一、人眼角膜缘干细胞病理学研究（论文文献综述）
郭庆[1]（2017）在《羊膜对角膜损伤的治疗作用及其机理研究》文中提出眼表疾病是眼科的常见病、多发病,且复发率高,是眼科主要致盲疾病之一。对于各种眼表疾病所致角膜上皮缺损的治疗,目前以眼表面重建术效果最好,常采用的方法是自体或异体角膜移植术。但自体角膜缘取材有限,并有造成健眼角膜缘干细胞缺乏的风险。异体角膜要求新鲜,且存在来源不足、排斥反应等问题。由于羊膜有其特有的结构特点和促进组织修复的生物学特性,研究者们开始转向以羊膜为原材料治疗眼表疾病的研究中。在对羊膜移植的研究基础上,羊膜的研磨提取液—羊膜匀浆液保留了羊膜中的有效生物成分,在治疗眼表疾病方面取得了一定的进展,是一种较新的尝试。随着生物技术和其他相关技术的发展,以羊膜上皮细胞作为“种子细胞”构建组织工程角膜上皮,在眼表疾病治疗中亦显示出良好的发展前景。本文以羊膜为原材料,从动物实验、临床研究、细胞培养三个层面,研究羊膜移植片、羊膜匀浆液、羊膜上皮细胞对角膜上皮缺损的治疗作用及作用机制,为解决眼表重建材料缺乏及严重眼表疾病的治疗提供新的方法和新的理论依据。首先建立兔角膜上皮损伤的动物模型,行以羊膜移植术,以观察羊膜对动物角膜伤口愈合的作用。结果发现,羊膜移植组与对照组比较,角膜上皮愈合加快,显微形态学观察显示,实验组细胞排列水平、细胞形态、炎症细胞数等方面较对照组均明显改善。其次,在动物实验的基础上,对不同病因所致的眼表上皮缺损患者24人（25眼）,行以羊膜移植术,该临床研究发现:25只眼中21只眼眼表面得以重建,视力有不同程度的提高。再生的角膜上皮透明,结膜组织稳定、无感染。平均观察28.3周,所有21只眼无复发,另外3只眼因并发症致手术失败。再次,以上皮细胞缺损的兔角膜作为研究对象,观察不同浓度羊膜匀浆液对角膜上皮细胞增殖的作用。结果发现,羊膜匀浆液对兔角膜上皮细胞增殖和修复具有明显的促进作用,且这种促进作用在一定范围内随浓度增加而增强,即角膜上皮细胞的增殖率对羊膜匀浆液具有浓度依从性。羊膜匀浆组与羊膜移植组比较作用效果相同,但可避免手术并发症。最后,进行羊膜及角膜上皮细胞培养以及二者共同培养的细胞学研究。结果显示:羊膜上皮细胞在原代培养2 h后开始贴壁生长。细胞呈多角形、不规则形,排列呈铺路石样。体外可连续传45代,CK3、CK18、CK19呈阳性表达。流式细胞仪检测CK3、CK18、CK19表达率分别为40.84±3%,47.51±2%和32.41±3%。角膜上皮细胞在培养的第3天时开始爬出,呈多角形,排列均匀。经诱导培养后的羊膜上皮细胞呈多角形、扁平状,细胞体积增大。流式细胞学检测CK3表达率为76.40±0.3%,与诱导前相比有显着差异（P<0.05）,具有统计学意义。综上所述,本文针对羊膜进行了动物实验、临床研究、细胞培养三个层面的研究工作,实验和临床研究均证明了羊膜对角膜上皮缺损的修复具有促进作用,为解决眼表重建材料缺乏及严重眼表疾病的治疗提供了新的途径和方法。
冯萧萧[2]（2014）在《皮下培植兔角膜缘干细胞联合新鲜羊膜移植治疗兔眼角膜缘干细胞缺乏性功能障碍的研究》文中研究表明目的探讨以羊膜为载体,自体皮下培植兔角膜缘干细胞（Limbal stem cells, LSCs）的可行性。观察培养的兔角膜缘干细胞联合新鲜羊膜移植治疗兔眼角膜缘干细胞缺乏性功能障碍（limbal stem cell deficiency,LSCD）的疗效。方法健康新西兰大白兔55只,所有兔均取左眼角膜上方,角巩膜缘灰白色交界处,2mm×3mm×lmm大小的角膜缘组织块,用新鲜羊膜反折包裹后,埋植于自体左侧皮下腹斜肌表面血管网处。分别于1周、2周、3周、4周取出组织块进行病理切片（HE染色）、免疫组织化学（P63、E-cadherin）检查,判断角膜缘干细胞是否存活、增生或分化。通过碱烧伤方法,将兔右眼制成LSCD模型。将成功建立LSCD模型的50只兔随机分成5组：皮下培植角膜缘干细胞1周移植组（AM+LSC1W）.皮下培植角膜缘干细胞2周移植组（AM+LSC2W）.皮下培植角膜缘干细胞3周移植组（AM+LSC3W）.皮下培植角膜缘干细胞4周移植组（AM+LSC4W）及单纯新鲜羊膜移植组（AM）。每组10只兔10只眼。实验组（即AM+LSC1W组、AM+LSC2W组、AM+LSC3W组、AM+LSC4W组）用皮下培植的角膜缘干细胞联合新鲜羊膜进行移植手术,对照组（AM组）用新鲜羊膜行手术。术后每周观察角膜透明度、角膜新生血管生成程度、睑球粘连情况,并记录角膜上皮愈合时间。于术后1月对角膜形态（角膜新生血管、角膜混浊度）进行评分,并摘除术眼,进行病理学（HE染色和PAS染色）检查。结果培养前期（1W）,组织块细胞存活良好,多达10层以上的细胞,近似在体角膜缘细胞形态,层次分明。细胞间紧密连接。基底层的柱状细胞较多,P63强阳性表达,E-cadherin蛋白表达阴性。培养中期（2W、3W）,培养的组织块存活良好。2W的组织块细胞出现细胞层次明显增多,基底层表达P63阳性的细胞较第1W增多明显,E-cadherin蛋白仍为阴性表达。3W时的组织块细胞E-cadherin蛋白表达阳性的细胞增多。而培养后期（4W）的组织块,细胞层数减少为4-5层,细胞形态为扁平细胞和翼状细胞多见,E-cadherin蛋白表达强阳性。角膜缘干细胞缺乏性功能障碍模型建立后,各组间眼表新生血管及混浊度评分无统计学差异（F=0.111P>0.05.F=0.265P>0.05）.移植术后1月,AM+LSC1W组角膜上皮愈合时间（19.70±1.34）d、AM+LSC2W组（18.90±2.38）d、AM+LSC3W组（18.90±2.92）d.AM+LSC4W组（20.10±2.02）d、AM组（25.50±1.27）d,各实验组间无统计学差异,与AM组相比,角膜上皮愈合时间短,比较均有统计学差异。移植术后,AM+LSC1W组、AM+LSC2W组、AM+LSC3W组角膜眼表形态较术前明显改善,角膜新生血管减少,混浊度减轻（P<0.05）.AM+LSC4W组及新鲜羊膜移植组术后眼表形态未得到明显改善（P>0.05）.AM+LSC（2W）及AM+LSC（4W）组分别有1例出现睑球粘连。结论以羊膜为载体,短时间内行皮下培植角膜缘干细胞的方法是可行的。培植时间3周时,角膜缘干细胞开始出现分化。4周时,培植的角膜缘干细胞组织片近似于角膜上皮组织结构。皮下培植的角膜缘干细胞联合新鲜羊膜移植治疗兔眼LSCD,植片可以存活,术后可以促进角膜上皮的愈合,并能有效的阻止角膜新生血管生成,减轻角膜混浊程度。
