号通路激活参与了 IUA的发生、发展。3.从TGF-β1/Smads纤维化信号通路角度,调肾通络方防治IUA术后再粘连可能的疗效机制为:从子宫内膜细胞到组织下调TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表达,上调Smad7蛋白及mRNA表达,从而调控TGF-β1/Smads信号通路,改善子宫内膜纤维化。
王晓玲[4]（2021）在《β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究》文中研究指明肝纤维化是肝脏组织急性或慢性细胞损伤引起的可逆性伤口愈合反应,反映了肝脏修复和瘢痕形成之间的平衡[1]。目前肝脏慢性纤维化疾病的总负担不断增长,全世界每年约有200万人因此死亡[2,3]。然而,尽管对纤维化病理生理机制取得了实质性进展,但在确定抗纤维化靶点并转化为有效治疗方面仍为空白[3,4],因此,减轻或逆转肝纤维化的研究具有直接的临床意义[5]。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）作为肝纤维化发病机制的主要调节因子,旁分泌或自分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）,调控肝纤维化过程中胶原纤维等细胞外基质的合成、沉积、降解[4,6,7]。近期研究表明,TGF-β/SMAD信号通路中,SMADs需要与其它DNA结合转录因子相互作用,即β-catenin与T细胞因子（T cell factor,TCF）、叉形头转录因子O1（Forkhead box O1,FOXO1）和乏氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）相互作用,调控TGF-β/SMAD信号通路,其相对活性取决于结合β-catenin的“转录伴侣”[8]。当β-catenin与TCF结合时,促进细胞增殖和纤维化[9],然而在与FOXO1结合后,发挥抗增殖、促凋亡、促进细胞在氧化应激下的存活[10,11]。在人类结肠癌细胞中发现FOXO1与TCF竞争结合β-catenin[12],在肾脏纤维化的研究中发现[8],β-catenin/FOXO1转录复合物形成可以促进TGF-β诱导的调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）foxp3的表达[8,13],发挥抗炎作用,然而β-catenin不同“转录伴侣”在HSCs及其肝脏纤维化中的作用仍不清楚。因此,本研究从细胞、动物、人体多水平,正向、反向多角度探讨TGF-β信号通路转录因子β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控HSCs增殖活化的作用机制,并在体内实验中探讨转录因子复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1对HSCs增殖活化、细胞外基质沉积、肝脏组织免疫调节的作用及其机制,发现转录因子复合物TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,可以调节TGF-β促纤维化生物学效应开关,导致不同的生物事件结局,为精准靶向抑制肝脏纤维化的临床研究提供基础及思路。目的:1.结合细胞水平和动物水平实验,阐明肝脏纤维化过程中,TGF-β信号通路中β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录因子复合物在肝纤维化病程中的作用机制;研究通过调控HSCsβ-catenin转录因子复合物,启动TGF-β多重生物学效应开关,导向不同生物学事件结局的思路在改善肝脏纤维化中的应用。2.在人体肝纤维化组织中分析β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与纤维化进展之间的关系,丰富肝纤维化疾病进展的病理生理基础,为肝纤维化的治疗提供了新的思路和策略,为进一步探索其在肝脏以及其它器官纤维化治疗中的临床应用提供支撑。方法:1.体外实验:人肝星状细胞LX2体外培养,分对照组、TGF-β诱导分化组、TGF-β诱导分化+ICG-001干预组、TGF-β诱导分化+ICG-001+AS1842856组通过Western Blotting、RT-q PCR检测各组细胞外基质α-SMA和COL-I水平以及HSCs细胞周期、氧化应激功能,应用Western Blotting、Co IP、PLA方法分析HSCs活化后,各组β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平变化。2.体内实验:根据肝纤维化的不同病因,构建四氯化碳（CCl4）和胆总管结扎（BDL）两种肝纤维化小鼠模型,观察小鼠肝脏外观,速率法检测丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶,同时对肝纤维化不同时期进行肝脏组织切片、染色,提取RNA及逆转录、RT-q PCR,分析肝纤维化小鼠模型不同时期的纤维化以及炎症因子水平,判断不同模型的干预时间;采用邻位连接技术（PLA）分析肝纤维化不同时期β-catenin转录复合物变化规律。3.在以上实验的基础上,对两种肝纤维化小鼠模型应用β-catenin/TCF抑制剂ICG-001进行干预,分别设立对照组、模型组、ICG-001干预组,观察小鼠肝脏外观,计算肝重、体重比,应用小鼠肝酶血清学水平检测、组织学染色、免疫组化、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原蛋白（COL-1）RNA表达水平检测相结合的方法,评价ICG-001干预后是否抑制小鼠肝脏纤维化,并应用ELISA方法检测了BDL各组肝脏组织炎症因子IL-10、IL-17、TNF-α、IL-6水平。4.为正反两个角度进一步探索TGF-β信号通路转录因子复合物在抑制肝脏纤维化中的作用机制,BDL小鼠肝纤维化动物模型中增加TGF-β组、FOXO1抑制剂干预组,采用免疫组化、Western blotting、RT-q PCR、Co IP、PLA实验,分析以β-catenin为核心的转录复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1之间的转换关系;应用组织免疫荧光共定位、组织HSCs特异细胞PLA实验分析体内TGF-β信号通路转录因子复合物对HSCs细胞的作用,并应用RT-q PCR检测了foxp3、TNF-α、P27kip1表达水平。5.最后在胆道闭锁患者不同肝纤维化分期的肝脏组织中开展免疫组化、RTq PCR、PLA实验,分析人体肝脏组织中TGF-β水平、细胞增殖水平、IL-10、β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与肝纤维化分期是否相关,为重新定向TGF-β信号通路转录因子复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF治疗肝纤维化的临床策略提供依据。结果:1.体外实验:β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1参与肝星状细胞的增殖活化1.1β-catenin/TCF抑制剂ICG-001干预活化的LX2细胞,WB结果显示,ICG-001组LX2细胞α-SMA蛋白表达水平与TGF-β组相比显着下降;ICG-001+AS1842856组与ICG-001组比较,α-SMA蛋白表达水平显着高于ICG-001组;而ICG-001组与对照组相比,α-SMA蛋白表达水平差异不具有统计学意义,ICG-001+AS1842856组与TGF-β组相比,α-SMA表达水平差异不具有统计学意义。说明ICG-001可以抑制活化的HSCs转分化为肌成纤维细胞。1.2 Mn SOD、p27kip1 RT-q PCR结果显示,ICG-001组LX2细胞Mn SOD、p27kip1表达水平的变化趋势与α-SMA、COL-I WB结果相反。说明ICG-001干预活化的HSCs使HSCs细胞周期阻滞,抗氧化应激水平增强。1.3以β-catenin作为Co IP抗体的免疫共沉淀结果显示,ICG-001组与TGF-β组相比,β-catenin结合的TCF水平显着下降,FOXO1水平显着升高。β-catenin、TCF、FOXO1 PLA结果显示,ICG-001组LX2细胞β-catenin/TCF互作与TGF-β组相比显着下降,β-catenin/FOXO1结果与β-catenin/TCF相反。综合与β-catenin结合的TCF、FOXO1水平,应用TF ratio（β-catenin/TCF versusβ-catenin/FOXO1）指标分析各组之间转录因子水平的差异,结果显示TF ratio水平变化趋势与LX2细胞活化的特异性标记物α-SMA表达水平一致,LX2细胞的活化与TF ratio水平升高密切相关。以上结果说明β-catenin/TCF可以促进TGF-β诱导的HSCs增殖、活化。2.体内实验;小鼠肝纤维化动物模型以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与肝纤维化病程关系初探2.1 CCl4肝纤维化小鼠模型在造模4w时,ALT、AST水平达到最高,随着造模时间延长,6w、8w时点ALT、AST水平呈现下降趋势;小鼠肝脏组织HE染色、网状纤维染色结果显示,在造模4w时纤维组织增生逐渐显着,网状纤维增粗、断裂,纤维间隔初步形成,随着造模时间延长,纤维间隔显着;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,随着CCl4注射时间延长至4w,α-SMA表达水平与对照组相比显着升高。小鼠肝脏组织IL-6、TNF-αm RNA表达水平在模型4w时达到高峰,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,6w时达到高峰,8w时下降。2.2 BDL肝纤维化小鼠模型BDL术后1w,ALT、AST与Sham相比显着升高,术后2w时达到顶峰,术后3w、4w呈现下降趋势;小鼠肝组织HE染色、网状纤维染色、Masson染色、亮绿-天狼星红染色分别从炎症细胞浸润、网状纤维、胶原纤维增生不同维度检测结果显示,BDL术后1周可见毛细胆管增生,汇管区增大,肝细胞轻度水肿变性,少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,随着术后时间延长,可见局灶性坏死,毛细胆管数量增多,肝细胞空泡样变加重;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,BDL术后1w汇管区α-SMA表达水平与对照组相比显着增加,随着BDL术后胆总管结扎时间延长,α-SMA表达水平持续升高,。小鼠肝脏组织TNF-αm RNA表达水平在模型1w、2w、3w时逐步上升,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,2w、3w时显着升高。以上结果说明CCL4、BDL两种不同机制导致的小鼠肝纤维化模型分别在造模4w、1w时即出现炎症细胞浸润,纤维组织增生。