一、抗HPV16E6核酶增加宫颈癌CaSKi细胞对顺铂敏感性的研究（论文文献综述）
饶智国,高建飞,章必成,杨波,张积仁[1]（2011）在《抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性影响和机制的探讨》文中研究指明目的:研究抗HPV16E6核酶（Ri-bozyme）对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性的影响和机制。方法:将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSki细胞,命名为CaSki-R、CaSki-P细胞。Northern blot、MTT比色法、Annexine/PI双标法、流式细胞术及RT-PCR扩增法分别检测E6基因、顺铂的敏感性、凋亡率、凋亡相关蛋白和基因。结果:CaSki-R表达E6较CaSki-P、CaSki明显降低;与CaSki细胞和CaSki-P细胞比较,CaSki-R对DDP敏感性分别增加了2.28倍和2.21倍。CaSki、CaSki-P和CaSki-R 3种细胞的凋亡率分别为（18.9±3.5）%、（19.7±4.8）%和（40.4±4.5）%,CaSki-R较CaSki细胞的凋亡率明显增加,P=0.003;DDP作用后CaSki-R细胞的p53蛋白（P=0.000）和Bax蛋白（P=0.002）表达较CaSK细胞明显增加,Bcl-2蛋白（P=0.005）、c-myc蛋白（P=0.005）表达则明显减小;与CaSK细胞比较,CaSki-R细胞表达p53、Bax mRNA明显增加,Bcl-2、c-myc mRNA表达明显减少。结论:转染抗HPV16E6-Ri-bozyme的CaSki-R细胞对顺铂的敏感性明显增加,p53、Bax蛋白表达增加,Bcl-2和c-myc蛋白表达减少可能与CaSki-R细胞对顺铂的敏感性增加有关。
饶智国,高建飞,章必成,张积仁[2]（2011）在《特异性核酶增强宫颈癌细胞对多种化疗药物的敏感度研究》文中进行了进一步梳理目的研究抗HPV16E6核酶（Ribozyme）在宫颈癌CaSKi细胞对多种化疗药物在体内外敏感度的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P细胞。MTT敏感实验检测多种化疗药物对三种细胞的抑制率;建立三种宫颈癌细胞移植瘤裸鼠模型,检测顺铂（DDP）对其抑制作用;透射电镜观察顺铂作用后的三种细胞形态。结果与CaSKi-P、CaSKi细胞比较,DDP、VCR、5-Fu、MMC对CaSKi-R细胞的抑制率明显增加（P<0.05）,CaSKi-R细胞对DDP、VCR、5-Fu、MMC的敏感度明显增加;ADM、MTX、INF、Taxol、Ara-C、CTX对CaSKi-R细胞的抑制率无明显变化（P>0.05）,敏感度无明显变化;顺铂作用后CaSKi-R、CaS-Ki-P和CaSKi细胞裸鼠移植瘤的重量分别为（0.09±0.03）g、（0.26±0.07）g和（0.26±0.05）g（P<0.05）,抑制率分别为81.63%、62.32%和63.38%;顺铂作用后CaSKi-R细胞出现明显的凋亡改变,而CaSKi、CaSKi-P细胞不明显。结论抗HPV16E6-Ribozyme增加了CaSKi细胞对DDP、VCR、5-Fu、MMC的敏感度,抑制了宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长并增加对DDP的敏感度。
宋晖,辛晓燕,赵海波,王德堂,张建芳[3]（2010）在《survivin基因RNA干涉对宫颈癌裸鼠移植瘤生长及凋亡和顺铂化疗敏感性的影响》文中指出目的观察survivin基因RNAi对宫颈癌裸鼠移植瘤生长、凋亡和化疗敏感性的影响。方法随机选择雌性BALB/C-nu/nu裸小鼠24只,细胞接种法建立4组人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,每天观察裸鼠一般状况及肿瘤生长情况,通过绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤生长抑制率,观察survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响;通过免疫组化SP法检测各组移植瘤组织中survivin蛋白表达情况,TUNEL染色观察survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤凋亡的影响;当肿瘤体积达0.2cm3时给予顺铂化疗以观察survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤化疗敏感性的影响。结果成功建立4组人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤体积在每个检测点均明显小于接种HeLa组;观察结束时,接种HeLa-s2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:（0.369±0.043）g和（1.150±0.136）g（P<0.05）;接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤生长抑制率为67.9%。免疫组化结果显示:接种HeLa-s2组裸鼠survivin蛋白表达显着下降;TUNEL染色结果显示:接种HeLa-s2组裸鼠细胞凋亡明显增多,凋亡指数（AI）值达（22.73±1.37）%。顺铂化疗后不同检测点接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-s2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:（0.323±0.058）g和（1.347±0.173）g（P<0.05）;接种HeLa-s2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为:（37.38±1.01）%和（5.19±0.61）%（P<0.05）。结论 survivin基因RNAi可通过下调移植瘤组织survivin蛋白表达抑制移植瘤生长并促进其凋亡,并通过增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤对顺铂化疗的敏感性。
吴圆圆,陈莉[4]（2010）在《靶向HPV的siRNAs技术治疗宫颈癌研究的现状与挑战》文中指出小干扰RNA（small interfering RNAs,siRNAs）是近年来靶向治疗人类乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）的分子生物学研究热点。该技术在抗HPV的靶向性研究中具有高特异性、放大效应、作用稳定、并可遗传等特征,为宫颈癌防治中抗HPV基因治疗提供了新途径。但siRNAs技术研发的核酸药物应用于临床仍面临者许多挑战和尚未解决的问题。今后抗HPV治疗的发展方向和研究重点仍将是采用siRNA技术在HPV相应位点阻断病毒复制,联合抗病毒的全身免疫调节的综合治疗以提高疗效。