程钧[3]（2013）在《眼表重建手术后早期供体干细胞的存活状态及其影响因素研究》文中提出目的体外培养的异体角膜缘上皮细胞移植术是治疗角膜缘干细胞缺乏的有效方案,在临床中我们观察到术后有些患者会发生再次角膜新生血管化和角膜上皮反复缺损,考虑其原因可能为手术后供体细胞不能很好的存活并发挥功能。因此,本研究的目的是通过动物模型模拟该手术及术后的临床过程,探讨手术后供体细胞的存活状态和其可能的影响因素,并进一步探讨手术后可维持眼表稳定的可行措施。方法1、动物模型的建立和评价采用4周龄雌性新西兰大白兔45只,建立碱烧伤致兔眼角膜缘干细胞缺乏的动物模型。将实验兔随机分为2组：中度组和重度组,每组22只,每只兔均选右眼建模、手术。用内径12mm,外径18mm的环形滤纸片浸透1mol/L NaOH,覆盖于实验兔角膜缘处,重度组接触1min,中度组接触30s。然后用0.9%氯化钠注射液冲洗角膜表面和结膜囊5分钟。烧伤后每天观察兔角膜变化,并于碱烧伤后稳定期对角膜新生血管程度和炎症程度进行评分。用HE染色方法观察比较正常兔角膜和碱烧伤后稳定期兔角膜的组织病理学差异；用免疫组织化学方法检测正常组和碱烧伤后稳定期时兔角膜中p63、CD68的表达情况；用Real time-PCR方法检测正常组和碱烧伤后稳定期时兔角膜中干细胞相关因子ANp63α、ABCG2、CK3,及炎症因子IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、MCP-1、iNOS、TGF-β、 VEGF的表达量。2、以羊膜为载体人角膜缘上皮细胞体外培养角膜来自山东省眼科研究所眼库,取用角膜移植后剩余的角巩膜环,将角膜上皮细胞消化成单细胞后接种于去上皮羊膜上,每天观察细胞生长情况,待细胞铺满羊膜形成复层时进行移植手术3、以羊膜为载体培养的人角膜缘上皮细胞移植术取碱烧伤后处于稳定期的兔角膜进行手术。术中剪开全周球结膜,剥除角膜表而覆盖的血管膜,将培养有人角膜缘上皮细胞的羊膜覆盖于角膜表面,将羊膜于角膜缘处缝合5～8针固定于球结膜和巩膜之间。手术中注意保护细胞避免受到损伤,术毕行睑裂缝合避免角膜过度暴露。4、手术后的临床疗效评价和供体细胞的存活状态检测分别于术后即刻,术后1天、3天、7天、14天、21天和28天时用裂隙灯显微镜观察术后兔角膜变化,对角膜新生血管化程度和炎症程度进行评分,并利用裂隙灯照相系统进行图像记录。在上述各时间点取兔角膜进行HE染色,并用免疫组化方法检测供体和受体中p63、Ki-67的表达情况。用RT-PCR方法检测术前及术后各时间点供体和受体细胞中干细胞相关因子ANp63α、Ki-67、ABCG2、C/EBPA、CK3的表达量。5、手术后眼表微环境中炎症因子表达情况检测分别于手术后即刻、术后1天、3天、7天、14天、28天时取兔角膜,用免疫组化方法检测CD68的表达情况,用Real time-PCR方法检测炎症因子IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、MCP-1、iNOS、TGF-β、VEGF、CD4、CD8的表达量。结果1、碱烧伤后兔角膜的病变特征碱烧伤后烧伤部位的角膜即呈瓷白色混浊,碱烧伤后1周内为急性期,球结膜缺血,角膜水肿,角膜上皮持续缺损,碱烧伤后第2-3周进入损伤和修复共存期。中度碱烧伤组在烧伤后4-8周时角膜新生血管化,炎症反应趋于稳定；重度碱烧伤组在伤后8-12周时才能进入稳定期。中度碱烧伤组有3眼评分未达标而排除研究,重度碱烧伤组3眼角膜穿孔排除研究。根据评分标准,中度组和重度组的总分平均值分别为5.7±1.2分和8.8±1.1分,两组差别有统计学意义（P=0.000）。HE染色可见碱烧伤后稳定期时角膜表面覆盖扁平的鳞状上皮细胞,基质内见大量管径粗大的新生血管,可达深基质层。免疫组织化学检测可见大量CD68阳性的炎症细胞浸润,角膜中p63表达阴性。Real time-PCR结果显示碱烧伤组ANp63α、ABCG2、CK3的表达显着低于正常对照组,其中重度碱烧伤组降低较中度碱烧伤组降低更为显着（P<0.05）。碱烧伤后稳定期角膜中炎症因子IL-1β、 IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、 iNOS、MCP-1、TGF-β、VEGF的表达显着高于正常对照组。2、以羊膜为载体培养的兔角膜缘上皮细胞移植术后的临床疗效中度碱烧伤组在术后1-28天时均可见到角膜上皮完整,未见新生血管再次生长。重度碱烧伤组在术后1天时可见到角膜上皮片状缺损,术后3天时角膜上皮修复完整,术后14天和21天时再次出现角膜上皮片状缺损,自术后14天时可见新生学管再次长入角膜,甚至比术前更为严重。HE染色可见术后7天内羊膜与角膜贴附不紧密,术后14天时羊膜吸收,但此时角膜上皮细胞与角膜基质仍有分离现象。中度碱烧伤组术后21天和28天时角膜上皮完整,角膜基质内未见新生血管管腔；重度碱烧伤组可见角膜上皮缺损,或角膜上皮不规则增生,呈鳞状上皮化,角膜基质内大量炎症细胞浸涧,并可见到新生血管管腔。3、手术后供体细胞的存活状态免疫组织化学检测在中度碱烧伤组术后28天内均可见供体p63和Ki-67表达。重度碱烧伤组术后7天内可见p63表达,偶见Ki-67阳性细胞,RT-PCR结果显示两组供体细胞中ANp63α的农达在手术后即刻降低约40%,术后3天时显着降低,而ABCG2在术后28天内均有表达但呈逐渐下降趋势。中度碱烧伤组Ki-67的表达量在术后7天内较术前升高,但术后14天时即显着降低至消失；C/EBPA和CK3的表达量在术后即刻较术前降低,但术后1天时有所上调,术后3天、7天时呈显着下降,至术后14天后几乎检测不到其表达。重度碱烧伤组Ki-67、C/EBP△、CK3的表达在术后3天时即显着降低,术后7天时表达量极低甚至消失。4、手术后眼表炎症微环境中炎症因子的表达HE染色和免疫组织化学结果：术后1天和3天时在羊膜下和角膜基质中可见分叶清晰的中性粒细胞浸润和CD68阳性的巨噬细胞浸润,术后7天时较少见到分叶清晰的中性粒细胞,但CD68阳性细胞仍较多。中度碱烧伤组术后14天后CD68阳性细胞逐渐减少,而重度碱烧伤组CD68阳性细胞浸润可持续至术后28天。Real-time PCR结果：炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1、IL-13、IL-10的表达在术后即刻即显着上调,术后3天时显着下调,术后7天和14天再次上调,随后逐渐下降。大部分炎症因子在术后出现两个高峰,即术后即刻和术后7天时。CD4和CD8的表达在术后1天、3天均处在极低水平,术后7天时骤然上调,此后下降。5、手术后受体中干细胞相关因子的表达中度碱烧伤组ANp63α、ABCG2、CK3、Ki-67的表达在术后较术前呈上调趋势,在术后21天时较为显着。重度碱烧伤组ANp63α、ABCG2、CK3、Ki-67在术后的表达量没有超过术前,在术后早期如1天、3天、7天时甚至较术前降低。结论1、角膜缘环形碱烧伤是建立角膜缘干细胞缺乏模型的有效方法,在碱烧伤后稳定期角膜内仍有大量巨噬细胞浸润和多种炎症因子高表达,中度碱烧伤角膜缘内可能残存一些可恢复功能的干细胞。2、移植的供体细胞在术后7天内可维持其增殖、分化和自我更新能力,随后细胞的各项功能均下降至丧失。3、术后早期的炎症反应和免疫排斥反应是影响移植的供体细胞功能的关键因素,巨噬细胞可能在其中发挥了主要作用。4、有足够的供体细胞长期存活并发挥正常功能是术后维持稳定眼表的一个必要条件,而受体自身残存足够的可恢复功能的角膜缘干细胞是术后维持稳定眼表的另一个重要条件。
李燕伟[4]（2013）在《人羊膜间充质干细胞移植对兔角膜碱烧伤的疗效及磁标记示踪分析》文中研究表明背景和目的角膜碱烧伤后,碱性物质能够迅速渗透眼表面,通过细胞渗透、蛋白水解酶和细胞因子的分泌导致严重的特征性的炎症反应。为保护角膜上皮的完整性,阻止基质层溃疡发生,国内外学者们已经应用了多种治疗方法,均取得了一定的疗效,但是何为最佳疗法,至今仍有争议,并未确定。本研究分别通过四个阶段探讨磁标记人羊膜间充质干细胞（human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells, hAM-dMSCs）移植对兔角膜碱烧伤治疗的影响,以及碱烧伤后泪液乳铁蛋白（lactoferrin, LF）的表达,研究泪液LF与碱烧伤的关系及其意义,以期获得对于角膜急性碱烧伤较为简易且适于临床使用的最佳治疗方法。1.通过观察人羊膜组织来源的细胞形态学、流式细胞仪检测和MTT法活性细胞检测等鉴定原代获取的间充质干细胞,为后续的实验提供干细胞。2.不同方法标记原代培养的羊膜间充质干细胞,探索最合适的细胞标记方法。3.