2.3 CCL4、BDL模型不同时期对小鼠肝脏石蜡组织切片进行原位PLA实验,检测β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物在病程不同阶段的变化,结果显示β-catenin/TCF水平在CCl4造模4w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,在CCl4造模4w时显着下降;β-catenin/TCF水平在BDL手术造模1w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,术后1w时下降。说明在两种模型中β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平与肝纤维化病程相关。3.抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化3.1 CCl4、BDL肝纤维化小鼠模型分别应用ICG-001干预1w、2w,对肝脏外观、肝重/体重比、肝酶、组织学、α-SMA、COL-I m RNA及蛋白水平进行了比较,结果显示,CCl4、BDL模型中ICG-001干预1w时,肝重体重比较模型组无显着差异,干预2w时,肝重体重比与模型组相比显着下降。两种模型1w、2w干预组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）与模型组相比均显着下降。CCl4模型肝脏组织HE染色、网染结果显示,ICG-001组与同期CCL4模型组相比,炎性细胞浸润减少,纤维间隔包绕肝细胞团与同期模型组相比减少。BDL模型肝脏组织HE、Masson、网状纤维、天狼星红染色结果显示,ICG-001组与同期BDL模型组相比,毛细胆管增生及纤维化减少,炎性细胞浸润减轻,I型胶原、III型胶原数量显着降低,网状纤维断裂、肝细胞板增厚程度减轻;BDL模型天狼星红染色半定量结果显示,ICG-001组胶原沉积显着低于同期模型组。RT-q PCR结果显示两种模型ICG-001组2w时COL-I、α-SMA阳性比例与同期模型组相比显着下降。免疫组化结果显示CCl4模型ICG-001组COL-I水平显着低于同期模型组,干预2w COL-I水平与干预1w时相比显着下降;BDL模型ICG-001组α-SMA水平显着低于同期模型组,干预2w时α-SMA水平与干预1w相比显着下降。以上结果说明抑制β-catenin/TCF 1w或2w,均可改善肝纤维化。3.2 CCl4、BDL模型在ICG-001干预后foxp3水平与模型组相比显着升高,p27kip1水平与模型组相比显着升高。3.3 BDL模型,ICG-001干预2w时,IL-6水平与同期模型组相比显着下降;TNF-α、IL-17变化趋势与IL-6一致,IL-10则显着增加。4.BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控肝纤维化的分子机制4.1 BDL模型中,腹腔注射AS1842856抑制FOXO1后,免疫组化、WB检测小鼠肝脏组织α-SMA水平,结果显示,应用AS1842856干预后,α-SMA水平显着增加,肝脏纤维化加重;当在ICG-001基础上应用AS1842856干预时,α-SMA阳性细胞数与ICG-001组相比显着增加。α-SMA和COL-I WB及半定量分析结果显示:术后给予ICG-001,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与BDL组相比显着下降,在此基础上应用AS1842856,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与ICG-001组相比显着增加。4.2各组小鼠肝脏组织核蛋白IP实验结果显示BDL组与Sham组相比,β-catenin/TCF升高、β-catenin/FOXO1降低,ICG-001干预后,与Sham组趋于一致,在此基础上应用AS1842856,β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与Sham组相比均显着下降。各组小鼠肝脏组织石蜡切片进行PLA实验,结果显示各组TCF、FOXO1与β-catenin互作的变化趋势与肝脏核蛋白Co IP实验结果基本一致,BDL术后以及TGF-β的作用下,β-catenin、TCF互作呈现增长趋势,而β-catenin、FOXO1互作显示下降,与肝脏纤维化进展相关。ICG-001干预后β-catenin、TCF结合减弱,β-catenin、FOXO1结合增强,而在ICG-001+AS1842856组,β-catenin与TCF、FOXO1的互作关系均减弱,与肝脏核蛋白Co IP实验结果一致。4.3组织免疫荧光结果显示BDL模型组HSCs增殖活化水平显着高于Sham组,ICG-001组显着低于模型组,TGF-β组HSCs数量及活化较BDL模型组增强,ICG-001干预TGF-β组HSCs增殖活化水平显着下降,与ICG-001组相比无显着差异。BDL模型组HSCs细胞β-catenin/TCF ligation与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组β-catenin/TCF与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/TCF ligation较TGF-β组显着下降。β-catenin/FOXO1ligation BDL组显着低于Sham组,ICG-001干预后与BDL组比较显着升高;TGF-β组β-catenin/FOXO1与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/FOXO1 ligation较TGF-β组显着升高。TF ratio作为β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1的比值,可以综合评价与β-catenin竞争结合的TCF、FOXO1之间的动态变化,BDL模型组HSCs细胞中TF Ratio与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组与BDL组相比无显着差异,ICG-001干预TGF-β组,TF Ratio较TGF-β组显着下降,与ICG-001组无差异。结合本部分2.1结果显示TF ratio下降,肝纤维化程度减轻,反之则加重。4.4 BDL模型组小鼠肝脏组织RT-q PCR结果显示TNF-α、foxp3表达水平与Sham组比较显着升高,ICG-001干预后TNF-α显着下降,foxp3进一步增加,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,TNF-α水平显着升高,foxp3表达下降。4.5 ICG-001干预后p27kip1水平与BDL模型组相比显着升高,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,p27kip1水平发生显着下降。5.人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物与纤维化进展的关系5.1经过彩色多普勒超声初诊,腹腔镜胆囊插管造影确诊的16例胆道闭锁以及其它患者,依据HE、Masson、天狼星红染色结果进行纤维化程度的Ishak评分分期,其中0期3例,1期4例,2期、3期、4期各3例。5.2不同分期患者肝脏组织Masson染色、IL-10、Ki67半定量分析结果显示,肝脏组织纤维化程度逐渐加重,IL-10水平S0-S2期显着升高,细胞增殖S2-S4期显着增强,这些指标均与TGF-β表达水平逐渐升高相关。5.3患者肝脏组织石蜡切片PLA结果显示,S0、S1、S2、S3期β-catenin/TCF ligation S0-S2期逐渐增多;β-catenin/FOXO1 S0期最高,S0-S2期逐渐下降;TF ratio与患者肝脏纤维化程度变化趋势一致。结论:1.体外人肝星状细胞LX2实验中,TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,形成不同转录因子复合物,调控TGF-β诱导的LX2转分化及细胞周期、氧化应激水平。2.体内动物实验中,TGF-β通路下游转录因子TCF、FOXO1同样存在竞争结合β-catenin;β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1作为TGF-β通路不同生物学效应的开关导致促纤维化和抗炎、细胞抑制--不同的生物学事件结局。体内通过调控HSCs TF ratio,可以抑制HSCs细胞的增殖活化,减少细胞外基质沉积,同时调节肝脏组织免疫反应,减轻组织慢性损伤,改善肝纤维化。3.β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1相对水平即TF Ratio水平升高与BA患者肝脏纤维化病程早期进展相关。
张琳[5]（2021）在《功能性复合支架构建及其促进创伤修复的研究》文中提出组织或器官创伤严重危害了人们的身体健康和生活质量。自体组织/器官移植、药物治疗、手术救治等作为常规的治疗手段,取得了良好的创伤修复效果,但存在免疫反应严重、供体不足、药物副作用大等多种问题。当前,通过功能性支架制备、活性物质联用、细胞活性调节等方式发展的组织工程技术,有效促进了机体的创伤修复。在本论文中,应用组织工程方法成功制备了多种功能性复合支架,在无疤痕皮肤创伤修复、诱导组织再生、骨组织修复等方面取得了良好的治疗效果。全层皮肤创伤的修复过程往往伴随着疤痕的形成,极大地危害了人们的身体和心理健康。皮肤疤痕的产生原因及治疗手段,在临床探索上依然困难重重。本课题组前期研究发现,抗纤维化多肽（AF38pep）具有与整合素相似的功能区域,能竞争性结合纤连蛋白额外结构域A（EDA-FN）,有效阻止EDA-FN与整合素结合后触发的纤维化生物学信号的发生。在本文第一部分,通过京尼平交联,制备了负载AF38pep的羧甲基壳聚糖（CMCS）/γ-聚谷氨酸（γ-PGA）复合水凝胶（HSP）。HSP具有贯通的多孔结构、良好的生物相容性、有效的血液凝结能力和抗菌性;能有效抑制激活的成纤维细胞的增殖及迁移,下调纤维化相关基因与蛋白的表达;HSP快速释放AF38pep的行为,能有效调节皮肤的创伤修复过程,促进表皮和真皮的正常再生,调节胶原纤维的合理分布与成熟,加速炎症反应的消退,促进皮肤附属结构和血管化的生成;通过RNAseq分析发现,HSP有效的无疤痕皮肤再生效果与粘着斑信号（FA）的下调有关。总之,HSP能有效抑制疤痕的产生,促进正常皮肤再生。当前,牙周疾病的发病率在全球范围内持续增加,诱导组织再生（GTR）膜在治疗牙周疾病方面取得了良好的效果,但其存在功能单一、降解速度不适宜、力学性质较差等问题。壳聚糖（CS）具有良好的生物相容性、抑菌性、止血性等多种生物学功能,在创伤修复领域已有广泛应用。在本文第二部分,通过静电纺丝与冷冻干燥相结合的方法,制备了一种结合CS的“类三明治”结构聚己内酯（PCL）/明胶（GEL）纳米纤维复合膜,该复合膜具有均匀的纤维形貌,稳定的三层结构,合适的力学性质;通过调整PCL和GEL的比例,能实现可控的降解速率;该复合膜还具有良好的细胞相容性,能有效提高细胞活性,加速血液凝结;该复合膜在大鼠皮下埋植4 w后,仍具有良好的结构完整性,能有效阻止细胞的浸润。总之,这种结合CS的“类三明治”结构纳米纤维复合膜充分发挥了GTR膜的优势,改善了GTR膜存在的不足,在诱导组织再生领域具有良好的应用潜力。骨缺损修复治疗已成为当前一项巨大的临床挑战。骨组织工程支架的应用为骨修复带来了新的希望,但其存在生物活性低、力学稳定性差、骨诱导效果弱等问题。富血小板纤维蛋白（PRF）是一种从血液中获取的富含多种活性成分的凝胶状物质,具有多种生物学功能,在创伤修复领域已有广泛应用。本文第三部分,通过静电交联的方式,制备了CS/γ-聚谷氨酸（γ-PGA）/纳米羟基磷灰石（n HA）水凝胶（CPH）,将其填充在骨缺损处,能发挥骨引导的作用;通过静电纺丝法制备了PCL/GEL纳米纤维膜（P2G3）,将其贴附在软硬组织交界处,能有效阻止软组织浸润到骨组织;新鲜的PRF作为复合支架的中间层,能长效释放多种生长因子,具有骨诱导效果。此外,该复合支架具有良好的力学性质,有效的矿化活性;均匀稳定的分层结构,有利于个性化定制满足不同创伤部位的需要;良好的生物相容性,较高的细胞成骨诱导能力;能有效促进大鼠颅骨修复与家兔牙槽骨再生。总之,这种结合PRF的三层多功能复合支架,充分发挥了骨诱导、骨引导和骨整合的作用,能有效促进骨修复,在临床治疗骨缺损方面具有良好的应用前景。在本论文中,通过结合多种生物活性物质,制备了不同类型的多功能复合支架,有效促进了机体不同部位的创伤修复。本文所研究的多种复合支架在组织工程领域具有广泛的应用价值,为创伤修复提供了新的研究思路,在未来的临床应用中具有良好的发展前景。