葛翠翠[5]（2009）在《逆转录病毒介导的HPV16E6-siRNA对SiHa细胞的影响》文中指出目的探讨逆转录病毒介导的靶向人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16 E6基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）（即HPV16 E6-siRNA）对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的影响。方法1、收集产逆转录病毒PA317细胞的病毒上清液感染靶细胞SiHa,G418筛选获得HPV16 E6基因稳定沉默的细胞克隆（SiHa/16E6）,同时设立载体对照（SiHa/pSUPER）和正常细胞对照（SiHa）;2、RT-PCR检测HPV16 E6和E7 mRNA的水平;3、Western印迹法检测p53、Rb、caspase 3和PARP蛋白的表达;4、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞的增殖活性及细胞对顺铂的敏感性。结果与SiHa细胞对照组相比,感染后各时间点E6和E7 mRNA表达水平均有所下降,p53和Rb蛋白表达水平增高,caspase-3和PARP剪切后的活性条带增加;感染后40d细胞的增殖活性下降;在同一药物浓度下,感染后20d细胞存活率显着降低,顺铂的IC50值为3.92±2.48μg/ml。而SiHa/pSUPER组与SiHa细胞对照组相比,差异无统计学意义。结论逆转录病毒介导的HPV16 E6-siRNA可有效沉默SiHa细胞E6和E7基因的表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡并提高细胞对顺铂的敏感性。
宋晖[6]（2007）在《Survivin基因RNAi对宫颈癌凋亡及放、化疗敏感性影响的实验研究》文中研究表明细胞增殖与凋亡失衡是肿瘤形成和发展的一个重要机制,而肿瘤细胞的凋亡受阻也是导致其疗效减低的重要原因。细胞凋亡的调控机制非常复杂,涉及多种调节因子和多条反应途径。凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族就是一类重要的抗细胞凋亡因子,该家族结构的共同特点是N端含有一个或多个串联的杆状病毒IAP重复序列（baculovirus IAP repeat, BIR）,C端含或不含有一个环指（RING finger）结构。Survivin是新近发现的IAP家族中的一个重要成员,它不仅具有强大的抗细胞凋亡功能,而且在人类多种恶性肿瘤中均存在高表达。近年来的研究表明survivin与包括宫颈癌在内的多种人类恶性肿瘤的形成、发展及预后有着密切关系,其表达异常升高可能是导致肿瘤放疗抵抗和化疗耐药的重要原因。RNAi（RNA interference）技术是双链RNA（double strand RNA,dsRNA）介导的序列特异性的转录后基因沉默,广泛存在于高等植物和动物中,其机制是细胞内的dsRNA被Dicer（一种RNA酶Ⅲ）剪切成双链的小分子干涉RNA （small interfering RNA,siRNA）与RNA诱导的基因沉默复合物结合,降解与之互补的靶mRNA,特异性抑制靶基因表达。自1998年研究者们发现dsRNA能引起特异性基因沉默以来,RNAi技术因其简便易行并且具有特异性和高效性,很快成为研究基因功能和基因表达调控的重要方法。宫颈癌是妇科高发恶性肿瘤,虽然我国对宫颈癌的防治已取得很大成效,但近年来随着人乳头状瘤病毒（HPV）感染率的上升和社会生活的变化,宫颈癌的发病率呈有增高趋势,近20年来发病明显趋于年轻化,且宫颈腺癌比例增加。因为腺癌易早期发生淋巴结转移,对放疗的敏感性较差,对化疗容易产生耐药,因此治疗难度加大,预后不理想。因而寻找一种科学、可行的途径来增强放、化疗疗效,改善预后成为宫颈癌治疗领域研究的热点问题。研究目的观察survivin基因表达下调对宫颈癌凋亡和放、化疗敏感性的影响,并通过寻找其可能作用途径,探讨survivin基因RNAi对宫颈癌放、化疗增敏的可行性,为以survivin为靶基因治疗宫颈癌提供理论依据。研究方法本研究主要分以下三个部分:①Survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌HeLa细胞survivin表达的影响。根据survivin基因编码序列及RNAi寡核苷酸设计原则,设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物（S1-1,2、S2-1,2）,退火连接后利用DNA重组技术将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后经脂质体转染宫颈癌细胞系HeLa,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达,筛选干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体和稳定转染细胞系进行后续实验。②Survivin基因RNAi对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡及放、化疗敏感性的影响。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期变化,流式细胞仪、Hoechst染色观察细胞凋亡情况,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3（caspase-3）活性变化,免疫荧光检测Ku70蛋白表达变化。平板克隆形成实验、多靶单击模型拟合细胞存活曲线观察细胞放疗敏感性变化;流式细胞仪、MTT比色法检测2GyX线照射24h、48h和72h后细胞凋亡和生长抑制情况。MTT比色法检测细胞存活率并计算顺铂作用72小时的50%抑制浓度（IC50）;流式细胞仪、MTT比色法检测5ug/ml顺铂作用后24h、48h和72h后细胞凋亡和生长抑制情况。③Survivin基因RNAi对宫颈癌HeLa细胞裸鼠成瘤、移植瘤生长及其放、化疗敏感性的影响。直接细胞悬液接种法建立HeLa-S2、HeLa-NC、HeLa-U6 neo和HeLa 4种细胞的宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察成瘤情况,比较4种细胞的成瘤能力。定期测量移植瘤体积并绘制生长曲线,处死后称取移植瘤瘤重,观察survivin基因RNAi对移植瘤的生长抑制。免疫组化SP法检测各组移植瘤survivin蛋白表达情况。免疫组化SP法检测FⅧRag表达情况,并计算微血管密度（microvessel density,MVD）。HE染色、TUNEL染色检测各组移植瘤细胞凋亡情况,并计算凋亡指数（apoptotic index,AI）。通过定期测量移植瘤体积并绘制生长曲线,处死后称取移植瘤瘤重,TUNEL染色检测移植瘤细胞凋亡情况,观察survivin基因RNAi对移植瘤X线放射治疗敏感性和顺铂化疗敏感性的影响。研究结果①成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-S1和pSilencer2.1-S2;建立了4组稳定转染细胞系:HeLa-S1、HeLa-S2、HeLa-NC和HeLa-U6 neo。