超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs）标记的hAM-dMSCs局部移植入角膜碱烧伤眼结膜下,观察细胞在宿主存活和迁徙情况；联合传统的羊膜移植,通过临床检查及检测IL-1p和TNF-α评估治疗效果,探讨干细胞在角膜碱烧伤后组织再生中扮演的角色。4.采集正常和碱烧伤治疗后的兔泪液,采用放射免疫分析方法,分别测定其中LF的含量,研究泪液LF与碱烧伤的关系及其对碱烧伤愈合的意义。材料和方法1羊膜间充质干细胞的原代培养和鉴定使用酶消化和贴壁筛选法获取人羊膜组织中的间充质干细胞,反复传代对其扩增和纯化细胞。通过观察细胞学形态、MTT法活性检测和流式细胞仪检测等鉴定人羊膜来源的间充质干细胞。通过显微镜观察细胞的形态变化；采用流式细胞术检测人羊膜来源的细胞膜表面特异性蛋白分子CD31、CD44、CD45、 CD90、CD29、CD34的表达。2.SPIONs标记的羊膜间充质干细胞在体外的活性监测本研究应用SPIONs标记的细胞生长培养基（Cytokine Growth Medium, CGM）,标记浓度分别为3.5、7、14和28μg/ml,细胞标记采用单次SPIONs标记法。培养的细胞分别于标记后第1、2、4和7d收获,各时间点获得的细胞分为五组,分别行MTT法、普鲁氏蓝染色和流式细胞仪检测；无SPIONs标记的细胞生长培养基组作为对照组。3.羊膜间充质干细胞的标记分别采用不同浓度的Brdu、DAPI和SPIONs标记原代培养的人羊膜间充质干细胞,确定较好的羊膜间充质干细胞标记途径和方法,为羊膜间充质干细胞移植治疗角膜碱烧伤的活体示踪进行前期准备。4.羊膜间充质干细胞移植对重度角膜碱烧伤的疗效待移植细胞的制备：应用浓度为14μg/ml SPIONs标记原代培养获取的羊膜间充质干细胞,标记时间24h,收集细胞制成1×106细胞混悬液备用。实验动物分组和细胞移植的方法：动物被随机分成四组,对照组（n=10）；人羊膜间充质干细胞注射组（干细胞注射组,n=12）：结膜下注射含标记后的hAM-dMSCs注射液；单纯羊膜移植组（羊膜组,n=12）：行单纯羊膜移植；人羊膜间充质干细胞联合羊膜移植组（联合组,n=12）：结膜下注射含标记后的羊膜间充质干细胞注射液联合羊膜移植。结膜下注射一律选择眼球结膜颞上部位,注射量100微升,约含1×106个羊膜间充质干细胞,干细胞注射组和联合组对侧眼分别注射同等量含14μg/ml SPIONs的生理盐水作为对照。羊膜移植方法：碱烧伤后,实验侧眼开睑器开睑,1：1000庆大霉素液冲洗结膜囊,沿角膜缘环形剪开球结膜,分离结膜下组织,刮除角膜表面坏死组织,将羊膜上皮面朝上平铺使覆盖整个角膜和角膜缘,用10.0尼龙线于角膜缘附近间断缝合,并固定在浅层巩膜上,将球结膜游离缘固定在羊膜上,剪去多余羊膜组织。术毕结膜下注射庆大霉素2万u+地塞米松2mg,结膜囊内涂红霉素眼膏,缝合睑缘防止兔损伤手术创面。术后局部常规点抗生素,激素。5.兔角膜碱烧伤后泪液乳铁蛋白的表达泪液乳铁蛋白（lactoferrin, LF）检测选择在角膜碱烧伤治愈后,停药2周进行。治疗方法采用本实验得出的最佳治疗方法：人羊膜间充质干细胞联合羊膜移植治疗碱烧伤。将30只大白兔随机分为三组：空白组（n=10）：不进行任何处理；对照组（n=10）：制作兔眼角膜碱烧伤模型,不进行间充质干细胞或羊膜移植；实验组（n=10）：造模后,局部结膜下行人羊膜间充质干细胞移植联合羊膜移植。造模动物均局部常规用药,停药2周开始实验检测。用微量吸管吸取结膜囊内的泪液80-100ul,置于0.5m1无菌静脉输液管中,管端加热封闭管口,置于深低温（-30℃）冰箱内保存待检。放射免疫分析方法,测定正常角膜和碱烧伤治愈后的兔泪液LF的含量。结果1.用胰酶和胶原酶消化羊膜组织,将获得的细胞悬液接种在细胞培养瓶内进行原代培养。24小时后,倒置相差显微镜下观察见少量细胞贴壁；培养48小时贴壁细胞数量略增多；72小时后,贴壁细胞数量显着增多；原代培养第7天,贴壁细胞接近50%-60%融合,或基本铺满培养瓶底,贴壁细胞呈成纤维细胞样细胞。流式细胞仪检测细胞分析显示：原代培养的第三代细胞,高表达膜表面蛋白分子CD29、CD44、CD90、CD105;阴性表达CD31、CD34、CD45和CD106。2.不同浓度的SPIONs进行标记羊膜间充质干细胞,普鲁氏蓝染色后显示：胞质内可见不同数量的蓝染颗粒,各组SPIONs标记细胞的标记率均为100%。随标记浓度增加,蓝染颗粒增加,铁颗粒呈簇状聚集分布成堆。MTT结果明确显示：SPIONs浓度小于和等于14μg/ml时,标记的羊膜间充质干细胞活性大于90%。当SPIONs浓度大于14μg/m1时,细胞胞质内蓝染颗粒聚集前后无变化。3.用3种标记液标记细胞后细胞数目明显减少,但SPIONs和DAPI标记组细胞数在3d以后开始增加,其中SPIONs组细胞生长较好,第6天达到高峰。Brdu标记组细胞数目始终维持在5×104左右。4.14μg/ml SPIONs标记的羊膜间充质干细胞移植入兔结膜下,4周后角膜切片行普鲁士蓝染色,角膜缘处可见大量的蓝染颗粒,说明hAM-dMSCs存活于角膜缘,生长良好。受体兔全身情况良好,眼局部无排斥反应发生。而注射含147μg/ml SPIONs的生理盐水的对侧眼,在注射4周后未见蓝染颗粒。5.角膜碱烧伤的hAM-dMSCs移植结果：与对照组比较,实验组愈合率显着高于对照组（P<0.01）,而三个实验组的愈合率差异无显着性（X2=1.2,P>0.05）。4周时各实验组之间角膜新生血管与对照组相比差异有显着性（P<0.05）；角膜混浊度评分实验组与对照组相比差异有显着性（P<0.01）,；干细胞注射组和羊膜组与联合组相比差异有显着性（P<0.01）,干细胞注射组与羊膜组角膜混浊度评分差异无显着性（t=0.374,P>0.05）；不同治疗方法和时间角膜新生血管面积各组与对照组相比差异有显着性（P<0.01或P<0.05）,实验组组间比较,联合组与其余两个实验组相比差异有显着性（P<0.05）。HE染色显示角膜上皮层有3-4层细胞,由少量表皮细胞、翼状细胞和部分基底细胞组成。基质层可见少量新生血管和炎性细胞。角膜普鲁士染色显示,角膜缘处可见蓝染颗粒,提示hAM-dMSCs仍存活于角膜缘附近,角膜近中央区和中央区未见迁移的hAM-dMSCs。6.Western-blot检测兔角膜碱烧伤不同治疗方法后角膜TNF-a和IL-1β的表达：正常对照组及实验组角膜的蛋白经印记实验检测可见特异的阳性印迹带,Western-blot结果显示TNF-α和IL-1β在角膜碱烧伤后治疗过程中的各个阶段都有表达,且随着治疗时间的延长,其表达强度明显减弱。ELISA检测兔角膜碱烧伤后不同治疗方法和时间房水TNF-α和IL-1β的变化：实验眼房水TNF-α含量随着时间的延长呈下降趋势,不同时间点之间房水TNF-α含量比较在统计学上有显着性差异。对照眼房水TNF-α含量平均值随着时间的延长亦呈下降趋势。在同一观察时间点,实验眼房水TNF-α含量均低于对照眼,在统计学上有显着性差异。实验组和对照组房水IL-1β含量平均值均随着时间的延长呈下降趋势,且实验组房水IL-1p含量均低于对照眼。在同一观察时间点,第1天和第3天,实验组房水IL-1p含量低于对照组,第7天和第14天联合组房水IL-1p含量低于对照眼,并且在统计学上均有显着性差异。7.实验组与对照组比较,各观察时间点泪液中乳铁蛋白浓度差异有显着性（P<0.01）；对照组和实验组各观察时间点泪液中相对乳铁蛋白浓度均无统计学差异（P>0.05）；与正常空白组相比,对照组各观察时间点泪液中乳铁蛋白浓度差异有显着性（P<0.05）,实验组与空白组相比,其浓度无统计学意义（P>0.05）。