韩晶雪[6]（2021）在《大黄-丹参治疗肾间质纤维化的网络药理学及实验研究》文中指出目的:运用网络药理学及UUO模型研究大黄-丹参对肾间质纤维化的治疗作用及可能的作用机制。方法:运用网络药理学方法在TCMSP、Sym Map相关数据库中筛选大黄-丹参治疗肾间质纤维化的有效成分,在STITCH、SEA、ETCM和Sym Map等数据库中筛选药物大黄-丹参的潜在靶点,在OMIM、Gene Cards、Dis Ge NET及Pub-Gene数据库中筛选肾间质纤维化的疾病靶点,然后选取药物和疾病相同的靶点,即取二者交集,运用STRING数据库进行分析,得到蛋白质-蛋白质相互作用的网络图,并进行GO功能和KEGG通路富集分析,预测大黄-丹参治疗肾间质纤维化的主要成分、关键靶点及主要信号通路,然后选用UUO模型进行实验验证。实验选用32只8周龄的雄性C57BL/6小鼠验证网络药理学筛选出的大黄-丹参的主要成分木犀草素luteolin对肾间质纤维化的治疗作用,按体重随机分为假手术组、模型组、木犀草素低剂量组和木犀草素高剂量组,每组8只,采用经典的单侧输尿管梗阻模型,适应性喂养3天后进行造模手术,术后灌胃给药7天,后取材肾脏进行Masson和H&E染色,运用实时定量PCR和免疫组化检测Ι型胶原、α-SMA、TGF-β1、Smad3和E-cadherin的表达水平,评估木犀草素对肾间质纤维化的治疗作用。结果:筛选出大黄-丹参共50个化合物纳入后续研究,其中槲皮素、木犀草素、山奈酚和β-谷甾醇是其主要有效成分,得到丹参靶点1226个,大黄406个,肾间质纤维化靶点34个,其中TGFB1、VEGFA、MMP9、TNF和IL-6是大黄-丹参治疗肾间质纤维化的关键靶点,主要涉及AGE-RAGE、蛋白聚糖、缺氧诱导因子1和IL-17等信号通路,表明大黄-丹参的有效成分可能通过作用于上述通路达到治疗肾间质纤维化的目的。动物实验肾组织的Masson和H&E染色结果分析表明,大黄-丹参的主要有效成分木犀草素能减少肾间质纤维化面积,减轻炎症细胞浸润,具有一定的肾保护作用。免疫组化和实时定量PCR结果表明,木犀草素能降低Ι型胶原、α-SMA、TGF-β1和PSmad2/3的表达水平,提高E-cadherin的表达水平,故推测大黄-丹参具有改善肾间质纤维化的作用,且可能通过抑制TGF-β/Smads信号通路而发挥作用。结论:大黄-丹参具有一定的改善肾间质纤维化的作用,且可能与抑制TGF-β/Smads信号通路有关。大黄-丹参治疗肾间质纤维化的临床应用较广,但是药理研究报道相对较少,本研究运用网络药理学和动物实验探讨大黄-丹参对肾间质纤维化的治疗作用及其可能的作用机制,体现了多成分-多靶点-多通路的复杂网络关系,为大黄-丹参治疗肾间质纤维化的临床应用提供依据,为进一步开展其作用机制研究奠定基础。
刘畅[7]（2021）在《趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究》文中指出肺纤维化（Pulmonary fibrosis,PF）既包括特发性肺纤维化（idiopathic PF,IPF）,也是多种纤维增生性肺病的病理基础。该疾病的特征是肺泡上皮遭受持续性损伤后结构被破坏,过度增殖活化的成纤维细胞分泌过多细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）,导致肺间隔增厚,肺间质重构,患者肺功能受损,最终呼吸衰竭。复杂的发病机制与有限的治疗手段使得肺纤维化病人预后不良,诊断后生存期约为3至5年。早期的标准三联疗法（强的松,硫唑嘌呤,N-乙酰半胱氨酸）非但不能减轻纤维化样病变,甚至会增加患者的入院及死亡风险。FDA在2014年批准了两种药物,吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nintedanib）,这两种药物和肺移植是目前临床上仅有的有效疗法。对于肺移植而言,供体有限,手术操作复杂和伴随的终生免疫抑制治疗都限制了这一疗法的应用。吡非尼酮及尼达尼布虽然能够减少IPF患者最大肺活量的下降程度,减缓疾病进程,但其是否可以延长生存期尚不可知。因此,深入探究肺纤维化的发病机制有助于我们鉴定新的药物靶点,攻克慢性肺病。纤维化作为慢性炎症疾病的终末期病理改变,与肺泡上皮的反复损伤,异常的炎症反应和胶原的过度沉积紧密相关。本文第一部分研究了趋化因子CCL1和肺纤维化效应器细胞成纤维细胞之间的关系。慢性肺损伤导致肺泡巨噬细胞和T细胞中CCL1 的表达上调,CCL1 通过结合 AMFR（autocrine motility factor receptor）受体诱导成纤维细胞活化为肌成纤维细胞。CCL1-AMFR相互作用引起AMFR磷酸化,获得E3连接酶活性,使内源性ERK抑制剂Spry1发生泛素化并移位至胞膜:在细胞膜上,Spry 1结合RasGAP后解除自身对Ras-ERK-p70S6K信号活性的抑制作用,促进促纤维化蛋白合成。在基因水平及药理水平抑制CCL1信号通路可以缓解肺纤维化的病理改变。本研究结果揭示了 CCL1-AMFR-ERK信号轴在纤维化进程中的重要作用,并指出了治疗纤维增生性肺病的潜在靶点。在肺损伤后的修复过程中,肺泡干细胞即肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolarepithelial type 2 cell,AT2）可自我更新或分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞（alveolar epithelial type 1 cell,AT1）以维持呼吸稳态。除了异常的炎症环境和持续堆积的肌成纤维细胞,AT2干性受损和肺泡上皮的再生失败同样密切参与肺纤维化的进程。本文第二部分探究了细胞周期抑制子p21和肺纤维化中肺泡再生失败的关系。在多次博来霉素诱导的肺纤维化模型中,AT2的反复损伤导致其端粒缩短,并时间依赖性地上调p21的表达。p21的堆积不仅诱导AT2细胞周期阻滞,阻碍AT2的自我更新,还会打断p300和β-catenin的相互作用以抑制AT2的分化,即p21上调后老化的AT2不再具有自我更新和分化为AT1的能力。同时,老化的AT2分泌促纤维化的细胞因子以诱导肌成纤维细胞的活化。敲低p21后可以重建肺纤维化模型中由AT2主导的肺泡再生进程。本文的研究结果有助于深入理解肺损伤和肺纤维化的发病机制,也为开发抗纤维化药物提供了新的理论依据。
蒋云霞[8]（2021）在《荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究》文中研究表明目的:以大鼠肝星状细胞T6细胞株（HSC-T6）为受试对象,探讨并完善荔枝核总黄酮（total flavonoids from Litchi Seed,TFL）拮抗肝纤维化的作用靶点与作用机制。方法:常规培养HSC-T6,分别观察TFL在不同时间和不同浓度对HSC生长增殖率的影响,从中选择最佳的TFL药物浓度进行后续实验;将HSC-T6分为细胞对照组和TFL实验组,细胞对照组的HSC-T6常规培养,TFL实验组采用上述最佳的TFL药物浓度干预HSC-T6,分别使用透射电子显微镜和ELISA方法检测各组HSC-T6的超微结构和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）含量的变化。制备肝纤维化模型大鼠,在大鼠腹部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混悬液0.3 ml/100 g,2次/周,共8周。造模完成后,行肝组织病理染色检测,证实造模成功。将肝纤维化造模完成的大鼠分为模型对照组和TFL实验组,模型对照组大鼠在肝纤维化造模完成后常规饲养,TFL实验组大鼠予灌胃TFL 100 mg/（kg·d）,4周后收集模型对照组和TFL实验组的大鼠血清。检测各组血清对HSC-T6的最大无毒浓度,以最大无毒浓度为最佳诱导剂量孵育HSC-T6,诱导分化14天后提取全蛋白,通过DDA/DIA技术筛选出模型对照组和TFL实验组血清干预后的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO、KOG、PPI、PATHWAY和亚细胞定位等生物信息学分析。结果:1.透射电镜结果显示TFL干预后HSC-T6的超微结构发生变化,细胞间隙变大,胞膜四周纤毛脱落,多角伪足减少,膜表面不平整,细胞浆内线粒体明显变形,线粒体嵴断裂或消失,粗面内质网扁池扩张,核糖体脱落,核内染色质浓缩或边聚,核膜皱缩,可见凋亡小体形成。2.ELISA 结果显示,TFL 干预后 HSC-T6 的 MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量下降。3.生物信息学分析结果显示,模型对照组和TFL实验组的差异蛋白共177个,其中上调蛋白84个,下调蛋白93个。GO分析显示,差异蛋白参与分子功能共10个条目,主要为分子结合和催化活性;细胞组分共18个条目,主要为细胞质和细胞器;生物过程共24个条目,主要为细胞过程、代谢过程、生物调节等。4.KOG注释分析显示,差异蛋白比对到KOG数据库共有23个子类和192条蛋白注释信息,其中细胞过程和信号传递是获得注释信息最多的分类,其次为信息存储与处理、新陈代谢作用和缺乏注释的蛋白等。5.PPI分析结果显示,存在互作关系的上调蛋白28个:SELENOH、C1QC、C1QB、APOE、ANGPTL4、NF1、GPX3、CLU、DMAP1、VTN、MYH14、SELENOM、HRG、PF4、HMOX1、IGH1A、IGG2A、IGHG、PGK2、PLIN2、KDM4C、ITIH4、BAZ2A、C9、ADH7、MGST1、GSTA1、ATP9B等。存在互作关系的下调蛋白42个:RAD51、HELZ2、PBK/TOPK、HMGCS1、UBE2T、UBE2C、DLGAP5、LOC100911660、PTEN、BLM、CYP51A1、MDC1、LRRK1、MVD、NSDHL、IDI1、SPC24、CDCA8、KNSTRN、CCNB2、FAM83D、HMGXB4、STARD4、HLTF、LIPG、UHRF1、KAT8、PCSK9、UBE2S、AMMECR1L、WDR76、ZNRD2、DDX10、MAP3K3、PIMREG、SMAD1、MCL1、MPRIP、FIGNL1、RPAP1、STMN1、SPP1 等。6.PATHWAY富集分析结果显示,KEGG代谢通路分为6个分支,共注释38项条目,分支包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统等,其中差异蛋白占比前三的分支为人类疾病、新陈代谢和有机系统。