②转染pSilencer2.1-S1和pSilencer2.1-S2的HeLa细胞中survivin mRNA和蛋白表达均呈现不同程度下调,pSilencer2.1-S2的干涉效果较好,其稳定转染细胞系HeLa-S2 survivin mRNA和蛋白表达明显下降,表达抑制率分别为:62.8%和60.1%。③HeLa-S2细胞增殖受到抑制,各检测点A值显着下降（P<0.05）;细胞周期发生显着变化,细胞被阻滞于G0/G1期,占（72.7±3.1）%,G2/M期明显减少,占（5.1±2.9）%;细胞凋亡率为:（19.2±1.4）%,明显升高。④HeLa-S2 caspase-3激酶活性增强,A405达1.26±0.04;Ku70蛋白表达明显下降。⑤各组细胞克隆形成率随X线照射剂量升高而下降;同一剂量照射下,HeLa-S2克隆形成率显着降低,细胞存活曲线显示:HeLa-S2 D0、Dq值显着下降,分别为:3.15、1.21,其放射增敏比分别为:2.01（D0值比）、1.77（Dq值比）;2Gy X线照射后细胞凋亡率和生长抑制率随时间延长显着增加,各检测点HeLa-S2细胞凋亡率和生长抑制率明显高于未转染HeLa细胞。⑥各组细胞存活率随顺铂药物浓度升高而下降;在同一药物浓度下,细胞存活率明显下降,顺铂作用72小时的IC50值为（0.74±0.02）ug/ml;5ug/ml顺铂作用后细胞凋亡率和生长抑制率随时间延长显着增加,各检测点HeLa-S2细胞凋亡率和生长抑制率明显高于未转染HeLa细胞。⑦成功建立4组人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,接种HeLa-S2组裸鼠成瘤较晚,且肿瘤生长缓慢,其平均成瘤时间为（21.33±0.51）天,与接种HeLa组裸鼠[（7.22±0.37）天]相比差异显着（P<0.05）。⑧接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积在每个检测点均明显小于接种HeLa组;观察结束时,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:（0.369±0.043）g和（1.150±0.136）g（P<0.05）接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤生长抑制率为:67.9%。⑨免疫组化结果显示:接种HeLa-S2组裸鼠survivin蛋白表达显着下降;接种HeLa-S2组裸鼠FⅧRag表达亦显着下降,MVD值降至23.38±3.14。HE染色、TUNEL染色结果显示:接种HeLa-S2组裸鼠细胞凋亡明显增多,AI值达（22.73±1.37）%。⑩X线放疗后不同检测点接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:（ 0.407±0.056 ） g和（1.381±0.289）g（P<0.05）;接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为:（30.06±0.98）%和（4.17±0.64）%（P<0.05）。（11）顺铂化疗后不同检测点接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤体积明显小于接种HeLa组,肿瘤生长明显受抑;观察结束后,接种HeLa-S2组裸鼠瘤重明显小于接种HeLa组,分别为:（ 0.323±0.058 ） g和（1.347±0.173）g（P<0.05）;接种HeLa-S2组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多,与接种HeLa组AI比较,接种HeLa-S2组AI明显升高,分别为:（37.38±1.01）%和（5.19±0.61）%（P<0.05）。结论①Survivin基因RNAi可成功阻抑人宫颈癌HeLa细胞中survivin mRNA和蛋白表达。②Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。③Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,调节细胞周期分布,使细胞阻滞于G1期,并下调Ku70蛋白表达水平,降低DNA损伤修复能力,进而显着提高细胞对X线放射治疗的敏感性。④Survivin基因RNAi可增加X线照射诱导的细胞凋亡,增强放射治疗对细胞的生长抑制。⑤Survivin基因RNAi可通过下调HeLa细胞中survivin表达,增强caspase-3激酶活性,诱导细胞凋亡,并显着提高细胞对顺铂化疗的敏感性。⑥Survivin基因RNAi可增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对细胞的生长抑制。⑦Survivin基因RNAi可通过抑制HeLa细胞增殖降低其成瘤能力。⑧Survivin基因RNAi可通过下调移植瘤组织survivin蛋白表达降低其MVD,从而抑制移植瘤生长并促进其凋亡。⑨Survivin基因RNAi可增加X线放射治疗诱导的细胞凋亡,增强放射治疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤的放疗敏感性。。⑩Survivin基因RNAi可增加顺铂化疗诱导的细胞凋亡,增强顺铂化疗对移植瘤的生长抑制,进而提高移植瘤的化疗敏感性。
石华[7]（2007）在《人白介素24基因治疗宫颈癌CaSki细胞株的实验研究》文中认为子宫颈癌（cervical cancer, CC）是危害广大妇女健康最常见的恶性肿瘤之一,我国每年新发病例有13.5万,近年来发现,年轻妇女中宫颈癌的发病率呈明显上升的趋势,发病以每年2%3%的速度增长。宫颈癌越来越引起人们广泛的关注。近年来,随着医学分子生物学理论和技术的发展以及对宫颈癌发病机制认识的不断深入,尤其是DNA重组技术和基因转移技术逐步成熟,研究者们提出了利用基因转移技术向体内导入目的基因,从而对宫颈癌发病的分子环节进行干预的防治策略,为宫颈癌的治疗开辟了新途径。本研究拟以人白介素24（hIL-24）和HPV E6 siRNA作为分子工具,采用真核表达载体为基因导入工具对人宫颈癌中具有代表性的CaSki细胞株进行基因治疗的实验研究,主要探讨外源性hIL-24的表达对治疗宫颈癌CaSki细胞所发挥的作用及其内在机制,以及联合RNAi技术是否具有协同效应。以期为宫颈癌基因治疗的进一步深入研究奠定必要的实验基础。研究方法:1. hIL-24基因的克隆鉴定,构建真核表达载体及表达鉴定。培养CaSki细胞,提取其RNA作为模板,采用RT-PCR方法扩增hIL-24基因全部编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上进行测序分析。将测序正确的重组质粒转染入体外培养的CaSki细胞中进行表达。Western blot鉴定是否成功表达hIL-24蛋白。2. hIL-24基因诱导人宫颈癌CaSki细胞凋亡的实验。①以脂质体包裹重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）-hIL-24转染CaSki细胞。