经Spearman相关分析,各时间点泪液乳铁蛋白的含量与Schirmer I试验呈正相关（P<0.01）。结论1.本实验从人羊膜中分离间充质干细胞,所得的间充质干细胞纯度较高。实验提示：贴壁筛选和反复传代是一种较为理想的提纯羊膜间充质干细胞的方法。2.局部结膜下注射移植]hAM-dMSCs治疗眼表化学伤安全可行,有助于临床上新建一种细胞来源广泛、无免疫排斥的、微创的治疗眼表创伤疾病的新手段。3.应用SPIONs标记方法标记羊膜间充质干细胞,SPIONs浓度小于和等于14μg/ml,既可使羊膜间充质干细胞得到标记,又不影响其活性。4.SPIONs标记hAM-dMSCs移植治疗角膜碱烧伤动物模型,可达到示踪的目的。5.早期局部结膜下行hAM-dMSCs移植可显着抑制伤侧角膜表面新生血管形成,加速重度角膜碱烧伤创伤修复。hAM-dMSCs在宿主的迁移和分化,与局部微环境的改变密切相关。hAM-dMSCs的作用机制可能是通过调节细胞生长因子的分泌,改善残留的正常细胞所处的微环境,促进残留细胞的生长来发挥修复作用。6.本研究在角膜碱烧伤早期行hAM-dMSCs移植,与对照组相比,测得泪液LF含量明显增高。因此,除进行紧急有效的抢救措施外,早期行hAM-dMSCs移植,不仅能够加快创伤角膜愈合,且能够提高患者治愈后的视觉质量及生活质量。
中国医科大学医学信息学系[5]（2012）在《中国实用眼科杂志2012年第30卷主题词索引》文中研究指明
侯跃芳[6]（2010）在《中国实用眼科杂志2010年第28卷主题词索引》文中认为
李晶[7]（2010）在《一种新的干眼病模型—高渗盐水点眼小鼠干眼病模型的建立与评估》文中进行了进一步梳理背景与目的干眼病（dry eye disease）又称角结膜干燥症（keratoconjunctivitis sicca）或者泪液功能不全综合征（dysfunctional tear syndrome）,是指任何原因引起的泪液质和量的异常或动力学异常,导致泪膜稳定性下降,并伴有眼部不适,导致眼表组织病变为特征的疾病总称,是最常见的眼表疾病。干眼病严重影响患者的生活质量。干眼病发病机制复杂,多种因素均可以导致干眼病。美国眼科研究所干眼病研究小组将干眼病分为泪液生成不足型（包括Sj?gren’s综合症和非Sj?gren’s综合症泪液分泌不足）和泪液蒸发过强型。目前虽然有许多种干眼病模型,但是至今尚无一种动物模型可以准确模仿出该病频繁发生,逐渐恶化,机制复杂的特点。虽然干眼病诱发因素众多,机制复杂,但是该病发生的共同最终通路是泪膜不稳定,泪液中电解质浓度升高导致泪液渗透压升高。泪液的高渗透压是干眼病发病机制中的关键因素。研究表明,正常人泪液渗透压是302±9.7mOsm/L,干眼病患者泪液的渗透压是326.9±22.1mOsm/L。用316mOsm/L作为干眼病的诊断指标,其总体准确度优于其它任何一项干眼病诊断指标。本研究通过用高渗盐水给小鼠点眼,提高泪液的渗透压,制作泪液高渗透压性干眼病模型,观察是否可以引起和干眼病类似的体征和组织病理学损害,初步探讨泪液高渗透压在干眼病发病中的作用。方法1.动物的选择与分组6～8周龄雌性BALB/c小鼠60只,用随机数字表法分为空白组（20只）、对照组（20只）、实验组（20只）,双眼取用。对照组采用308mOsm/L氯化钠溶液点眼,每天5次,实验组采用500 mOsm/L氯化钠溶液点眼,每天5次,空白组不点眼。2. SchirmerⅠ实验在裂隙灯显微镜下,用显微镊夹住酚红棉线,置于BALB/c小鼠眼睛的外眦部,60秒后取出,测量酚红棉线湿润的长度。3.角膜荧光素染色和评分使用微量加液器在BALB/c小鼠下方结膜囊内滴入1μl 5%荧光素钠溶液,3分钟后在裂隙灯显微镜下采用钴蓝光检查并照相记录和评分。4.角膜虎红染色使用生理盐水浸湿的虎红试纸,将浸湿的部分轻轻接触BALB/c小鼠的角膜。在裂隙灯显微镜下照相和记录。5.泪液蕨类实验用毛细玻璃管采集BALB/c小鼠下穹隆部泪液,涂在洁净的玻片上,室温干燥,48小时内在光学显微镜下进行蕨类结晶图像分析,并照相记录。6.角膜上皮和结膜上皮的组织学观察采用HE染色在光镜下观察角膜上皮形态,用图像分析软件测量中央角膜上皮厚度。取上方穹窿部结膜,采用PAS染色在光镜下观察上方穹窿部结膜上皮的形态。计算每个高倍视野下结膜杯状细胞的数量。7.扫描电子显微镜观察在第42天,用扫描电子显微镜观察角膜上皮的形态。8.统计学方法采用Kruskal-Wallis H检验比较同一时间点三组BALB/c小鼠的角膜荧光素染色评分。采用Wilcoxon秩和检验比较同一组不同时间点角膜荧光素染色评分。采用完全随机设计资料的方差分析比较同一时间点三组的角膜上皮厚度、泪液分泌量、结膜杯状细胞数量。采用t检验比较同一组不同时间点的角膜上皮厚度,泪液分泌量,结膜杯状细胞数量。结果1. SchirmerⅠ实验第0天,空白组、对照组、实验组的酚红棉线浸湿长度未见统计学差异（P>0.05）。从第7天开始,实验组酚红棉线浸湿长度和第0天比较明显减少（P<0.01）。第7天酚红棉线浸湿长度较第0天下降了28%,第42天较第0天下降66%。2.角膜荧光素染色和评分第0天,空白组、实验组、对照组均有BALB/c小鼠角膜少许点状着色,角膜评分各组未见统计学差异（P>0.05）。实验组BALB/c小鼠随着实验的进行,角膜中央点状着色增加,逐渐出现片状着色,病变累及角膜各个象限,以角膜中央为重。从第7天起,实验组角膜荧光素染色评分和第0天相比明显升高（P<0.01）。实验组第7天角膜荧光素染色评分较第0天升高了75%。3.角膜虎红染色第0天,空白组、实验组、对照组均有3只BALB/c小鼠角膜虎红染色可见少量点状着色。实验组BALB/c小鼠从第7天开始,角膜点状着色逐渐增加,并且出现片状着色,累计角膜4个象限,以中央和鼻侧角膜为重。4.泪液蕨类实验在各个检查时间点,取空白组、对照组、实验组BALB/c小鼠泪液,在光学显微镜下进行泪液蕨类结晶图像分析。空白组、对照组在各个检查时间点均可观察到形态良好的蕨类物形成。实验组BALB/c小鼠泪液结晶中的蕨类物从第7天开始逐渐减少,蕨类物之间的连接中断。第28天以后显微镜下仅能观察到稀少的小蕨类物,甚至完全消失。5.角膜上皮HE染色的光镜观察和角膜上皮厚度测量空白组和对照组BALB/c小鼠角膜HE染色光镜观察可见上皮分层良好,分4～5层,基底部细胞排列呈柱状,靠近角膜表面逐渐变成鳞状上皮细胞。实验组BALB/c小鼠随实验进展基底层细胞部分缺失,上皮细胞分层紊乱,细胞层数减少,出现空泡。第0天和第7天,空白组、对照组、实验组BALB/c小鼠的角膜上皮层厚度未见统计学差异（P>0.05）。从第14天起,实验组较对照组和空白组角膜上皮层厚度明显减少（P <0.05）。6.结膜上皮PAS染色光镜观察和杯状细胞计数空白组和对照组BALB/c小鼠的结膜上皮细胞排列整齐,杯状细胞形态完整,分布在上皮细胞间,主要分布在穹隆部。实验组BALB/c小鼠随实验进展,上皮细胞排列紊乱,甚至出现缺失,杯状细胞形态不一致,数量减少。在第42天部分BALB/c小鼠上方穹隆部杯状细胞完全缺失。7.扫描电子显微镜观察在第42天,用扫描电子显微镜观察空白组、对照组、实验组BALB/c小鼠角膜上皮细胞。可见空白组和对照组上皮细胞形态呈多边形,细胞间紧密连接,细胞表面满布微绒毛。实验组BALB/c小鼠角膜表面微绒毛丢失,角膜表层上皮细胞破坏。结论1.用高渗盐水给BALB/c小鼠点眼可以在小鼠角膜和结膜引起与干眼病患者类似的体征和组织病理学变化。2.用高渗盐水给BALB/c小鼠点眼是一个简单的,可靠,重复性好的模型,这个模型可以运用于干眼病发病机制和药物治疗的研究。3.泪液高渗透压可能在干眼病发病机制中起重要作用。