代谢通路主要包括原发性免疫缺陷、金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、系统性红斑狼疮、哮喘产生IgA的肠道免疫网络、免疫系统、萜类骨架的生物合成、自身免疫性甲状腺疾病、同种异体移植排斥、范可尼贫血途径、造血细胞谱系、非洲锥虫病、胆固醇代谢、类风湿关节炎、矿物质吸收、细胞色素P450对异生物的代谢、病毒性心肌炎、利什曼病、阿米巴病、癌症中的转录失调、扩张型心肌病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、FcεRI信号通路、B细胞受体信号通路、磷脂酶D信号通路、NF-κB信号通路、酮体的合成与降解、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌、药物代谢-细胞色素P450等。7.亚细胞定位结果发现这些差异蛋白主要位于细胞核、细胞质或细胞外,其余则较平均散布于胞质内膜、线粒体、过氧化物酶体、内质网、胞质网丝以及细胞骨架上。结论:1.荔枝核总黄酮（TFL）可下调HSC-T6的MMP-2、ColⅠ和ColⅢ的表达水平,对HSC-T6的生长增殖具有抑制作用。2.本实验基于DDA/DIA模式并通过GO、KOG、PPI、PATHWAY以及亚细胞定位等生物信息学技术分析后发现C1QC、C1QB、C9、SELENOH、SELENOM、GPX3、APOE、CLU、ANGPTL4、NF1、HRG、PF4、ITIH4、ADH7、RAD51、BLM、FIGNL1、MDC1、SPC24、KNSTRN、CDCA8、HELZ2、HMGCS1、MVD、IDI1、CYP51A1、NSDHL、LIPG、PBK/TOPK、FAM83D、DLGAP5、UBE2T、UBE2C、UBE2S、UHRF1、MAP3K3、LRRK1、SMAD、、MCL、等差异蛋白与肝纤维化疾病具有密切相关性;PI3K/Akt通路、NF-κB信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、细胞色素P450可能是TFL抑制HSC-T6生长增殖并诱导HSC-T6死亡的主要信号转导途径。3.TFL可能通过调控多个蛋白和参与多种信号传导通路抑制ECM的形成和诱导HSC-T6死亡,发挥拮抗肝纤维化的生物学效应。
周学锋[9]（2021）在《糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究》文中研究指明背景糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）的一种严重的微血管并发症,是导致终末期肾脏疾病（end stage renal disease,ESRD）的主要原因之一。2019年,全球糖尿病患病率约为9.3%（4.63亿人）,这一数字预计将在2045年上升到10.9%（7亿人）,大约40%左右的糖尿病患者会变成DKD患者。DKD已经成为危害人类健康的严重疾病。肾脏纤维化是DKD发展过程中的一个重要的病理进程,目前针对DKD肾脏纤维化缺乏行之有效的治疗方案。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGFβ1）在肾脏纤维化的发生发展中具有重要的作用。相关研究证明,TGFβ1/Smad3通路能够通过调节长链非编码RNA（long non-coding RNAs,LncRNA）调节肾脏纤维化。相关研究发现,LncRNA MEG3（GENEID:55384）的过表达加重了细胞增殖,并诱导了细胞凋亡。LncRNA MEG3可以通过调节miR-181a/Egr-1/TLR4轴调节DKD大鼠的肾脏纤维化和炎症反应。氧化应激在DKD的发生和发展中也起着至关重要的作用。活性氧的过量产生可引起DKD患者早期系膜细胞肥大、系膜扩张、细胞外基质蛋白积聚、肾小球硬化、内皮细胞损伤、足细胞凋亡、蛋白尿、肾脏功能障碍。Keap1/Nrf2是非常重要的内源性抗氧化途径。DKD属于中医学“水肿”、“肾消”、“消渴”、“关格”等病证范畴。DKD肾脏纤维化属于典型的“久病入络”、“肾络瘀阻”。DKD之气阴两虚、肾络亏虚,产生痰浊、瘀血等产物阻滞肾络,痰瘀互结日久则络脉淤塞成积,治疗应该益气养阴,通络祛邪。糖肾方是本课题组负责人李平教授研制的治疗DKD的中药复方,由黄芪、生地黄、山茱萸、卫矛、三七、熟大黄、枳壳共七味药组成,具有益气养阴、活血通络的功效。前期多中心、随机、双盲和安慰剂对照试验证实糖肾方能够显着降低DKD患者的蛋白尿水平,并且改善肾小球滤过率（estimated Glomerularfiltrationrate,eGFR）。但是糖肾方治疗DKD肾脏纤维化以及氧化应激损伤的潜在机制仍未被深入探索。因此本课题利用网络药理学方法结合体内外实验验证糖肾方治疗DKD肾脏纤维化、氧化应激损伤的分子机制。目的1.基于网络药理学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在机制;2.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,明确不同剂量糖肾方的治疗作用。3.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤模型,探索糖肾方对DKD肾脏纤维化和氧化应激损伤的作用机制。方法1.利用网络药理学生物信息学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的主要活性化合物、作用靶点、参与活动以及作用通路。利用Cytoscape软件绘制可视化网络结构图、PPI图,并进行数据分析。2.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,观察糖肾方低剂量、糖肾方中剂量、糖肾方高剂量的疗效。8周龄Wistar大鼠,适应性喂养3天,测量基础数据:体重、血糖、尿量、尿蛋白定量。然后根据血糖和体重随机分组,Sham组和DKD组,DKD组进行单侧肾切除以及STZ注射造模手术;造模成功后,随机分为以下5组:DKD组、DKD+糖肾方低剂量组（1.2 g/kg/d）、DKD+糖肾方中剂量组（2.4g/kg/d）、DKD+糖肾方高剂量组（4.8g/kg/d）、福辛普利钠组（1.33mg/kg/d）。实验动物10周龄开始灌胃给药,实验期间每周测体重,每4周测血糖,连续灌胃给药20周后结束实验。取材,收集大鼠血清、肾脏、肝脏等标本,并进行血、尿生化检测,Elisa测定尿蛋白等。病理组织切片PAS、MASSON染色等评估肾脏损伤情况。3.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤纤维化模型研究糖肾方治疗DKD肾脏纤维化机制。基于药效学实验结果,选择糖肾方低剂量组完成本章节机制研究。利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR 等实验技术评估糖肾方对 DKD 大鼠的肾脏皮质中 Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,Smad 3,p-Smad 3,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3 表达水平的影响。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3mRNA 的变化情况。4.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞氧化应激损伤模型研究糖肾方治疗DKD氧化应激损伤的机制。实验分组与方法3相同,利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR等实验技术评估糖肾方对DKD大鼠的肾脏皮质中Keap1,Nrf2,HO1,3-NT的影响。利用DHE染色法检测DKD大鼠的肾脏皮质中ROS的含量。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Keap1,Nrf2,HO1的变化情况。结果1.网络药理学研究发现糖肾方的主要活性成分是:槲皮素,beta-谷甾醇,山奈酚,DiincarviloneA,阿魏酸甲酯,地黄苦苷元,羟基-3-甲氧基肉桂醛,豆甾醇,4-羟基肉桂酸甲酯,7-O-methylisomucronulatol;糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的核心靶点有:血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGFA）,表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor,EGFR）,纤连蛋白 1（fibronectin 1,FN1）,TGFβ1,SMAD3,SMAD2等。GO富集分析发现糖肾方参与了抗氧化的生物过程,据此,我们挖掘了与糖肾方有关的氧化应激相关靶点,超氧化物歧物酶1（Superoxidedismutase,SOD1）,HO1,Keap1,Nrf2。糖肾方治疗DKD肾脏纤维化可能是通过调整TGFβ/Smad通路以及Keap1/Nrf2抗氧化应激来实现的。2.药效学结果证明糖肾方能够改善DKD大鼠的肾脏损伤。DKD组大鼠从实验开始时,体重和状态较Sham组较差,随着实验的进行,体重差异持续增加。药物干预第20周时,与DKD组相比较,各给药组的大鼠状态均有改善。糖肾方低剂量、中剂量组大鼠体重从药物干预第14周时体重高于DKD组,并持续到实验结束。DKD组大鼠血糖水平从实验开始时即明显高于Sham组,直到实验结束。糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠组的血糖水平从实验药物干预第16周开始下降,持续到实验第20周时,显着低于DKD组血糖水平。DKD大鼠的脏器指数、24h尿量、尿蛋白/肌酐比值、血清肌酐、血清尿素氮、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸氨基转移酶、血脂水平等均显着高于Sham组,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠治疗DKD大鼠20周之后,均能够显着降低24h尿量,减少尿蛋白排泄量,改善肾脏功能、肝脏功能,纠正血脂紊乱;PAS和Masson’s Trichrome染色显示,DKD组大鼠肾脏出现了显着的肾小球系膜基质增生和肾小管损伤,肾间质纤维化,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠干预治疗后,能够改善DKD大鼠肾脏的病理损伤.3.糖肾方能够通过调节TGFβ1/Smad 3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化。与Sham组相比较,DKD大鼠肾脏皮质中Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin的蛋白和基因表达水平均显着升高。DKD大鼠肾脏皮质中的TGFβ1,p-Smad 2/3,Smad3,p-Smad3蛋白表达水平明显高于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中LncRNA MEG3的基因表达水平明显高于Sham组。