②利用RT-PCR技术检测处理后CaSki细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化。③Western blot分析处理后CaSki细胞中抑癌蛋白P53水平的变化。④处理后的CaSki细胞凋亡检测:透射电镜观察,流式细胞仪分析,TUNEL实验,hochest 33342荧光染色。3.细胞体外迁移、侵袭实验。①采用细胞体外迁移、侵袭实验检测pcDNA3.1（+）-hIL-24处理后CaSki细胞迁移、侵袭能力的改变。②Western blot检测与细胞迁移、侵袭能力有关的E-cadherin, MMP-2和p38 MAPK蛋白水平。4. HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因联合诱导人宫颈癌CaSki细胞的凋亡。①携带HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因的质粒载体分别以单独或联合的方式转染人宫颈癌CaSki细胞,处理后利用RT-PCR技术检测细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化。②Western blot分析细胞中抑癌蛋白P53水平的变化。③流式细胞仪分析细胞凋亡情况。5.动物实验。①筛选稳定转染pcDNA3.1（+）-hIL-24质粒的CaSki细胞株,注射裸鼠,观察细胞在裸鼠皮下的成瘤情况,定期测量肿瘤的体积大小,处死裸鼠,称瘤重,计算肿瘤抑制率。②建立荷瘤裸鼠模型,于瘤体内注射脂质体包裹的pcDNA3.1（+）-hIL-24质粒,定期测量肿瘤的体积大小,处死裸鼠,称瘤重,计算肿瘤抑制率。观察肿瘤组织的病理改变。实验结果:1.①分别以人宫颈癌CaSki和Hela细胞总RNA为模板,经RT-PCR,琼脂糖凝胶电泳发现只有CaSki细胞扩增出一条特异性条带,长度大约为650 bp,与预期大小一致。而Hela细胞未扩增出特异性条带。序列分析结果显示,与GenBank公布的编号为NM006850的序列进行比对后发现有两处碱基的点突变,即223 bp处（G→A）伴随着氨基酸的改变（Ala→Thr）和370 bp处（T→C）伴随着氨基酸的改变（Tyr→His）。②成功构建人白介素24真核表达载体pcDNA3.1（+）-hlL-24。③蛋白印迹实验发现, CaSki细胞的培养上清和细胞裂解液中都不能检测到IL-24蛋白,而转染pcDNA3.1（+）-hlL-24真核表达质粒的CaSki细胞的培养上清和细胞裂解液中都能检测到IL-24蛋白。2.转染pcDNA3.1（+）-hIL-24的CaSki细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平明显下降,抑癌蛋白P53水平明显增加,细胞凋亡率明显升高。3.①迁移和侵袭实验中转染pcDNA3.1（+）-hIL-24的CaSki细胞穿过Transwell小室膜的细胞数明显减少。②Western blot结果显示转染pcDNA3.1（+）-hIL-24的CaSki细胞中MMP-2水平下降, p38 MAPK和E-cadherin水平升高。4.共转染pcDNA3.1（+）-hIL-24和pGensil-CH1组与单独转染组CaSki细胞相比,HPV E6癌基因的mRNA水平明显下降,抑癌蛋白P53水平明显增加,细胞凋亡率明显升高。5.裸鼠成瘤实验发现,稳定转染pcDNA3.1（+）-hIL-24后的CaSki细胞成瘤能力明显降低;对荷瘤裸鼠瘤内注射pcDNA3.1（+）-hIL-24质粒进行基因治疗后,肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与重量明显低于对照组。病理检查发现,处理组肿瘤生长不佳,细胞分裂相少见,组织内有较多坏死区域。结论:1.蛋白印迹实验发现, CaSki细胞的培养上清和细胞裂解液中都不能检测到IL-24蛋白,说明可能存在转录后调控,使IL-24 mRNA不能被翻译成蛋白质。而转染pcDNA3.1（+）-hlL-24真核表达质粒的CaSki细胞的培养上清和细胞裂解液中都能检测到IL-24蛋白,说明构建的pcDNA3.1（+）-hlL-24真核表达质粒能在CaSki细胞内成功表达分泌型的IL-24蛋白,且表达的蛋白具有免疫原性。2.实验组CaSki细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平明显下降,抑癌蛋白P53水平显着增加,促进宫颈癌CaSki细胞凋亡。以上结果表明以真核表达载体介导的hIL-24基因在体外能显着促进宫颈癌CaSki细胞的凋亡。3.转染pcDNA3.1（+）-hIL-24的CaSki细胞迁移和侵袭能力均下降,与MMP-2水平下降, E-cadherin水平升高相关。4.用HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因联合诱导人宫颈癌CaSki细胞的凋亡。本实验RT-PCR结果表明两者两者单独使用时均能抑制E6癌基因的表达,联合时则抑制效应增强;Western blot结果显示两者单独使用时,通过抑制E6癌基因的表达或其他一些途径,均能使P53蛋白水平得到恢复,联合时则效应增强;流式结果显示两者联合使用时具有协同效应,能显着提高肿瘤细胞凋亡率。5.稳定转染pcDNA3.1（+）-hIL-24后的CaSki细胞成瘤能力明显降低;重组质粒pcDNA3.1（+）-hIL-24对荷瘤裸鼠有一定治疗作用。
王晓春[8]（2007）在《靶向HPV16 E6的siRNA治疗宫颈癌的实验研究》文中研究说明目的本研究拟探讨应用免疫组化检测宫颈癌组织中的HPV16-E6的表达在宫颈癌的早期诊断中的临床应用价值；进一步应用RNA干扰技术为手段，以HPV编码的癌蛋白E6为靶标，探讨靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌细胞的生物学行为的影响，从而为HPV16-E6这一重要的致瘤蛋白的功能研究开辟了一个新的途径，为HPV16-E6阳性肿瘤的靶向基因治疗提供了新的理论和实验依据；为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法收集宫颈癌组织病理切片应用免疫组化检测宫颈癌组织中的HPV16-E6的表达；构建靶向HPV16-E6的siRNA表达载体，应用体外转染试剂转染HPV16-E6阳性的宫颈癌CaSki细胞，分别应用western blotting和RT-PCR检测CaSki细胞中E6蛋白质和mRNA的表达；应用MTT分析检测细胞的增殖活性，应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。进一步应用western blotting、细胞色素c检测以及caspase活性分析等检测细胞凋亡相关分子的表达和活性，研究靶向HPV16-E6的siRNA诱导细胞凋亡的分子机制。进一步建立宫颈癌裸鼠移植瘤模型，应用靶向HPV16-E6的siRNA进行瘤体内多点注射，观察靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌裸鼠移植瘤的影响。