王光进[8]（2010）在《鼠眼碱烧伤后羊膜移植对角膜缘干细胞增殖效应的研究》文中研究表明目的：制备SD大鼠眼碱烧伤动物模型,行羊膜移植术,观察P63、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在角膜缘处的表达,进一步了解羊膜对角膜缘干细胞（LSCs）增殖效应的影响。方法：健康SD大鼠40只40眼,实验组标本20只,20眼,行眼碱烧伤加羊膜移植术；对照组标本20只,20眼,单纯行眼碱烧伤；术后第1、2、3、4周分别取角膜缘组织进行固定、石蜡包埋、切片,采用免疫组化技术检测角膜缘组织中P63、PCNA的表达情况。结果：羊膜移植组角膜缘组织中P63、PCNA表达情况显着高于对照组,羊膜移植组和对照组相比较,有统计学意义（P<0.05）；羊膜移植术后1周、2周、3周和4周P63、PCNA蛋白在角膜缘干细胞的表达不一致。呈线性趋势,1周达到高峰,以后逐渐降低。结论：眼碱烧伤后行羊膜移植术,对角膜缘干细胞有明显的保护作用和并可促进干细胞的增殖表达。
庆惠玲[9]（2007）在《体外培养角膜缘上皮细胞重建眼表的实验研究》文中研究指明角膜感染、外伤、热及化学性烧伤、先天性异常、反复复发的翼状胬肉和肿瘤等疾病严重损伤眼表组织，造成视力下降，甚至致盲。角膜盲的患者在盲病人中占相当比例，由于眼表疾病以及角膜缘干细胞缺失所导致的角膜盲欠缺有效治疗手段，故对其治疗一直是步履蹒跚。粘膜或结膜移植眼表重建手术的临床效果较差，因为粘膜和结膜与角膜上皮表型不同而不能恢复眼表正常的形态与功能，最终导致新生血管化。同种异体板层角膜移植供体来源匮乏，冷冻保存的植片由于角膜缘干细胞的失活不能改善重建正常的眼表。随着对角膜缘干细胞在维持眼表中的重要作用的不断认识，角膜缘干细胞移植成为目前的研究热点。1998年12月美国科学家在《science》上报导，成功地在体外培养和扩增了人体胚胎干细胞，这一研究为利用干细胞治疗疾病提供了理论依据。一年之后，美国科学家发现小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞，这一发现陆续被世界各国科学家所证实。随着研究的深入，人们还发现人类的成体干细胞同样具有“横向分化”的功能，这也表明人类有望利用患者自身健康组织的干细胞，定向诱导分化成有功能的细胞用于治疗疾病。随着干细胞研究的深入，组织工程学也应运而生，组织工程技术的兴起为解决眼表重建的难题带来了希望。组织工程技术的基本方法是取少量自体健康角膜缘组织，体外培养扩增后种植于一种生物相容性良好的载体上，组成复合角膜上皮植片后移植到患侧眼表。其优点在于：取材量少、健眼损伤小、解决了供体来源问题、不存在免疫排斥反应。角膜缘干细胞经体外培养后其抗原性会有所降低，这就更有利于异体移植。因此，角膜缘干细胞培养后移植解决了干细胞来源不足的问题，对异体角膜缘干细胞的体外培养是目前研究的重点，是治疗眼表疾病最有前途的治疗方法。目前角膜缘干细胞理想的培养体系还处于探索研究阶段，正确获取培养用角膜缘组织是体外成功培养角膜缘干细胞的首要因素，但由于角膜缘干细胞缺乏明确的阳性标志，对其的研究一直在进行中。还有角膜缘干细胞体外培养时，细胞增殖、分化等过程的调节受许多因素制约，其中许多环节人们还知之甚少。如能在这些方面有所突破，有望产生巨大的社会效益和经济效益，并为数以十万计的角膜盲患者带来福音。基于上述，本实验研究利用组织工程学、细胞生物学和干细胞与干细胞工程学的基本原理与方法，试图在体外成功培养角膜缘干细胞、构建组织工程化角膜上皮，并将组织工程化角膜上皮移植于动物模型，以达到重建眼表、恢复角膜表面的光滑和透明，恢复眼表面较为正常的解剖结构和功能，为进一步组织工程化眼表重建奠定理论和实验基础。在本研究中应用体外组织培养方法，对兔角膜上皮前体细胞或角膜缘干细胞（祖细胞）存在的确切部位和生理特性、在完整羊膜和去上皮层羊膜为载体培养的生物学特性和以去上皮层羊膜为载体培养后自体及异体移植治疗全角膜缘干细胞缺损以及临床应用等情况进行了实验，主要方法和结果概括如下：一．应用体外组织培养方法，以兔角结膜分界线（Cornea-Conjuctiva Line CCL）为基准，分成8个定位区带，并分别以12点、3点、6点、9点为中心，取材进行体外培养。逐日观察细胞成膜状态，测量成膜面积并进行统计学分析。结果显示：1．角膜缘不同区域的上皮组织在细胞生长时间、成膜时间、成膜速率以及成膜类型方面具有明显差异（P＜0.01），角膜缘附近的角膜上皮细胞生长最快、出膜最早、膜状态最好。2．CCL内各区组培养后均无成纤维细胞出现；而CCL外各区组培养后可见成纤维细胞，距CCL线越远成纤维细胞数量越多。3．水平方位与垂直方位即12点位、6点位、3点位和9点位的角膜上皮前体细胞成膜形态与成膜规律的比较，发现二者不存在明显差异（p＞0.05）。4．角膜缘附近的角膜上皮细胞体外培养形成的膜都是完整、均质、透明的，当膜在其增长过程中，可将扩展范围内的成纤维细胞化解。提示：1．角膜缘不同定位区组织细胞形成膜的特性不同，含有干细胞的角膜缘附近的角膜上皮细胞生长最快、出膜最早、膜状态最好。2．角膜缘部栅栏组织的丰富程度与角膜上皮前体细胞的数量及功能未必存在一致关系。3．角膜缘干细胞形成的膜有保持其透明性及排它性的生理特性。4．进行角膜缘干细胞体外培养，从CCL附近取材较为适宜。二．对兔角巩膜缘不同定位区的角结膜上皮细胞进行体外组织培养，探讨了角膜缘干细胞的生理特性。结果显示：1．当角膜缘上皮细胞形成的膜片相互融合时，他们之间是兼容连接，最终形成的膜片之间无连接的痕迹。2．当角膜缘上皮细胞形成的膜片与结膜上皮细胞形成的成纤维细胞融合时出现相互竞争现象。3．角膜缘存在有角膜缘干细胞，角膜缘上皮细胞形成的膜有保持其透明性及排它性的生理表现。提示：1．角膜缘上皮细胞和结膜上皮细胞存在相互竞争机制，为角膜缘干细胞缺乏症引起的角膜结膜化提供了必要的实验基础。2．角膜缘存在有角膜缘干细胞，角膜缘干细胞对维持角膜的透明性和正常生理功能有重要意义。三．采用组织块培养法，将角膜缘及角膜中心组织块分别种植于完整羊膜和去上皮层羊膜上进行培养，观察并比较在完整羊膜、去上皮层羊膜为载体培养兔角膜上皮细胞的生物学特性。结果显示：1．角膜上皮细胞在去上皮层羊膜上培养成膜速率与成膜面积方面均快于在完整羊膜上培养，去上皮层羊膜更利于角膜上皮细胞的生长。2．角膜上皮细胞在完整羊膜上培养，当膜在其增长过程中，需将扩展范围内的羊膜上皮细胞推开，膜才能继续增长。提示：1．不同性质羊膜为载体对角膜上皮细胞的生物学特性有一定的影响，去上皮层羊膜更利于角膜上皮细胞的生长，可作为一个良好的载体用于移植。2．角膜上皮细胞具有排它性的生理特性，对维持角膜的透明性和正常生理功能有重要意义。四．制作兔眼（以右眼为实验眼）角膜缘干细胞完全缺损模型3个月，将实验动物随机分为两组即实验组和对照组。实验组取对侧眼角膜缘组织以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体制成组织工程角膜上皮，约培养后12天行角膜缘干细胞羊膜移植术；对照组行单纯羊膜移植术（仅将刮除上皮的羊膜），术后观察3个月。以角膜上皮染色，角膜浑浊和新生血管三项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果显示：1．体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增殖。2．