给予糖肾方干预治疗20周后,可以显着降低DKD大鼠的Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,p-Smad2/3,Smad3,p-Smad3,LncRNA MEG3的表达。糖肾方可以改善高糖诱导的HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白的沉积以及Smad 2/3蛋白的磷酸化。下调TGFβ1 mRNA以及Lnc RNA MEG3 mRNA的表达水平。4.糖肾方能够通过调控Keap1/Nrf2信号通路改善DKD氧化应激损伤。DKD大鼠中MDA含量明显高于Sham组,SOD含量明显低于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中的3-NT、Keap1蛋白和基因表达水平显着升高,Nrf2、HO1蛋白表达水平显着降低;免疫荧光结果显示,DKD大鼠肾脏皮质中的ROS含量增加;给予糖肾方干预治疗20周后,能够显着降低DKD大鼠3-NT、Keap1蛋白和基因的表达水平,上调DKD大鼠肾脏皮质中Nrf2、HO1的蛋白表达水平。此外,糖肾方可以降低NOX4基因表达水平,提高TXNRD1和GCLC基因表达水平。糖肾方可以减少高糖诱导的HK2细胞中ROS的含量,提高Nrf2蛋白以及基因表达水平,降低Keap1蛋白以及基因表达水平。结论本研究利用网络药理学预测糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在靶点,并在DKD动物模型以及HG诱导的HK2细胞中进行验证,明确了糖肾方通过调节TGFβ1/Smad3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化;通过调控Keap1/Nrf 2信号通路改善DKD氧化应激损伤。
王新[10]（2021）在《miR-320a-3p抑制肺及气道EMT的作用及机制研究》文中研究说明肺纤维化（PF）是一种十分常见的无法治愈的疾病,其特征是肺组织结构破坏以及瘢痕的形成[1]。随着科学技术的进步,尽管已经开发出各种检查和治疗的方法,但肺纤维化仍然是一个重要的公共卫生问题。随病程进展肺纤维化的患者不可避免地的出现进行性肺功能下降,最终导致呼吸衰竭,引发极高的死亡率[2,3]。越来越多的证据表明,肺纤维化的疾病机制涉及上皮-间质转化（EMT）[4,5]。在这种转分化过程中,上皮细胞最终转化为运动性间充质细胞,并出现胶原沉积和其他细胞外基质成分表达增加。气管支气管结核（TBTB）定义为气管和/或支气管的结核杆菌感染,气管支气管狭窄是气道纤维化的一种表现形式,也是TBTB最常见的并发症之一。目前对于因TBTB引起的气管支气管狭窄的治疗方法仍然十分有限。随着时间及病程的进展,TBTB引起的气道狭窄会逐渐恶化加剧,然而临床上可供医生和患者选择的治疗方法却寥寥无几。EMT使得气管支气管上皮细胞丧失上皮特征获得间质表型,是TBTB引起的气道纤维化（狭窄）的重要发病机制[6,7]。Micro RNAs（mi RNA/mi Rs）是小的内源性非编码RNA,可以通过与靶基因m RNA的3’-非翻译区（3’-UTR）结合来阻断翻译和/或加速靶m RNA的降解,由此调节基因表达[8]。越来越多的证据表明,mi RNA在各种生物学过程中起着关键作用,包括细胞增殖、分化、凋亡和EMT过程的调控[9-11]。近来,多项研究表明,miR-320a-3p可能涉及多种肿瘤的EMT调控[12,13]。但miR-320a-3p在纤维化疾病的EMT中的作用尚无报道,miR-320a-3p是否可以调节肺纤维化和气道纤维化中的EMT,且在此过程中是否存在共通机制尚不明确。在这项研究中,我们以A549细胞和BEAS-2B细胞构建了PF及TBTB的EMT细胞模型,通过细胞模型研究了miR-320a-3p在TGF-β1诱导的EMT中的作用,同时阐明了其潜在机制。目的:1.通过公共数据库挖掘,分析肺纤维化与正常对照组织中miR-320a-3p的表达水平,并分别在肺纤维化样本与正常对照肺组织样本,TBTB样本与正常对照气道样本中做差异表达的验证;2.通过miR-320a-3p模拟物来干预TGF-β1诱导构建的A549和BEAS-2B细胞模型来明确miR-320a-3p在EMT中的作用;3.在细胞分子水平上初步阐明miR-320a-3p抑制EMT作用的分子机制,探明miR-320a-3p在抑制肺及气道EMT方面是否存在着共通的机制,为PF和TBTB引起的气道纤维化（狭窄）提供新治疗靶标的相关线索。方法:1.依据纳排标准,对公共数据库Gene Expression Omnibus（GEO）和Array Express进行挖掘,分析数据集中miR-320a-3p的表达水平。2.收集PF,TBTB和正常对照的临床样本,q PCR方法验证miR-320a-3p的差异表达。3.构建细胞模型,q PCR方法在细胞模型中检测miR-320a-3p的表达水平。以miR-320a-3p模拟物干预TGF-β1构建的细胞EMT模型,通过q PCR,Western blot,以及免疫荧光染色等检测方法了解miR-320a-3p对EMT的作用。4.通过生物信息学工具预测miR-320a-3p的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验证实。通过Western blot实验研究miR-320a-3p对EMT作用的相关机制。结果:1.公共数据库中数据集的筛选以及临床样本和细胞模型中mi RNA表达差异的分析。依据事先设计的纳排标准,对GEO和Array Express数据库进行检索,一共纳入符合标准的数据集3个,共计174例样本。经统计发现,数据集中miR-320a-3p在纤维化样本和正常对照组中表达水平存在差异。接下来我们收集了肺纤维化样本与正常肺组织对照样本,通过检测其中的miR-320a-3p表达水平,发现与正常对照组相比,肺纤维化临床样本中的miR-320a-3p表达水平明显降低。其后又检测了TBTB样本与正常气道对照样本,经q PCR检测发现miR-320a-3p在TBTB样本中的表达较正常对照样本也明显降低。因此我们推论在肺与气道的纤维化中miR-320a-3p的表达与疾病存在相关性,并假设提高miR-320a-3p的表达水平可能影响肺和气道的纤维化。下一步,以TGF-β1刺激A549与BEAS-2B细胞构建PF与TBTB的EMT细胞模型。研究发现在不同浓度TGF-β1（0,1,3,5,和10ng/ml）刺激A549细胞与BEAS-2B细胞48小时作用下,A549细胞与BEAS-2B细胞中miR-320a-3p的表达较对照组明显下降,且呈现出浓度相关性。以10ng/ml TGF-β1在不同时间梯度下（0,24,48小时）刺激A549细胞与BEAS-2B细胞,再测定miR-320a-3p的表达水平,发现与对照组相比,48小时miR-320a-3p的表达下降最明显。2.miR-320a-3p能抑制TGF-β1诱导的EMT,并能抑制由TGF-β1诱导的细胞迁移能力增加。研究先用miR-320a-3p模拟物来干预A549细胞和BEAS-2B细胞,然后再给与TGF-β1刺激细胞。q PCR,Western blot以及免疫荧光染色结果显示:TGF-β1刺激可以使A549细胞及BEAS-2B细胞上皮标志物E-cadherin表达水平降低,同时使A549细胞及BEAS-2B细胞的间质标志物vimentin和α-SMA表达明显升高。而miR-320a-3p模拟物可以使TGF-β1刺激的A549细胞和BEAS-2B细胞E-cadherin表达水平较对单独TGF-β处理组明显升高,同时vimentin和α-SMA表达水平明显降低。针对BEAS-2B细胞,我们进一步进行了划痕实验以及实时细胞分析仪（RTCA）迁移能力测定。结果显示,TGF-β1的刺激可使BEAS-2B细胞迁移能力增强,miR-320a-3p模拟物的转染显着降低了BEAS-2B细胞的迁移能力,使TGF-β1刺激的细胞迁移能力降低至接近对照水平。3.miR-320a-3p抑制肺及气道上皮细胞EMT的分子机制利用生物信息学工具预测miR-320a-3p的靶基因,我们发现STAT3为miR-320a-3p的潜在目标靶基因。通过双荧光素酶报告基因实验证实了:miR-320a-3p能与野生型STAT3的3’-UTR区结合,而突变STAT3的3’-UTR区结合位点后,miR-320a-3p无法与之结合。接下来我们测定了miR-320a-3p模拟物干预的A549细胞和BEAS-2B细胞中STAT3的表达水平,实验发现,与TGF-β1处理组对比miR-320a-3p模拟物可明显降低A549细胞和BEAS-2B细胞中STAT3的表达。上述结果显示miR-320a-3p可能是通过靶向调控STAT3,从而起到抑制肺及气道上皮细胞EMT的作用。为了进一步证实miR-320a-3p是通过依赖STAT3的机制抑制了TGF-β1诱导的A549细胞和BEAS-2B细胞的EMT。首先,我们构建了si-STAT3和si-NC。用si-STAT3和si-NC转染A549细胞以及BEAS-2B细胞,然后给予10ng/ml TGF-β1刺激48小时,以Western blot实验评估两株细胞的上皮及间质标志物。结果显示:与TGF-β1处理组相比si-STAT3可以明显增加A549细胞和BEAS-2B细胞的E-cadherin表达水平,同时明显降低vimentin和α-SMA的表达水平。然后我们进行了回复实验:将miR-320a-3p模拟物与HBLV-h-STAT3或HBLV-NC共转染到A549细胞和BEAS-2B细胞中,给予10ng/ml TGF-β1刺激48小时后,再测定上皮及间质标志物的表达水平。结果显示:HBLV-h-STAT3显着增加了STAT3的表达。STAT3的上调抑制了miR-320a-3p模拟物对E-cadherin表达的影响,并显着增加了vimentin和α-SMA的表达。将研究进一步深入,我们分别以miR-320a-3p模拟物、si-STAT3、以及miR-320a-3p模拟物联合HBLV-h-STAT3来分别转染干预细胞模型。结果发现miR-320a-3p模拟物和si-STAT3干预可明显降低细胞p-SMAD3表达水平。而miR-320a-3p模拟物与HBLV-h-STAT3共转染可逆转由miR-320a-3p模拟物干预而导致的p-SMAD3表达降低。结论通过公共数据库挖掘和临床样本的测定,我们发现miR-320a-3p的表达水平在肺和气道纤维化组织中明显降低。miR-320a-3p与肺和气道纤维化的发生发展存在相关性。通过细胞实验,确定了过表达miR-320a-3p可以抑制由TGF-β1刺激诱导的A549细胞和BEAS-2B的上皮间质转换,其机制可能与STAT3/SMAD3信号通路相关。虽然疾病的类别有所不同,但对于肺和气道纤维化,miR-320a-3p在抑制二者的EMT方面是存在着共通机制的。本研究为miR-320a-3p成为可能的肺及气道纤维化的治疗靶标提供了理论依据。
二、转化生长因子的生物学效应与纤维化疾病的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转化生长因子的生物学效应与纤维化疾病的研究（论文提纲范文）
（1）活血除痹汤干预Akt-mTOR自噬通路治疗硬皮病硬化期模型小鼠的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 硬皮病发病机制与现代医学治疗研究进展 |
| 1 硬皮病发病机制的现代研究进展 |
| 2 硬皮病的现代医学治疗进展 |
| 3 小结 |
| 综述二 中医对硬皮病的认识及治疗研究进展 |