结果宫颈癌组织病理切片免疫组化检测结果显示：在慢性炎症HPV16-E6阳性率为8％，CINs中HPV16-E6阳性率为22.7％，宫颈癌组织中HPV16-E6阳性率为55.9％。在宫颈癌中，Ⅰ期HPV16-E6阳性率为44.4％，Ⅱ期HPV16-E6阳性率为55.6％，Ⅲ期HPV16-E6阳性率为80％。western blotting和RT-PCR检测结果显示瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，CaSki细胞中E6蛋白质和mRNA的表达下调；MTT分析结果表明瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞的增殖活性被抑制；流式细胞术检测结果表明，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞周期被阻滞于G1／S期，同时细胞凋亡增加；进一步应用western blotting检测抑凋亡蛋白Bc1-2的表达显示，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，Bc1-2的表达下调；细胞色素c释放实验结果显示，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞色素c自线粒体中释放到细胞浆中，从而诱导细胞凋亡；Caspase活性分析结果亦表明，瞬时转染靶向HPV16-E6的siRNA表达载体后，细胞内Caspase3、Caspase8、Caspase9均被激活。在体内实验亦表明，靶向HPV16-E6的siRNA能够显着抑制裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。结论HPV16-E6的表达与宫颈癌的发生发展密切相关，随着病情恶化，HPV16-E6的阳性率逐渐增加。应用免疫组化检测宫颈癌组织中的HPV16-E6的表达有助于宫颈癌的早期诊断。在宫颈癌细胞CaSki中，靶向HPV16-E6的siRNA能够有效抑制细胞增殖，诱导细胞周期阻滞于G0／G1期，并诱导细胞凋亡。靶向HPV16-E6的siRNA诱导细胞凋亡的可能机制为：靶向HPV16-E6的siRNA抑制HPV16-E6的表达后，使凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达下调；并改变线粒体膜的通透性，诱导细胞色素C的释放，介导细胞凋亡。并进一步证明抑制HPV16-E6可活化Caspase-3，-8和-9，并且Caspase-3和-9活性升高比Caspase-8更明显。表明在宫颈癌细胞CaSki中，靶向HPV16-E6的siRNA不仅能够介导细胞凋亡的线粒体通路的活化，而且能够活化细胞凋亡的死亡受体通路，但以线粒体通路的活化为主。在宫颈癌裸鼠移植瘤模型中，靶向HPV16-E6的siRNA能够显着抑制裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，我们认为HPV编码的癌蛋白E6可能为靶向基因治疗的潜在关键分子靶标；靶向HPV16-E6的siRNA能够抑制宫颈癌细胞增殖诱导细胞凋亡，从而为HPV16-E6这一重要的致瘤蛋白的功能研究开辟了一个新的途径，为HPV16-E6阳性肿瘤的靶向基因治疗提供了新的实验依据；为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新方法。
薛敏[9]（2007）在《HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响》文中研究指明目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞生长增殖、凋亡及化疗药物敏感性的影响。方法：第一部分：通过脂质体法将HPV16E6基因稳定转染宫颈癌C33A细胞，RT-PCR及Western blotting分别检测转染细胞中HPV16E6mRNA和蛋白表达水平，MTT比色法及流式细胞仪检测HPV16E6基因转染对C33A细胞生长增殖与细胞周期的影响。第二部分：应用MTT比色法检测DDP、BLM、VCR、DDP+BLM+VCR对宫颈癌细胞生长增殖的影响；AO／EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC／PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况；Western blotting检测不同浓度化疗药物DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响：RT-PCR检测不同浓度DDP干预对各组宫颈癌细胞HPV16E6基因mRNA表达水平的影响。结果：第一部分：通过稳定转染获得了稳定表达pcDNA3-HPV16E6质粒的C33A细胞克隆（C33A-E6细胞）及稳定复制空载体质粒的细胞克隆（C33A-P细胞）。转染HPV16E6基因的C33A细胞的生长速度比空白对照组和C33A组明显加快（P＜0.05）。HPV16E6对C33A细胞生长增殖有促进作用。在转染了HPV16E6基因的C33A细胞中，其DNA合成前期G1和静止期G0（G0／G1期）细胞百分率（39.27％）明显低于空载体转染组（53.73％）和未处理的C33A细胞（55.38％）（P＜0.01）；而处于S期细胞的百分率（38.83％）、DNA合成后期G2及分裂期M的细胞百分率（G2／M：21.9％），均明显高于空载体转染组（S：29.36％；G2／M：16.91％）和C33A组（S：28.04％：G2／M：16.58％）（P＜0.01）。空载体转染组和未转染组细胞周期的各期分布无明显差异（P＞0.05）。第二部分：MTT结果显示，在相同作用时间，四组细胞均随着化疗药物浓度增大，细胞存活率逐渐下降，以10倍、5倍血药峰值浓度干预的各组细胞生长抑制最明显。10％、50％PPC及DMSO干预组细胞存活率均无显着性差异。200％、100％PPC干预组存活率明显低于10％与DMSO组。联合用药的细胞存活率显着低于单药干预组，而在DDP、BLM、VCR单药干预的各组细胞中，较多数据显示DDP干预组细胞的存活率明显低于BLM和VCR干预组，而BLM和VCR干预组之间无显着差异。在相同作用时间和相同剂量药物干预时，C33A-E6组细胞的存活率略高于C33A和C33A-P组，但仅少部分有统计学差异；C33A-E6与CaSki细胞比较存活率亦无统计学差异（P＞0.05），AO／EB染色和流式细胞术检测的C33A、C33A-E6、C33A-P、CaSki细胞随着DDP干预浓度的改变而凋亡率亦不同，80umol／L、8umol／L及0.8umol／L的DDP干预后各株细胞凋亡率均有显着性差异（P＜0.01），随着DDP剂量的增大，凋亡率亦明显增加。对于不同时间段比较，大剂量DDP即80umol／L干预组与DMSO干预组中各株细胞的24hr、48hr及72hr的凋亡率无明显改变；小剂量即0.8umol／L组凋亡率在干预48hr后至72hr凋亡率明显增加（P＜0.01）；中剂量即8umol／L组凋亡率在干预48hr即显着增加，但持续至72hr时后未明显增高；0.8umol／L组与DMSO组凋亡率无显着性差异。