自体角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS（+），而移植后角膜上皮细胞PAS（-）；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后角膜上皮为角膜上皮结构。提示：以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞可体外重建组织工程角膜上皮组织，自体角膜缘干细胞羊膜移植术可修复角膜缘干细胞缺损。五．制作兔眼角膜缘干细胞完全缺损3个月的模型，将实验动物随机分为两组即自体移植组和异体移植组。自体移植组取对侧眼角膜缘组织，异体移植组取健康的兔眼角膜缘组织，均以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，培养12天后行角膜缘干细胞羊膜移植术。术后观察3个月，以角膜上皮染色、角膜浑浊和新生血管三项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果显示：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增殖，体外培养12天可形成复层。自体移植组和部分异体移植组术后角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS（+），而移植后转为（-）；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后呈现角膜上皮结构。部分异体移植组术后出现了免疫排斥反应。提示：自体角膜缘干细胞羊膜移植术可重建眼表；免疫排斥反应仍是异体角膜缘干细胞羊膜移植术失败的主要原因。六．我们选择两例眼烧伤后重度睑球粘连患者，观察以去除上皮细胞的人羊膜基底膜为载体，，自体血清培养异体角膜缘上皮细胞后移植治疗眼烧伤后重度睑球粘连，术后观察结膜囊情况、眼球活动、角膜植片免疫排斥反应情况和转归情况。探讨以人自体血清、人羊膜为基底膜培养角膜缘上皮细胞后移植治疗眼烧伤后重度睑球粘连的眼表重建效果。结果显示：术后患者自觉症状轻，视力有所提高，角膜缘干细胞移植片紧密贴附，角膜上皮得到修复，浅层新生血管减少，睑球粘连得到松解。提示：自体血清培养异体角膜缘上皮细胞后移植是治疗眼烧伤后重度睑球粘连的有效方法。本研究通过体外培养角膜缘上皮细胞生理特性，进一步证实了角膜干细胞存在于角膜缘的观点，验证了角膜缘干细胞对维持角膜的透明性和正常生理功能有重要意义的说法。通过观察并比较在完整羊膜与去上皮细胞层羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞的生物学特性，表明去上皮细胞层羊膜可作为一个良好的载体用于移植。并以去上皮细胞羊膜作为载体，经培养后用于移植于全角膜缘干细胞缺损模型，可达到重建眼表。通过以去上皮细胞羊膜作为载体，人自体血清培养异体角膜缘上皮细胞后移植是治疗眼烧伤后重度睑球粘连的有效方法，避免了鼠源性3T3细胞饲养层和胎牛血清传播异种动物的风险，并降低了术后的免疫排斥反应，为眼表重建术提供另一研究新方向。
邓宏伟[10]（2002）在《防治高危角膜移植免疫排斥反应的研究》文中研究指明角膜移植是目前同种器官移植中成功率最高的一种组织移植手术，亦是眼科重要的一种复明手术。对眼部条件好的病例，术后第1年的排斥率仅为10％（Foulks，1996），但对于病情复杂的高危病人（high-risk patients）如：受体眼表新生血管化、持续炎症、结角膜化学伤、大植片移植、第二次移植等病人，虽通过HLA配型或局部和全身应用免疫抑制性药物等方法，术后角膜移植的存活率仍小于35％（Apel，1995）。如何提高有高危因素眼的角膜移植术后存活率已成为目前临床亟待解决的问题。 雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.,TWHf）有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤和抗菌作用。但由于其全身应用对造血系统、心、肝、肾及生殖系统有一定的毒副作用，因此，阻碍了其广泛的临床应用。 本研究旨在研制出新型的雷公藤多甙滴眼液应用于防治角膜移植排斥反应，并通过术后联合新型的雷公藤多甙滴眼液以及局部免疫抑制剂与局部抗新生血管制剂，以期在临床上降低高危角膜移植术后免疫排斥反应的发生率或在实验中延长免疫排斥反应的发生时间。并同时通过体外混合淋巴细胞培养，研究角膜缘干细胞在角膜移植排斥反应发生中的作用机制，以期从理论上进一步阐明角膜缘干细胞的作用。 暨南人学博卜学位论义（2002）队治扁危闲膜移柏兔疫排斥反)巾的研究（中义摘要） 第一部分 雷公藤多汛及雷公藤内酯醇滴眼液在兔眼前房的药代动 J学U究 目的 研制出雷公膝多贰 （”11）淌眼液以及雷公藤内酯醇（T10）滴眼液， 并用高效液相色谱仪法对两种滴眼液进／、眼房水中的药代动力学参数进行研究。 方法 将0刀3％Tll滴眼液或1叶驴11！TI。滴眼液50…滴入兔眼下睑结膜囊 内，在仙中定时采驭房水做为测试仟本，纤处理后，川；为效液相色谱仪测定样本 中的雷公藤内酯醇质量浓度。 结果Tll、TIO滴眼液在新西兰白兔眼房水中为一室模型，T＊滴眼液的主要药 代动力学参数为：A＝2．703gb； Kd．047h一’二 ho厂08 11一’；L＊gti＊＊一0．456h二 ti／2（k。）一0．256h；ti／2（kC）＝0．339h； T（111。X）＝0．880h； C（m。）＝0．278Ug／llll；AUC＝0．323 fig”h’il－‘。其拟合的动力学万程为C（t）＝178 123 XDOSeX（e－‘047。（t·0456）e·2·708x （’”＊％）厂 T；。滴眼液主要药代动力学参数为：A－2．23 u旮ml；Ke－2刀lh‘’； ＊肝2．80卜‘Z L＊g ＊＊＊二0．43hh／2b）二0二sh；1；／。k)一0．34卜；v一)二0．85卜； C（ma－c）＝0．27卜驴川；AUC一0．31u g·h·n。lJ。其拟合的利力学万程为＊)＝44石2 X DOSC X（C－‘””（‘－’“）e－”‘“（‘－’“’）） 结论 卜滴眼液在眼房水内仑伽＠从Itr出现在点药后0．8811，而飞 滴眼液 出现在点药后 0．85h，两种滴眼液均在 411基本被代谢消除。 第二部分雷公藤多贰滴眼液对离休和在体角膜上皮刺激性和毒性的 研究 目的 了解雷公藤多贰滴眼液局部使用的安全浓度。 方法 分别用 10只 WIStar大鼠、新西兰白兔，滴用不同浓度雷公藤多贰滴 眼液，按照眼部刺激反应评分标准，在休评价各种浓度滴眼液的刺激性，并行角 膜荧光素钠染色，继后取角膜行常规病理切片，HE染色。均与未滴眼组相比。 对正常人眼（实验研究者自身）滴以上动物实验确定的低毒性浓度的雷公藤多贰 2 褂南人’Hd)卜J价论义（2《）02 ) 队治．九危川仰柑川见疫排斤反＊的研究（中义摘茨） 滴眼液 100ill，3次后，感受眼部有七刺激症状，观察限部刺激反应，并进行角膜 荧光染色，观察角膜上皮是否有首色。通过对兔角膜上皮体外培养，并应用0．4％ 台盼蓝染色，在显微镜下观察死广细胞数的方法，研究滴眼液对离体兔角膜上皮 的毒性。 结果200［ig／nil山冷n。l浓)吐组，以及空白对照叁局部应用眼刺激反应的 评分为 l～3分；450叱／Illl浓度组为 4～12分；600卜g／1ill浓度组为 12～16分。 200pg／Inl、300pg／ml浓度组，以及个白对贝组局部应川 1)hfijj未滴眼组相＊， 大鼠和兔角膜上皮荧光染色，角膜上皮着色以及HE染O均未见有显着差异，而 在450us／nl． 600＂g／ml浓度组角膜【i皮则出现损伤。300fig／Inl雷公藤多贰滴眼液 对在体人眼无?