| 1 病名归属认识进展 |
| 2 病因病机认识进展 |
| 3 中医内治法研究进展 |
| 4 中医外治法研究进展 |
| 5 小结 |
| 综述三 中医药通过干预细胞自噬治疗纤维化疾病的研究进展 |
| 1 细胞自噬及相关通路 |
| 2 中医药干预自噬治疗肝纤维化 |
| 3 中医药干预自噬治疗肺纤维化 |
| 4 中医药干预自噬治疗心肌纤维化 |
| 5 中医药干预自噬治疗肾纤维化 |
| 6 中医药干预自噬治疗其他纤维化疾病 |
| 7 小结 |
| 前言 |
| 第一章 导师治验 |
| 1 病因病机 |
| 2 三期论治 |
| 3 治疗特点 |
| 4 验案举例 |
| 5 小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 活血除痹汤对硬皮病硬化期Balb/c模型小鼠皮损ROS、PDGF、TGF-β水平的影响研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结与讨论 |
| 实验二 活血除痹汤对硬皮病硬化期Balb/c模型小鼠皮损Akt-mTOR自噬通路的影响研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述 |
| 综述一 特发性肺纤维化发病机制的研究进展 |
| 综述二 生物信息学和网络药理学的主要研究方法及原理 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于特发性肺纤维化转录组数据的生物信息学研究 |
| 第一节 特发性肺纤维化的基因集富集研究 |
| 1 特发性肺纤维化的GSEA基因集富集分析 |
| 2 特发性肺纤维化关键基因的差异表达基因分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 特发性肺纤维化不同临床特征的加权基因共表达网络研究 |
| 1 特发性肺纤维化的基因共表达特征 |
| 2 特发性肺纤维化不同临床特征的基因共表达特征 |
| 3 特发性肺纤维化的分子特征 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人参平肺散干预特发性肺纤维化的网络药理学研究 |
| 第一节 人参平肺散干预特发性肺纤维化的网络调控机制研究 |
| 第二节 人参平肺散干预中、高年龄特发性肺纤维化的网络调控机制比较研究 |
| 1 人参平肺散成分干预特发性肺纤维化高龄特征的网络机制 |
| 2 人参平肺散成分干预特发性肺纤维化中年特征的网络机制 |
| 3 讨论 |
| 第三节 人参平肺散对特发性肺纤维化调控机制的虚拟对接研究 |
| 1 以TGF β信号通路为例的通路靶点选择 |
| 2 人参平肺散靶点的计算机模拟对接研究 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 人参平肺散干预TGF-β_1诱导肺成纤维细胞MRC-5细胞表型转化的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 主要内容和结果 |
| 2 创新点 |
| 3 问题与展望 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 攻读博士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）调肾通络方防治重度宫腔粘连术后再粘连的临床疗效及其调控TGF-β1/Smads信号通路的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 调肾通络方防治IUA术后再粘连的临床疗效 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IUA纤维化程度及与TGF- β1/Smads信号通路的相关性 |
| 1 材料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 动物实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 细胞实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 创新点、不足与展望 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 综述 宫腔粘连中西医发病机制及术后再发粘连防治研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中英文缩略词表 |
| 临床病例观察表 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 参与肝星状细胞的增殖活化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 LX2 细胞培养及细胞传代 |
| 1.4 rhTGF-β诱导LX2 细胞活化增殖 |
| 1.5 ICG-001、AS1842856 干预活化的LX2 细胞 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 增殖活化表型 |
| 2.2 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 细胞增殖活化的作用机制 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 小鼠肝纤维化动物模型构建以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 与肝纤维化病程关系初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCl_4、BDL模型不同时点的小鼠一般状况 |
| 2.2 CCl_4、BDL模型不同时点的肝脏外观改变 |
| 2.3 CCl_4、BDL模型不同时点的肝功能变化 |
| 2.4 CCl_4、BDL模型不同时点的组织学改变 |
| 2.5 CCl_4、BDL模型不同时点α-SMA免疫组织化学结果 |
| 2.6 CCl_4、BDL模型不同时点炎症因子表达水平 |
| 2.7 CCl_4、BDL模型不同时点β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF转录复合物变化. |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时小鼠一般状况 |
| 2.2 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时肝脏外观及肝重体重比 |
| 2.3 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时血清肝功能水平 |
| 2.4 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 wS时肝脏组织学变化 |
| 2.5 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时 COL-I、α-SMA水平 |
| 2.6 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF2 w促进FOXO1 靶基因foxp3、p27~(kip1)表达 |
| 2.7 抑制BDL模型β-catenin/TCF时肝脏组织炎症因子水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控肝纤维化的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、FOXO1 共同调控肝纤维化进展 |
| 2.2 肝脏核蛋白中TCF、FOXO1与β-catenin竞争结合形成不同转录复合物 |
| 2.3 体内HSCs中 TCF、FOXO1与β-catenin形成不同转录复合物调控肝纤维化进展 |
| 2.4 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织炎症因子水平 |
| 2.5 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织细胞周期抑制蛋白p27~(kip1) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五部分 探讨人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 转录复合物与纤维化进展的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 临床组织标本收集 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胆道闭锁导致胆汁淤积性肝纤维化患者基本信息统计 |
| 2.2 患者肝脏组织石蜡切片HE、Masson、天狼星红染色结果及纤维化分期 |
| 2.3 不同分期患者肝脏组织TGF-β、IL-10、Ki67 水平 |
| 2.4 不同分期患者肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点与不足之处 |
| 1.本研究的特色与创新点 |
| 2.本研究不足之处及进一步的研究设想 |
| 参考文献 |
| 综述 转化生长因子-β信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）功能性复合支架构建及其促进创伤修复的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 第一节 组织工程支架在创伤修复领域的发展现状 |
| 1.1.1 组织工程策略促进创伤修复的研究背景 |
| 1.1.1.1 无支架组织工程策略 |
| 1.1.1.2 基于支架的组织工程策略 |
| 1.1.2 组织工程复合支架的设计理念 |
| 1.1.2.1 生物材料的分类 |
| 1.1.2.2 组织工程复合支架的制备技术与方法 |
| 1.1.3 复合支架在创伤修复领域的应用与挑战 |
| 第二节 皮肤创伤修复领域的发展现状 |
| 1.2.1 皮肤创伤修复的现状 |
| 1.2.2 创伤修复过程 |
| 1.2.2.1 炎症反应阶段 |
| 1.2.2.2 新组织形成 |
| 1.2.2.3 组织重塑 |
| 1.2.3 疤痕创伤治疗机理 |
| 1.2.3.1 疤痕降低与创伤修复炎症阶段的关系 |
| 1.2.3.2 调节组织增殖阶段减少疤痕形成 |
| 1.2.3.3 基于整合素与粘着斑相关信号的疤痕降低策略 |
| 1.2.4 组织工程中无疤痕修复策略 |
| 1.2.4.1 常见治疗手段 |
| 1.2.4.2 组织工程治疗手段 |
| 1.2.5 组织工程复合支架在皮肤创伤修复领域的展望 |
| 第三节 诱导组织再生材料在牙周修复领域的发展现状 |
| 1.3.1 牙周组织概述 |
| 1.3.2 常见的牙周疾病治疗手段 |
| 1.3.3 再生材料在牙周组织再生方面的应用 |
| 1.3.3.1 GTR在牙周组织再生方面的应用 |
| 1.3.3.2 GBR在牙周组织再生方面的应用 |
| 1.3.4 常见的牙周组织再生材料的制备 |
| 1.3.5 未来的挑战和展望 |
| 第四节 骨组织再生领域的发展现状 |