Western Blotting验证结果显示：C33A-E6和CaSki细胞中均能检测到HPV16E6蛋白的表达，但表达较弱，且随着化疗药干预剂量的增大及作用时间的延长，两组细胞总蛋白中HPV16E6的表达量均逐渐降低甚至难以检测到表达，而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；C33A和C33A-P细胞中均未检测到HPV16E6蛋白的表达。C33A-E6、C33A和C33A-P三组细胞中均检测到p53mt的表达，但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长，三组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变（P＞0.05）。通过RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A、C33A-E6、C33A—P和CaSki四组细胞24hr、48hr后HPV16E6基因mRNA表达的变化，在未予DDP干预的情况下，C33A-E6与CaSki细胞在24hr时HPV16E6 mRNA的表达量无差异，而在48hr时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显着高于CaSki细胞（P＜0.05），且两组细胞48hr的HPV16E6 mRNA表达均较24hr显着增高（P＜0.05）；在24hr和48hr两时间段内，随着DDP干预浓度的增加，两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少（P＜0.01）；但在同样浓度的DDP干预时，C33A-E6与CaSki的HPV16E6 mRNA表达量无显着性差异（P＞0.05）。结论：HPV16E6基因具有促进宫颈癌细胞生长增殖及凋亡的双重作用，p53mt对C33A细胞的生长增殖及对化疗药物的敏感性无明显影响，HPV16E6基因与p53mt对宫颈癌C33A细胞无协同促进增殖和凋亡的作用。HPVE6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的活性状态(p53mt／p53wt)无明显关系。HPV16E6基因可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。
成海恩[10]（2006）在《RNAi沉默人宫颈癌CaSki细胞HPV-16 E6基因表达的研究》文中研究指明子宫颈癌（cervical cancer, CC）是危害广大妇女健康最常见的恶性肿瘤之一,研究表明,人乳头瘤病毒（human papillomaviruses,HPV）的E6、E7癌基因在宫颈癌的发生发展过程中起着重要作用。E6癌基因编码合成的E6蛋白可以与细胞内野生型抑癌基因产物P53蛋白相结合,在E6相关蛋白的作用下使P53经泛素介导的途径降解,从而使P53抑制细胞生长及促进凋亡的作用丧失,使细胞中DNA损伤累积,从而诱导宫颈组织癌变;E7与pRb相结合使其磷酸化并释放E2F转录因子,E2F激活基因的转录,转录由G1期进入S期所需的基因,导致细胞周期调控失控,从而使细胞发生永生化。因此,E6基因是宫颈癌基因治疗的理想靶基因之一。RNA干扰是近年来发现的一种转录后基因表达调控的方式,是生物进化中的一种保守行为,具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定性等作用。由于RNAi能在哺乳动物细胞中敲低多种基因的表达,为肿瘤的基因治疗开辟了一条新的途径。研究表明,利用RNAi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持沉默状态,有望达到抗肿瘤的效果。本课题采用RNA干扰技术,以HPV-16的E6基因为作用靶点,探讨抑制人宫颈癌CaSki细胞中HPV-16 E6基因表达对于宫颈癌CaSki细胞的生长抑制作用以及对于裸鼠移植瘤成瘤的影响,并用表达HPV-16
二、抗HPV16E6核酶增加宫颈癌CaSKi细胞对顺铂敏感性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗HPV16E6核酶增加宫颈癌CaSKi细胞对顺铂敏感性的研究（论文提纲范文）
（1）抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性影响和机制的探讨（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 转染CaSki细胞 |
| 1.3 Northern blot |
| 1.4 MTT敏感试验检测药物敏感性 |
| 1.5 Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率 |
| 1.6 流式细胞术检测3种细胞中c-myc、Bcl-2、p53和Bax蛋白的表达 |
| 1.7 RT-PCR扩增法检测凋亡相关基因 |
| 1.8 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗HPV16E6-Ribozyme在CaSki-R细胞中的稳定表达 |
| 2.2 3种细胞HPV16E6 RNA表达水平变化 |
| 2.3 不同浓度的DDP对3种细胞增殖的影响 |
| 2.4 3种细胞对DDP作用24 h后所致凋亡率的变化 |
| 2.5 DDP作用24 h后3种细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 2.6 DDP作用24 h后3种细胞凋亡相关基因的表达 |
| 3 讨论 |
（3）survivin基因RNA干涉对宫颈癌裸鼠移植瘤生长及凋亡和顺铂化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 1.细胞系: |
| 2.实验动物来源和饲养条件: |
| 3.主要试剂: |
| 二、方法 |
| 1.人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立: |
| 2.Survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响: |
| 3.免疫组化SP方法检测各组移植瘤组织中survivin蛋白表达情况: |
| 4.TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡: |
| 5.survivin基因RNAi对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤顺铂化疗敏感性的影响: |
| 6.染色结果判定: |
| 三、统计学分析 |
| 结 果 |
| 1.survivin RNAi抑制人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长: |
| 2.各组肿瘤组织survivin蛋白表达: |
| 3.各组肿瘤TUNEL检测结果: |
| 4.顺铂化疗对各组裸鼠移植瘤的生长抑制: |