二、人眼角膜缘干细胞病理学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人眼角膜缘干细胞病理学研究（论文提纲范文）
（1）羊膜对角膜损伤的治疗作用及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源 |
| 1.2 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.3 羊膜的特性 |
| 1.3.1 羊膜的组织学特性 |
| 1.3.2 羊膜的免疫学特性 |
| 1.3.3 羊膜的生物学特性 |
| 1.4 羊膜的研究现状及进展 |
| 1.4.1 羊膜的历史应用 |
| 1.4.2 羊膜的基础研究 |
| 1.5 羊膜在眼科的应用及研究进展 |
| 1.5.1 修复角膜上皮缺损 |
| 1.5.2 修复结膜上皮缺损及异常增生 |
| 1.5.3 治疗角巩膜溃疡及穿孔 |
| 1.5.4 角膜移植的辅助性治疗 |
| 1.5.5 眼部复杂化学烧伤的治疗 |
| 1.5.6 青光眼手术中的应用 |
| 1.5.7 屈光手术中的应用 |
| 1.5.8 其他眼病的治疗 |
| 1.6 羊膜在组织工程学中的应用 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第2章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 羊膜植片的筛选 |
| 2.1.2 实验动物的筛选 |
| 2.1.3 临床治疗病人筛选 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 手术器械 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 羊膜植片的制备及保存 |
| 2.2.2 羊膜匀浆的制备及保存 |
| 2.2.3 羊膜匀浆蛋白含量测定及实验溶液制备 |
| 2.2.4 病理标本的取材制备 |
| 2.2.5 羊膜上皮细胞原代及传代培养 |
| 2.2.6 羊膜上皮细胞的检测 |
| 2.2.7 角膜上皮细胞原代培养 |
| 2.2.8 羊膜上皮细胞与角膜上皮细胞共同培养 |
| 2.2.9 诱导后羊膜上皮细胞检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 羊膜移植治疗兔角膜损伤的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验分组及动物模型的建立 |
| 3.2.1 实验分组 |
| 3.2.2 角膜损伤模型的建立 |
| 3.3 手术方式及观察指标 |
| 3.4 羊膜移植对兔角膜损伤愈合作用的比较分析 |
| 3.4.1 眼部炎症反应的比较分析 |
| 3.4.2 角膜上皮愈合时间的比较分析 |
| 3.5 羊膜移植术后显微形态学观察比较 |
| 3.5.1 光学显微镜观察比较 |
| 3.5.2 透射电镜观察比较 |
| 3.6 羊膜移植对角膜伤口愈合的影响 |
| 3.6.1 角膜伤口的愈合方式 |
| 3.6.2 生长因子、胶原纤维对角膜伤口愈合的影响 |
| 3.6.3 羊膜的作用及作用机理 |
| 3.6.4 实验结果及机理分析 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 羊膜移植治疗人眼表疾病的临床研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 临床资料与手术方式 |
| 4.2.1 临床资料 |
| 4.2.2 羊膜植片的取材 |
| 4.2.3 手术方式 |
| 4.2.4 术后处理 |
| 4.3 临床愈后 |
| 4.4 典型病例报告 |
| 4.4.1 病例 1 |
| 4.4.2 病例 7 |
| 4.4.3 病例 19 |
| 4.5 羊膜移植的临床治疗作用及机理分析 |
| 4.5.1 临床愈后机理分析 |
| 4.5.2 手术适应症及手术方式的选择 |
| 4.5.3 术后并发症的预防和处理 |
| 4.5.4 影响愈后的相关因素分析 |
| 4.5.5 羊膜移植术临床应用的限制和不足 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 羊膜匀浆液治疗兔角膜损伤的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 羊膜匀浆液对兔角膜上皮细胞增殖作用的研究 |
| 5.2.1 实验分组及动物模型制备 |
| 5.2.2 角膜裸区面积的观察测量及细胞增殖率测定 |
| 5.2.3 各组生长速度的比较 |
| 5.3 羊膜匀浆液与羊膜移植对兔角膜损伤修复作用的比较研究 |
| 5.3.1 实验分组及动物模型制备 |
| 5.3.2 角膜裸区面积的观察测量及细胞增殖率测定 |
| 5.3.3 各组生长速度的比较 |
| 5.4 羊膜匀浆液的作用机理及应用前景分析 |
| 5.4.1 羊膜匀浆液的作用及作用机理 |
| 5.4.2 实验结果及机理分析 |
| 5.4.3 羊膜匀浆液在眼科疾病中的应用 |
| 5.4.4 羊膜匀浆液的应用优势及前景 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 羊膜上皮细胞体外培养及诱导分化研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 羊膜和角膜上皮细胞培养的形态变化及鉴定 |
| 6.2.1 羊膜上皮细胞形态变化 |
| 6.2.2 羊膜上皮细胞的鉴定 |
| 6.2.3 角膜上皮细胞的形态变化 |
| 6.2.4 角膜细胞诱导的羊膜上皮细胞形态变化及鉴定 |
| 6.3 羊膜和角膜上皮细胞培养的相关因素分析 |
| 6.3.1 实验材料选择相关性分析 |
| 6.3.2 羊膜上皮细胞的培养分析 |
| 6.3.3 羊膜上皮细胞的鉴定分析 |
| 6.3.4 角膜上皮细胞的培养分析 |
| 6.3.5 羊膜上皮细胞的诱导分化分析 |
| 6.3.6 本章实验的不足 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）皮下培植兔角膜缘干细胞联合新鲜羊膜移植治疗兔眼角膜缘干细胞缺乏性功能障碍的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章情况 |
| 致谢 |
（3）眼表重建手术后早期供体干细胞的存活状态及其影响因素研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 碱烧伤致角膜缘干细胞缺乏模型的建立及稳定期眼表炎症微环境的检测 |
| 前言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验耗材 |
| 1.1.4 实验试剂的配制 |
| 1.1.5 引物序列 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.1.7 统计学分析方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 碱烧伤后兔角膜的临床表现 |