| 1.4.1 骨组织简介 |
| 1.4.2 骨修复过程及常用治疗手段 |
| 1.4.2.1 骨修复的过程 |
| 1.4.2.2 常用的治疗手段 |
| 1.4.3 骨组织工程的发展 |
| 1.4.3.1 支架 |
| 1.4.3.2 细胞 |
| 1.4.3.3 生物活性因子 |
| 1.4.3.4 力学环境 |
| 1.4.4 骨组织工程的挑战和展望 |
| 第五节 本课题的提出及研究意义 |
| 第二章 负载抗纤维化多肽的复合水凝胶在皮肤创伤修复中防疤痕的作用 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器与实验材料 |
| 2.2.1.1 实验仪器 |
| 2.2.1.2 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 复合水凝胶的制备 |
| 2.2.2.2 表面形貌观察 |
| 2.2.2.3 溶胀性 |
| 2.2.2.4 机械性能 |
| 2.2.2.5 化学结构表征 |
| 2.2.2.6 保湿性 |
| 2.2.2.7 降解性 |
| 2.2.2.8 多肽释放实验 |
| 2.2.2.9 流变性实验 |
| 2.2.2.10 细胞活性实验 |
| 2.2.2.11 细胞粘附实验 |
| 2.2.2.12 血液凝结实验 |
| 2.2.2.13 抗菌实验 |
| 2.2.2.14 细胞迁移实验 |
| 2.2.2.15 胶原沉积实验 |
| 2.2.2.16 免疫细胞荧光染色 |
| 2.2.2.17 Western blot检测α-SMA表达 |
| 2.2.2.18 通过qRT-PCR分析纤维化相关基因表达 |
| 2.2.2.19 兔耳疤痕皮肤创伤模型的建立 |
| 2.2.2.20 组织学染色实验 |
| 2.2.2.21 RNA测序 |
| 2.2.2.22 数据统计方法 |
| 第三节 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 复合水凝胶的理化性质结果分析 |
| 2.3.1.1 成胶性观察 |
| 2.3.1.2 复合水凝胶表面形貌观察 |
| 2.3.1.3 力学性质分析 |
| 2.3.1.4 流变学结果分析 |
| 2.3.1.5 表面化学结构分析 |
| 2.3.1.6 溶胀性、保水性和降解性分析 |
| 2.3.1.7 多肽释放动力学结果分析 |
| 2.3.2 体外实验结果分析 |
| 2.3.2.1 细胞相容性分析 |
| 2.3.2.2 细胞粘附形态分析 |
| 2.3.2.3 血液凝结效果分析 |
| 2.3.2.4 抗菌性结果分析 |
| 2.3.2.5 水凝胶浸提液对细胞迁移的影响 |
| 2.3.2.6 胶原沉积的定量结果分析 |
| 2.3.2.7 细胞中α-SMA和 F-actin表达分析 |
| 2.3.2.8 α-SMA的蛋白表达分析 |
| 2.3.2.9 与皮肤疤痕形成有关的m RNA表达分析 |
| 2.3.3 兔耳疤痕实验结果 |
| 2.3.3.1 皮肤创伤修复的形态观察 |
| 2.3.3.2 H&E染色结果 |
| 2.3.3.3 Masson三色染色结果 |
| 2.3.3.4 天狼猩红染色结果 |
| 2.3.3.5 CD31 染色结果 |
| 2.3.3.6 α-SMA染色结果 |
| 2.3.3.7 胶原染色结果 |
| 2.3.3.8 体内炎症反应结果 |
| 2.3.4 基因表达和生物学功能分析 |
| 2.3.4.1 关于HSF的 RNA测序分析 |
| 2.3.4.2 关于HaKF的 RNA测序分析 |
| 第四节 小结 |
| 第三章 结合壳聚糖的“类三明治”结构纳米纤维复合膜诱导牙周组织再生的研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器与实验材料 |
| 3.2.1.1 实验仪器 |
| 3.2.1.2 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 CS溶液的制备 |
| 3.2.2.2 PG纺丝液的制备 |
| 3.2.2.3 静电纺丝PG纳米纤维膜的制备 |
| 3.2.2.4 结合CS的PG纳米纤维多层复合膜材料的制备 |
| 3.2.2.5 表面形貌观察 |
| 3.2.2.6 化学结构表征 |
| 3.2.2.7 溶胀性实验 |
| 3.2.2.8 孔隙率实验 |
| 3.2.2.9 拉伸力学实验 |
| 3.2.2.10 水接触角实验 |
| 3.2.2.11 体外降解实验 |
| 3.2.2.12 复合膜结构稳定性实验 |
| 3.2.2.13 3T3 细胞相容性实验 |
| 3.2.2.14 HGF细胞活性实验 |
| 3.2.2.15 细胞粘附实验 |
| 3.2.2.16 天狼猩红染色 |
| 3.2.2.17 血液凝结实验 |
| 3.2.2.18 大鼠皮下埋植实验 |
| 3.2.2.19 体内降解实验 |
| 3.2.2.20 组织学染色实验 |
| 3.2.2.21 数据统计方法 |
| 第三节 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 CS-PG多层复合膜材料的理化表征结果分析 |
| 3.3.1.1 表观形貌观察结果 |
| 3.3.1.2 材料表面化学特征分析 |
| 3.3.1.3 溶胀率和孔隙率分析 |
| 3.3.1.4 力学性质分析 |
| 3.3.1.5 亲水性结果分析 |
| 3.3.1.6 材料体外降解性分析 |
| 3.3.2 体外实验结果分析 |
| 3.3.2.1 细胞相容性分析 |
| 3.3.2.2 细胞活性结果分析 |
| 3.3.2.3 细胞胶原沉积分析 |
| 3.3.2.4 细胞粘附形态分析 |
| 3.3.2.5 材料的血液凝结效果分析 |
| 3.3.3 大鼠皮下埋植实验结果 |
| 3.3.3.1 体内降解性分析 |
| 3.3.3.2 体内细胞浸润分析 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 结合富血小板纤维蛋白的多功能复合支架诱导骨组织再生的研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器与材料 |
| 4.2.1.1 实验仪器 |
| 4.2.1.2 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 复合支架的制备 |
| 4.2.2.2 表面形貌观察 |
| 4.2.2.3 力学性质测试 |
| 4.2.2.4 水接触角实验 |
| 4.2.2.5 孔隙率测定 |
| 4.2.2.6 溶胀性测试 |
| 4.2.2.7 化学结构表征 |
| 4.2.2.8 体外降解实验 |
| 4.2.2.9 体外矿化实验 |
| 4.2.2.10 PRF中生长因子的释放实验 |
| 4.2.2.11 细胞相容性实验 |
| 4.2.2.12 细胞活性实验 |
| 4.2.2.13 HGF在P2G3 表面的浸润实验 |
| 4.2.2.14 细胞粘附实验 |
| 4.2.2.15 体外细胞成骨诱导实验 |
| 4.2.2.16 qRT-PCR探究成骨相关基因的表达 |
| 4.2.2.17 大鼠颅骨缺损模型的制备 |
| 4.2.2.18 组织学和免疫组织化学染色 |
| 4.2.2.19 兔牙槽骨缺损模型的制备 |
| 4.2.2.20 组织化学染色 |
| 4.2.2.21 数据统计方法 |
| 第三节 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 复合支架的表征分析 |
| 4.3.1.1 基本理化性质分析 |
| 4.3.1.2 亲水性结果分析 |
| 4.3.1.3 力学性质分析 |
| 4.3.1.4 表面化学特征分析 |
| 4.3.1.5 降解性结果分析 |
| 4.3.1.6 体外矿化活性结果分析 |
| 4.3.1.7 PRF中 PDGF和 TGF-β1 的释放规律 |
| 4.3.2 复合支架体外细胞行为分析 |
| 4.3.2.1 3T3 细胞的细胞相容性结果分析 |
| 4.3.2.2 HGF和 HDPSC的细胞相容性结果分析 |
| 4.3.2.3 细胞形貌观察 |
| 4.3.2.4 细胞浸润结果分析 |
| 4.3.2.5 ALP活性结果分析 |
| 4.3.2.6 HDPSC成骨分化结果分析 |
| 4.3.2.7 成骨相关基因的表达情况 |
| 4.3.3 大鼠颅骨缺损的骨再生实验结果 |
| 4.3.3.1 表观结果分析 |
| 4.3.3.2 Micro-CT结果 |
| 4.3.3.3 H&E染色结果 |
| 4.3.3.4 Masson三色染色结果 |
| 4.3.3.5 Goldner三色染色结果 |
| 4.3.3.6 OPN免疫组化结果 |
| 4.3.4 兔牙槽骨缺损模型的骨再生实验结果 |
| 4.3.4.1 表观结果分析 |
| 4.3.4.2 Micro-CT结果 |
| 4.3.4.3 H&E染色结果 |
| 4.3.4.4 Masson三色染色结果 |
| 4.3.4.5 Goldner三色染色结果 |
| 第四节 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）大黄-丹参治疗肾间质纤维化的网络药理学及实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 中医学对肾间质纤维化的认识 |
| 1.1 中医病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 现代医家辨证论治经验 |
| 2 现代医学对肾间质纤维化的认识 |
| 2.1 发病机制 |
| 2.2 病理特征 |
| 2.3 治疗方法 |
| 2.4 肾间质纤维化模型 |
| 大黄-丹参治疗肾间质纤维化的网络药理学研究 |
| 研究步骤与方法 |
| 1 化合物成分筛选 |
| 2 化合物成分-靶点网络构建 |
| 3 疾病靶点获取 |
| 4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建 |
| 5 关键靶点筛选 |
| 6 GO和 KEGG富集分析 |
| 7 分子对接 |
| 结果 |
| 1 化合物筛选 |
| 2 化合物作用靶点预测与网络分析 |
| 3 疾病靶点检索结果 |
| 4 药物-疾病作用靶点筛选 |
| 5 PPI网络构建与关键靶点筛选 |
| 6 GO和 KEGG富集分析 |
| 7 分子对接验证 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 大黄-丹参改善 UUO 小鼠肾间质纤维化作用机制的研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物与受试药物的选用 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 手术方案 |
| 2.2 取材方案 |
| 2.3 H&E染色和Masson染色 |
| 2.4 免疫组织化学 |
| 2.5 小鼠肾脏组织RNA的提取 |
| 2.6 逆转录 |
| 2.7 实时定量PCR |
| 2.8 数据统计方法和处理软件 |
| 结果 |
| 1 木犀草素减弱了UUO诱导的肾间质纤维化 |