| 5.顺铂化疗对各组移植瘤凋亡影响: |
| 讨 论 |
（4）靶向HPV的siRNAs技术治疗宫颈癌研究的现状与挑战（论文提纲范文）
| 1 靶向HPV治疗宫颈癌的现状 |
| 1.1 HPV是宫颈癌及癌前病变常规筛查的指标 |
| 1.2 HPV疫苗的研究现状 |
| 1.3 反义核酸技术 |
| 2 抗HPV的RNAi技术 |
| 2.1 RNA干扰技术的研究现状 |
| 2.2 靶向HPV的RNAi技术在子宫颈癌中的研究现状 |
| 2.3 应用RNAi技术作为开发抗HPV核酸药物的优势 |
| 3 靶向HPV在子宫颈癌治疗中的挑战与展望 |
（5）逆转录病毒介导的HPV16E6-siRNA对SiHa细胞的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）Survivin基因RNAi对宫颈癌凋亡及放、化疗敏感性影响的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 |
| 1 Survivin 基因shRNA 真核表达载体的构建及其对宫颈癌HeLa 细胞survivin 表达的影响 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 Survivin 基因 RNAi 对宫颈癌 HeLa 细胞增殖、凋亡及放、化疗敏感性的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 Survivin 基因 RNAi 对宫颈癌 HeLa 细胞裸鼠成瘤、移植瘤生长及其放、化疗敏感性的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）人白介素24基因治疗宫颈癌CaSki细胞株的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HIL-24 基因的克隆鉴定，构建真核表达载体及表达鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 外源性 HIL-24 的表达对 CASKI 细胞凋亡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 外源性 HIL-24 的表达对 CASKI 细胞侵袭和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 HIL-24 基因与HPV-16 E6 SIRNA 联合诱导人宫颈癌CASKI 细胞的凋亡 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 HIL-24 基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 1 全文小结 |
| 2 本文创新之处 |
| 3 本实验不足之处 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（8）靶向HPV16 E6的siRNA治疗宫颈癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写注解 |
| 前言 |
| 第一章 宫颈组织临床样本HPV16 E6的阳性率检测 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 免疫组化SP法初步检测宫颈癌组织中HPV16-E6的表达 |
| 1.3.2 宫颈组织临床样本HPV16 E6的阳性率检测 |
| 1.4 分析与讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 靶向HPV16 E6的siRNA对宫颈癌细胞的影响 |
| 实验流程图 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 siRNA抑制宫颈癌CaSki细胞中HPV16-E6的表达 |
| 2.3.2 siRNA抑制宫颈癌CaSki细胞增殖 |
| 2.3.3 siRNA抑制宫颈癌CaSki细胞的细胞周期行进 |
| 2.3.4 HPV16-E6 siRNA诱导CaSki细胞凋亡 |
| 2.3.5 HPV16-E6 siRNA抑制Bcl-2的表达 |
| 2.3.6 HPV16-E6 siRNA诱导细胞色素C的释放 |
| 2.3.7 HPV16-E6 siRNA诱导宫颈癌细胞中Caspase的活化 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 靶向HPV16 E6的siRNA对宫颈癌肿瘤生长的影响 |
| 实验流程图 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HPV16-E6 siRNA抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 结论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的主要研究成果 |
（9）HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第一部分 HPV16E6转染对宫颈癌C33A细胞生物学功能的影响 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 真核表达质粒载体 |
| 1.3 试剂 |
| 1.3.1 酶类 |
| 1.3.2 试剂盒 |
| 1.3.3 细胞培养与转染用试剂 |
| 1.3.4 抗体 |
| 1.3.5 PCR引物和Marker |
| 1.3.6 其它生化试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养:细胞的传代、冻存与复苏 |
| 2.2 pcDNA3/HPV16E6、pcDNA3稳定转染(脂质体法)宫颈癌C33A细胞 |
| 2.3 细胞总RNA的抽提、纯化和检测 |
| 2.3.1 抽提RNA过程中相关试剂与器皿的处理 |
| 2.3.2 培养细胞总RNA的抽提 |
| 2.3.3 细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.4 差异RT-PCR检测转染细胞中HPV16E6mRNA水平 |
| 2.4.1 消化RNA中的痕量基因组DNA |
| 2.4.2 逆转录(RNA→cDNA) |
| 2.4.3 聚合酶链式反应PCR |
| 2.4.4 PCR产物电泳(步骤同琼脂糖凝胶电泳) |
| 2.4.5 反应条件的确定 |
| 2.4.6 半定量分析 |
| 2.5 Western blotting检测转染细胞中HPV16E6蛋白表达水平 |
| 2.5.1 制备用于Western blotting的蛋白质 |
| 2.5.2 Western Blotting检测HPV16E6蛋白的表达 |
| 2.6 HPV16E6基因转染对C33A细胞生物学功能的影响 |
| 2.6.1 转染细胞生长曲线的绘制 |
| 2.6.2 MTT比色法检测HPV16E6转染对C33A细胞生长增殖的影响 |