| 1.2.3 角膜缘干细胞缺乏模型角膜组织病理学及免疫组织化学检测结果 |
| 1.2.4 角膜缘干细胞缺乏模型RT-PCR结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 体外培养的供体细胞在角膜缘干细胞缺乏眼表上的存活状态和相关影响因素研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.1.6 实验方法 |
| 2.1.7 统计学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 以羊膜为载体体外培养的人角膜缘上皮细胞的生长情况 |
| 2.2.2 手术效果的临床评价 |
| 2.2.3 手术后供体细胞的存活状态 |
| 2.2.4 手术后受体角膜中干细胞相关因子的表达情况 |
| 2.2.5 手术后眼表微环境中炎症因子的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 体外培养的角膜缘上皮干细胞疗法的争议和挑战 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）人羊膜间充质干细胞移植对兔角膜碱烧伤的疗效及磁标记示踪分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一部分：羊膜间充质干细胞的分离、纯化和鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 6 附图 |
| 第二部分：羊膜间充质干细胞的标记方法 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 6 附图 |
| 第三部分： 羊膜间充质干细胞移植对重度兔角膜碱烧伤的疗效及示踪分析 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 6 附图 |
| 第四部分： 兔角膜碱烧伤后泪液乳铁蛋白的表达 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 参考文献 |
| 6 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）一种新的干眼病模型—高渗盐水点眼小鼠干眼病模型的建立与评估（论文提纲范文）
| 英文缩写词一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 一种新的干眼病模型－高渗盐水点眼小鼠干眼病模型的建立与评估 |
| 前言 |
| 第一部分 高渗盐水点眼小鼠干眼病模型的建立及体征的评估 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 高渗盐水点眼小鼠干眼病模型的病理组织学观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 角膜缘干细胞：眼表疾病治疗的新方向？ |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文 |
（8）鼠眼碱烧伤后羊膜移植对角膜缘干细胞增殖效应的研究（论文提纲范文）
| 1 鼠眼碱烧伤后羊膜移植对角膜缘干细胞增殖效应的研究 |
| 1.1 中文摘要 |
| 1.2 英文摘要 |
| 1.3 前言 |
| 1.4 材料与方法 |
| 1.5 结果 |
| 1.6 讨论 |
| 1.7 结论 |
| 1.8 参考文献 |
| 1.9 英汉缩略词对照表 |
| 2 致谢 |
| 3 眼表化学烧伤的早期治疗研究进展(综述) |
（9）体外培养角膜缘上皮细胞重建眼表的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一角膜缘干细胞的研究 |
| 二.干细胞在治疗其他疾病的重要研究 |
| 三.问题和展望 |
| 第一部分 角膜上皮前体细胞在角膜缘的定位研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 体外培养角膜缘上皮细胞生理特性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 比较不同性质羊膜为载体培养角膜上皮细胞的生物学特性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 组织工程角膜上皮自体移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第五部分 细胞培养后自体及异体移植治疗角膜缘干细胞缺损的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第六部分 自体血清培养异体角膜缘上皮细胞后移植治疗眼烧伤后重度睑球粘连的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 后记 |
| 致谢 |
（10）防治高危角膜移植免疫排斥反应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 雷公藤多甙及雷公藤内酯醇滴眼液在兔眼前房的药代动力学研究 |
| 第二部分 雷公藤多甙滴眼液对离体和在体角膜上皮刺激性和毒性的研究 |
| 第三部分 雷公藤多甙滴眼液保存时间及微生物学的研究 |
| 第四部分 表面应用T_（11）、T10、FK506、CsA和Ocufen~（?）滴眼液防治大鼠角膜移植免疫排斥反应的实验研究 |
| 第五部分 建立兔眼高危角膜移植模型 |
| 第六部分 表面应用雷公藤滴眼液、CsA和Ocufen防治兔高危角膜移植免疫排斥反应的实验研究 |
| 第七部分 角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞活化和增殖作用的实验研究 |
| 第八部分 雷公藤多甙滴眼液在高危角膜移植的初步临床应用 |
| 总结 |
| 附录1： 英汉缩写名词对照 |
| 附录2： 在学习期间完成的论文和获奖情况 |
| 致谢 |
四、人眼角膜缘干细胞病理学研究（论文参考文献）
- [1]羊膜对角膜损伤的治疗作用及其机理研究[D]. 郭庆. 哈尔滨工业大学, 2017(01)
- [2]皮下培植兔角膜缘干细胞联合新鲜羊膜移植治疗兔眼角膜缘干细胞缺乏性功能障碍的研究[D]. 冯萧萧. 昆明医科大学, 2014(01)
- [3]眼表重建手术后早期供体干细胞的存活状态及其影响因素研究[D]. 程钧. 青岛大学, 2013(10)
- [4]人羊膜间充质干细胞移植对兔角膜碱烧伤的疗效及磁标记示踪分析[D]. 李燕伟. 郑州大学, 2013(10)
- [5]中国实用眼科杂志2012年第30卷主题词索引[J]. 中国医科大学医学信息学系. 中国实用眼科杂志, 2012(12)
- [6]中国实用眼科杂志2010年第28卷主题词索引[J]. 侯跃芳. 中国实用眼科杂志, 2010(12)
- [7]一种新的干眼病模型—高渗盐水点眼小鼠干眼病模型的建立与评估[D]. 李晶. 第三军医大学, 2010(04)
- [8]鼠眼碱烧伤后羊膜移植对角膜缘干细胞增殖效应的研究[D]. 王光进. 泸州医学院, 2010(04)
- [9]体外培养角膜缘上皮细胞重建眼表的实验研究[D]. 庆惠玲. 郑州大学, 2007(06)
- [10]防治高危角膜移植免疫排斥反应的研究[D]. 邓宏伟. 暨南大学, 2002(02)