| 2 木犀草素改善RIF的作用与抑制TGF-β/Smads信号通路有关 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图(附表、附录) |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 个人简历 |
（7）趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述一 CC家族趋化因子在特发性肺纤维化疾病中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 肺再生参与肺纤维化发生发展的机制 |
| 参考文献 |
| 第一章 CCL1-AMFR相互作用通过活化成纤维细胞促进肺纤维化发病 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 趋化因子CCL1促进肺纤维化发生发展 |
| 1.CCL1在肺纤维化病理状态下表达上调 |
| 2.CCL1促进肺纤维化进展 |
| 3.CCL1主要由肺泡巨噬细胞分泌 |
| 第二部分 CCL1募集和活化成纤维细胞 |
| 4.CCL1主要结合成纤维细胞 |
| 5.CCL1促进成纤维细胞迁移与活化 |
| 第三部分 CCL1-CCR8募集成纤维细胞 |
| 6.成纤维细胞表达CCR8受体 |
| 7.CCL1-CCR8相互作用募集成纤维细胞 |
| 8.CCL1对成纤维细胞的活化作用不依赖于CCR8 |
| 第四部分 CCL1-AMFR活化成纤维细胞 |
| 9.成纤维细胞膜上表达AMFR |
| 10.CCL1结合成纤维细胞膜上的AMFR |
| 11.CCL1-AMFR相互作用位点的确定 |
| 12.CCL1通过AMFR活化成纤维细胞 |
| 13.CCL1通过PKCα磷酸化AMFR |
| 14.PKCα介导的AMFR磷酸化参与活化成纤维细胞 |
| 第五部分 CCL1激活ERK-p70S6K通路以促进促纤维化蛋白合成 |
| 15.CCL1不改变促纤维化基因的RNA水平 |
| 16.CCL1通过激活ERK通路活化成纤维细胞 |
| 17.CCL1通过ERK-p70S6K通路活化成纤维细胞 |
| 第六部分 CCL1-AMFR解除Spry1对ERK通路的抑制作用 |
| 18.CCL1-AMFR通过Spry1激活ERK通路 |
| 19.CCL1-AMFR通过膜转位Spry1活化Ras-ERK级联信号 |
| 第七部分 AMFR诱导Spry1泛素化以解除其对ERK的抑制 |
| 20.CCL1激活ERK通路依赖于AMFR的E3连接酶活性 |
| 21.AMFR作为E3泛素连接酶泛素化Spry1 |
| 22.AMFR催化Spry1的K27位多聚泛素化 |
| 23.PKCα介导的磷酸化使AMFR获得E3酶活性 |
| 24.膜AMFR泛素化Spry1以活化ERK通路 |
| 第八部分 CCL1中和抗体改善肺纤维化进展 |
| 25.CCL1中和抗体抑制成纤维细胞活化 |
| 26.CCL1中和抗体改善肺纤维化进展 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 细胞周期抑制子p21通过抑制肺泡再生促进肺纤维化发生发展 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 反复BLM损伤导致不可逆的肺纤维化病变 |
| 1.反复的BLM损伤导致不可逆的病理改变 |
| 第二部分 BLM所致的端粒缩短和ROS堆积导致AT2中p21上调 |
| 2.反复的BLM损伤诱导依赖于p21的AT2老化 |
| 3.反复的BLM损伤诱导AT2的端粒缩短 |
| 4.持续的ROS堆积诱导AT2中的p21上调 |
| 第三部分 p21堆积抑制AT2的自我更新和分化 |
| 5.mBLM损伤抑制AT2的再生 |
| 6.p21抑制AT2的自我更新 |
| 7.p21抑制AT2-AT1的分化 |
| 第四部分 p21诱导细胞周期阻滞并阻断p300-β-catenin结合抑制再生 |
| 8.p21诱导细胞周期阻滞以抑制AT2的自我更新 |
| 9.p21打断p300-β-catenin相互作用以抑制AT2-AT1分化 |
| 第五部分 敲低p21改善肺纤维化进展 |
| 10.敲低p21改善mBLM诱导的肺纤维化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及传代 |
| 2.2 检测TFL药物对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.3 透射电子显微镜观察HSC-T6的超微结构 |
| 2.4 ELISA检测MMP-2、ColⅠ、ColⅢ的含量变化 |
| 2.5 肝纤维化动物造模分组及含药血清的制备 |
| 2.6 检测含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.7 含药血清干预后蛋白质的收集与提取 |
| 2.8 DDA检测 |
| 2.9 DIA检测 |
| 2.10 主要数据库和数据指标 |
| 2.10.1 NR数据库和UniProt蛋白数据库 |
| 2.10.2 STRING蛋白互作数据库 |
| 2.10.3 GO数据库 |
| 2.10.4 KOG数据库 |
| 2.10.5 KEGG数据库 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TFL药物对HSC-T6生长抑制率的影响 |
| 3.2 TFL药物对HSC-T6超微结构的影响 |
| 3.3 TFL药物对HSC-T6的MMP-2、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 |
| 3.4 肝纤维化动物造模结果 |
| 3.5 不同浓度的含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 3.6 肽段与蛋白的定量质控分析 |
| 3.7 DDA/DIA检测结果 |
| 3.8 GO富集分析 |
| 3.9 KOG注释分析 |
| 3.10 PPI分析 |
| 3.11 PATHWAY富集分析 |
| 3.12 亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 理论基础 |
| 4.1.1 肝纤维化与肝星状细胞的理论基础 |
| 4.1.2 差异蛋白质组学的理论基础 |
| 4.1.3 中医药对肝纤维化认识的理论基础 |
| 4.1.4 荔枝核总黄酮(TFL)治疗肝纤维化的理论基础 |
| 4.2 TFL对HSC-T6生长增殖的影响 |
| 4.3 TFL对HSC-T6的ECM形成相关因子的影响 |
| 4.3.1 基质金属蛋白酶2(MMP-2) |
| 4.3.2 Ⅰ型胶原(ColⅠ) |
| 4.3.3 Ⅲ型胶原(ColⅢ) |
| 4.4 TFL对HSC-T6部分差异蛋白功能的讨论 |
| 4.4.1 上调蛋白 |
| 4.4.2 下调蛋白 |
| 4.5 TFL对HSC-T6差异蛋白部分信号通路的分析 |
| 4.5.1 PI3K/Akt通路 |
| 4.5.2 NF-κB信号通路 |
| 4.5.3 胆固醇代谢与合成 |
| 4.5.4 补体和凝血级联 |
| 4.5.5 细胞色素P450 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 荔枝核总黄酮防治肝纤维化相关细胞因子及信号通路的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
（9）糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 LncRNA在DKD肾脏纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中药改善DKD氧化应激损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于网络药理学探讨糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的机制 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 糖肾方治疗单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 糖肾方通过调控TGFβ1/Smad3和LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第四章 糖肾方通过调控Keap1/Nrf2减轻DKD氧化应激损伤的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间主要研究成果 |
（10）miR-320a-3p抑制肺及气道EMT的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 miR-320a-3p对TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT的作用及机制的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第二部分 miR-320a-3p对TGF-β1诱导的气道上皮细胞EMT的作用及机制的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:miRNA在肺纤维化中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
四、转化生长因子的生物学效应与纤维化疾病的研究（论文参考文献）
- [1]活血除痹汤干预Akt-mTOR自噬通路治疗硬皮病硬化期模型小鼠的机制研究[D]. 王瑞洁. 北京中医药大学, 2021(02)
- [2]基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究[D]. 杨斓. 南京中医药大学, 2021
- [3]调肾通络方防治重度宫腔粘连术后再粘连的临床疗效及其调控TGF-β1/Smads信号通路的作用机制研究[D]. 牛红萍. 南京中医药大学, 2021(01)
- [4]β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究[D]. 王晓玲. 山西医科大学, 2021(01)
- [5]功能性复合支架构建及其促进创伤修复的研究[D]. 张琳. 南开大学, 2021(02)
- [6]大黄-丹参治疗肾间质纤维化的网络药理学及实验研究[D]. 韩晶雪. 黑龙江省中医药科学院, 2021(02)
- [7]趋化因子CCL1和细胞周期抑制蛋白p21在肺纤维化发生发展中的作用机制研究[D]. 刘畅. 北京协和医学院, 2021(02)
- [8]荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究[D]. 蒋云霞. 广西中医药大学, 2021(01)
- [9]糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究[D]. 周学锋. 北京中医药大学, 2021(01)
- [10]miR-320a-3p抑制肺及气道EMT的作用及机制研究[D]. 王新. 重庆医科大学, 2021(01)
标签：对照组论文; 转化生长因子-β论文; β-catenin论文; 细胞生长因子论文; 基因合成论文;