| 2.6.3 流式细胞仪检测HPV16E6对C33A细胞周期的影响 |
| 2.7 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 HPV16E6基因重组体的脂质体转染和克隆筛选鉴定 |
| 2.1.1 细胞总RNA的抽提 |
| 2.1.2 消化RNA中痕量基因组DNA后的RNA质量验证 |
| 2.1.3 RT-PCR检测细胞HPV16E6mRNA表达水平 |
| 2.1.4 Western blotting检测转染细胞HPV16E6和p53~(?)蛋白的表达 |
| 2.2 HPV16E6基因转染对C33A细胞生物学功能的影响 |
| 2.2.1 转染细胞生长曲线的绘制 |
| 2.2.2 HPV16E6转染对C33A细胞生长增殖的影响 |
| 2.2.3 HPV16E6基因转染对C33A细胞周期的影响 |
| 第二部分 HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响及可能的机制 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 化疗药物 |
| 2.1.4 PCR引物和Marker |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养:细胞的传代、冻存与复苏 |
| 2.2.2 MTT比色法检测化疗药物对宫颈癌细胞增殖或生长抑制的影响 |
| 2.2.3 凋亡试验:吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法检测各组细胞经化疗药物干预后的凋亡情况 |
| 2.2.4 Annexine V-FITC/PI双色荧光流式细胞仪检测各化疗药物对C33A-E6、C33A、C33A-P、CaSki细胞凋亡的影响 |
| 2.2.5 制备用于Western blotting的蛋白质 |
| 2.2.6 Western Blotting检测化疗药物作用后HPV16E6和p53蛋白水平变化 |
| 2.2.7 抽提RNA过程中相关试剂与器皿的处理 |
| 2.2.8 培养细胞RNA的抽提 |
| 2.2.9 差异RT-PCR |
| 2.3 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 E6基因和不同化疗药物干预对不同p53表型的宫颈癌细胞生长增殖的影响 |
| 3.2 化疗药物干预对各株细胞凋亡的影响 |
| 3.2.1 AO/EB染色结合荧光显微镜技术鉴定细胞凋亡情况 |
| 3.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 |
| 3.3 Western blotting检测不同浓度DDP对HPV16E6和p53~(?)蛋白表达的影响 |
| 3.3.1 各组细胞蛋白浓度测定标准曲线的建立 |
| 3.3.2 各组细胞总蛋白浓度测定结果 |
| 3.3.3 Western blotting检测不同浓度DDP对各株细胞HPV16E6和p53~(?)蛋白表达的影响 |
| 3.4 RT-PCR检测不同浓度DDP对各株细胞HPV16E6基因mRNA表达水平的影响 |
| 3.4.1 细胞总RNA抽提的质量 |
| 3.4.2 消化RNA中痕量基因组DNA后的RNA质量验证 |
| 3.4.3 RT-PCR检测不同浓度DDP对各株细胞中HPV16E6mRNA表达水平的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 HPVE6与p53的结构和功能 |
| 4.2 HPV16E6基因在不同p53活性状态下对宫颈癌细胞生长增殖和凋亡的影响 |
| 4.3 化疗药物对宫颈癌细胞HPV16E6和p53~(?)表达的影响 |
| 4.4 HPV16E6影响宫颈癌细胞增殖与凋亡的途径及机制探讨 |
| 4.5 HPV16E6在不同p53活性状态下对宫颈癌细胞化疗敏感性的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果目录 |
（10）RNAi沉默人宫颈癌CaSki细胞HPV-16 E6基因表达的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：RNAi 沉默人宫颈癌CaSki 细胞中HPV-16 E6 基因表达的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 HPV-16 E6 siRNA 真核表达质粒对CaSki 细胞中E6 基因表达的抑制 |
| 一、 材料与方法 |
| 二、 实验结果 |
| 三、 讨论 |
| 四、 参考文献 |
| 第二部分 RNAi 抑制E6 基因的表达对CaSki 细胞生物学特性的影响 |
| 一、 材料与方法 |
| 二、 实验结果 |
| 三、 讨论 |
| 四、 参考文献 |
| 第三部分 沉默HPV-16 E6 基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用 |
| 一、 材料与方法 |
| 二、 实验结果 |
| 三、 讨论 |
| 四、 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 宫颈癌的基因治疗 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
四、抗HPV16E6核酶增加宫颈癌CaSKi细胞对顺铂敏感性的研究（论文参考文献）
- [1]抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性影响和机制的探讨[J]. 饶智国,高建飞,章必成,杨波,张积仁. 中华肿瘤防治杂志, 2011(11)
- [2]特异性核酶增强宫颈癌细胞对多种化疗药物的敏感度研究[J]. 饶智国,高建飞,章必成,张积仁. 肿瘤防治研究, 2011(05)
- [3]survivin基因RNA干涉对宫颈癌裸鼠移植瘤生长及凋亡和顺铂化疗敏感性的影响[J]. 宋晖,辛晓燕,赵海波,王德堂,张建芳. 中华临床医师杂志(电子版), 2010(09)
- [4]靶向HPV的siRNAs技术治疗宫颈癌研究的现状与挑战[J]. 吴圆圆,陈莉. 南通大学学报(医学版), 2010(04)
- [5]逆转录病毒介导的HPV16E6-siRNA对SiHa细胞的影响[D]. 葛翠翠. 青岛大学, 2009(11)
- [6]Survivin基因RNAi对宫颈癌凋亡及放、化疗敏感性影响的实验研究[D]. 宋晖. 第四军医大学, 2007(04)
- [7]人白介素24基因治疗宫颈癌CaSki细胞株的实验研究[D]. 石华. 重庆医科大学, 2007(02)
- [8]靶向HPV16 E6的siRNA治疗宫颈癌的实验研究[D]. 王晓春. 中南大学, 2007(01)
- [9]HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响[D]. 薛敏. 中南大学, 2007(01)
- [10]RNAi沉默人宫颈癌CaSki细胞HPV-16 E6基因表达的研究[D]. 成海恩. 重庆医科大学, 2006(01)